小麦脱水素基因WZY2的克隆及其序列分析

【目的】对小麦类脱水素基因进行克隆与分析,为深入研究植物脱水素的结构及其在耐旱中的可能功能提供理论依据。【方法】利用PEG胁迫处理小麦幼苗,采用RACE方法,从干旱诱导的郑引1号小麦中获得脱水素基因,采用生物信息学方法对该基因进行耐旱功能分析。【结果】获得了小麦脱水素基因新成员WZY2的全长序列,其长度为849 bp,含1个459 bp的开放阅读框,编码152个氨基酸。该氨基酸序列具有明显的脱水素类蛋白特征(K片段),由2个K片段、1个S片段和1个Y片段组成,属于YSK2型脱水素。该脱水素具有较高的亲水性,表明该蛋白在束缚自由水、稳定膜结构方面有一定作用。【结论】从水分胁迫的郑引1号小麦中克隆的脱水素基因WZY2属于YSK2型脱水素。     

AtPIP5K2基因参与拟南芥盐胁迫的调节过程

植物在长期进化过程中演化出不同机制来适应环境中的各种胁迫,如盐碱、干旱等.该研究从拟南芥T-DNA插入突变体库中筛选到一个对盐反应不敏感的突变株系eto(enhanced tolerance to osmotic stress),种子萌发和幼苗生长试验表明eto突变株系早期生长发育对盐胁迫不敏感.TAIL-PCR分析表明eto突变株系中T DNA插入在拟南芥1号染色体上(BAC F3M18的27502位置),位于拟南芥At1g77740基因起始密码子前487 bp处,该基因编码磷脂酰肌醇-4-磷酸 -5-激酶(AtPIP5K2),共分离分析表明T-DNA插入与盐不敏感性紧密连锁.以野生型拟南芥总RNA为模板,克隆拟南芥AtPIP5K2基因cDNA,其开放读码框为2 265bp,编码755个氨基酸.与已报道物种PIPKs基因氨基酸序列比较分析表明,AtPIP5K2与植物PIPKs基因氨基酸相似性高达62%～75%,但与其他生物物种PIPKs基因之间的氨基酸相似性仅为33%～37%;AtPIP5K2推导的氨基酸序列中含有植物PIPKs基因所具有的高度保守区域“PIPKc"、“MORN repeat".进一步分析表明AtPIP5K2基因在拟南芥根及莲座叶片中表达量较强,并且由于T-DNA的插入,使eto突变株系与野生型相比,其AtPIP5K2基因过量表达,表明AtPIP5K2基因编码的产物可能参与调节拟南芥适应盐胁迫的调节反应.      

翅碱蓬脱水素基因克隆及表达载体构建

【目的】克隆翅碱蓬脱水素蛋白基因并构建其植物表达载体,为其耐盐性研究奠定基础。【方法】提取翅碱蓬总RNA,通过同源克隆和RACE方法分离获得翅碱蓬脱水素蛋白基因,并构建该基因的植物表达载体pBI121-DHN。【结果】克隆获得翅碱蓬脱水素蛋白基因的全长cDNA为847 bp（GenBank序列编号：KC013239）,命名为SsDHN。序列分析结果表明,SsDHN全长cDNA中5'-UTR 为61 bp, ORF为678 bp,3'-UTR为108 bp且包含29 bp的poly（A）尾巴,其起始密码子ATG位于62 bp处,终止密码子TAA位于737 bp处,编码225个氨基酸。氨基酸比对结果表明,该基因推导的氨基酸与已知其他植物DHN基因序列有35%~48%的相似性。聚类分析结果显示,翅碱蓬（SsDHN）与拟南芥和荠菜DHN亲缘关系较近,与咖啡、杜鹃花的亲缘关系较远。【结论】成功克隆了翅碱蓬脱水素基因,并构建了其表达载体,可用于翅碱蓬抗盐的遗传改良。     

翅碱蓬脱水素基因克隆及表达载体构建

【目的】克隆翅碱蓬脱水素蛋白基因并构建其植物表达载体,为其耐盐性研究奠定基础。【方法】提取翅碱蓬总RNA,通过同源克隆和RACE方法分离获得翅碱蓬脱水素蛋白基因,并构建该基因的植物表达载体pBI121-DHN。【结果】克隆获得翅碱蓬脱水素蛋白基因的全长cDNA为847bp（GenBank序列编号：KC013239）,命名为SsDHN。序列分析结果表明,SsDHN全长cDNA中5＇-UTR为61bp,ORF为678bp,3＇-UTR为108bp且包含29bp的poly（A）尾巴,其起始密码子ATG位于62bp处,终止密码子TAA位于737bp处,编码225个氨基酸。氨基酸比对结果表明,该基因推导的氨基酸与已知其他植物DHN基因序列有35%～48%的相似性。聚类分析结果显示,翅碱蓬（SsDHN）与拟南芥和荠菜DHN亲缘关系较近,与咖啡、杜鹃花的亲缘关系较远。【结论】成功克隆了翅碱蓬脱水素基因,并构建了其表达载体,可用于翅碱蓬抗盐的遗传改良。     

多枝赖草谷胱甘肽还原酶基因的克隆及分析

以盐胁迫处理的多枝赖草(Leymus multicaulis)植株新鲜叶片为材料,根据其他植物谷胱甘肽还原酶(GR)氨基酸保守区序列设计简并引物,通过RT—PCR扩增到1个408 bp的cDNA片段(Genbank注册号为 AY781786);利用DNAMAN软件将5’和3’RACE获得的5’和3’端序列,拼接成1个全长1 580 bp的cDNA序列,其包含1个1 140 bp的开放阅读框架,该阅读框架编码380个氨基酸;多枝赖草谷胱甘肽还原酶氨基酸序列与其他植物的同源性为77％～92％,定量PCR结果表明,GR基因的表达随着盐胁迫时间和盐浓度的增加而加强。     

梅花PmERF4基因的克隆及其表达分析

为阐明梅花(Prunus mume)ERF基因的功能,采用RT-PCR技术从梅花品种‘雪梅’中克隆获得1个PmERF4基因。生物信息学分析表明该基因cDNA全长序列为842 bp,完整开放阅读框(ORF)为690 bp,编码229个氨基酸。氨基酸序列比对发现,PmERF4蛋白包含1个AP2/ERF保守结构域。系统进化分析结果显示,梅花PmERF4蛋白与李亚科李属植物的ERF蛋白高度同源。利用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测PmERF4基因在非生物胁迫和激素处理下的表达,结果表明:PmERF4基因受低温、氧化胁迫的诱导,但响应程度不同,它能够持续且强烈地响应低温胁迫,对甘露醇、MeJA、SA处理不敏感,而高盐和ABA则抑制其表达;PmERF4基因可能在梅花低温胁迫应答中发挥重要作用。     

牡丹PsDHN1基因克隆及转基因拟南芥的耐涝性分析

在前期研究的基础上,从牡丹叶片中获得了脱水素基因PsDHN1的中间序列,利用cDNA末端快速扩增(rapid-amplification of cDNA ends, RACE)技术克隆获得了该基因的全长序列。通过生物信息学分析及转化拟南芥进行功能验证,探讨牡丹脱水素基因PsDHN1的特性及其响应涝害胁迫的功能。生物信息学分析结果表明:PsDHN1基因全长cDNA为864 bp,包括471 bp的开放阅读框,104 bp的5′非编码区和289 bp的3′非编码区。PsDHN1蛋白含有156个氨基酸,其分子质量为16.39 kDa,理论等电点为8.87,亲水性指数为-1.274,为亲水性蛋白,不稳定性指数为44.05,为不稳定性蛋白。PsDHN1蛋白包含3个α-螺旋和1个β-折叠,以及2个Y片段、1个S片段和2个K片段,属于典型的Y_2SK_2型脱水素。牡丹的PsDHN1蛋白与其他9个物种有一定的同源性,其中与苦瓜、麻风树和胡桃DHN1蛋白的相似度分别达到了58%、54%和53%。亚细胞定位结果表明,PsDHN1主要定位于细胞核和细胞膜上。耐涝性试验结果显示:从表型上看,转PsDHN1基因的拟南芥植株耐涝能力及恢复生长的情况均优于野生型植株;涝害相关的酶如蔗糖合成酶、丙酮酸脱羧酶、α-淀粉酶活性及可溶性蛋白含量均为转基因拟南芥总体高于野生型植株。该研究结果为牡丹耐涝基因的挖掘和进一步研究牡丹耐涝的分子机制提供了理论依据。     

黄瓜6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因cDNA片段的克隆及表达分析

以黄瓜品种露丰为材料,根据已报道的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(6PGDH)的保守氨基酸序列设计简并引物,利用RT-PCR技术获得黄瓜6PGDH的cDNA同源片段,命名为CSPG(登录号为EU815934)。该片段长度为1 207 bp,包含一个936 bp的开放阅读框(编码311个氨基酸)和271 bp的Poly A 3′非翻译区末端,无内含子;该基因编码的氨基酸序列与拟南芥、大豆、水稻、玉米、菠菜的6PGDH基因有75%以上的同源性。运用半定量RT-PCR技术对6PGDH基因的转录水平进行分析,结果表明:该基因在叶、根、茎中均有表达,高温胁迫下的表达量高于常温对照,说明6PGDH基因与热胁迫相关。     

胡杨(Populus euphratica)盐相关基因的克隆

以2年生胡杨实生苗为研究材料，通过用119mmol／L的NaCl溶液浇灌处理1h，分别收集NaCl处理前后的细嫩白根设立对照样品与处理样品，分离rnRNA。用抑制性扣除杂交技术建立胡杨盐处理的cDNA扣除文库，并以cDNA阵列杂交技术用。。P标记探针进行杂交，共筛选672个有效克隆，从中确认3个探针进行了序列分析，其中1个为盐抑制表达基因片段，2个为盐诱导表达基因片段。分析表明，1个盐诱导表达基因片段为1含188氨基酸开放阅读框的EST，该EST具有1079个核苷酸。该结果与我们早先检测到的1个胡杨盐诱导表达蛋白大小相符。     

黄瓜硝酸还原酶cDNA片段的克隆及其在缺氮胁迫下的表达

以黄瓜叶片总RNA为模板,应用逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR),首次扩增出黄瓜硝酸还原酶(NR)cDNA部分片段。经过测序和同源性分析表明:该基因片段长度为395 bp,与GenBank上所登录的笋瓜NR基因同源性达89%,根据所测序列推导该片段由131个氨基酸残基组成。进一步检测其在缺氮胁迫下的活性和表达变化,结果表明缺氮胁迫下硝酸还原酶的活性和表达都明显下降,推测黄瓜NR在转录水平上调节其活性。     

胡杨膜系统的盐稳定性及盐胁迫下的代谢调节

比较胡杨和群众杨在盐分胁迫下的生化反应发现：（１）胡杨的细胞膜系统能忍耐２００ｍＭ ＮａＣｌ的高盐处理,其膜透性在高盐处理３ｄ没有显著增加,而群众杨的膜透性随盐分浓度的升高而升高。     

甜菜M14 品系BvM14-STPK 基因的生物信息学分析及 响应盐胁迫的表达分析

旨在进一步研究BvM14-STPK蛋白激酶对盐胁迫的应答反应。本研究以甜菜M14品系为材料，使用特异性引物通过聚合酶链式反应进行扩增，获得BvM14-STPK基因cDNA全长，并进行生物信息学分析，采用荧光定量PCR探究该基因响应盐胁迫的表达分析。生物信息学分析结果表明，BvM14-STPK基因cDNA全长1668 bp，包含1527 bp的最大ORF，编码508个氨基酸；BvM14-STPK蛋白激酶具有典型的蛋白激酶保守结构域。实时荧光定量PCR结果表明，BvM14-STPK基因在甜菜M14品系叶、根中均有广泛表达，叶中的表达量高于根中。该基因在200、400 mmol/L NaCl处理下，在叶片和根中呈现不同的表达状态，表明该基因可以应答盐胁迫，但在不同组织中应答盐胁迫的表达量存在差异。本项研究对挖掘甜菜M14品系优质基因和提高栽培甜菜抗逆性等方面具有重要指导意义，为后续进一步开展甜菜遗传改良工作奠定基础。     

胡杨PePEX11基因参与调节盐胁迫下拟南芥的抗氧化能力

目的长期非生物逆境胁迫下,植物会产生过量活性氧并造成氧化损伤,过氧化物酶体能够通过清除活性氧来调节氧化还原平衡。PEX基因参与过氧化物酶体的生物发生和增殖,PEX11基因的过表达可促进过氧化物酶体增殖,对植物的抗氧化能力的提升具有重要意义。胡杨是研究木本植物中抗逆机制优良材料,本文旨在探究胡杨PEX11基因对非生物胁迫的响应。方法本研究首先以胡杨叶片cDNA为模板克隆获得PEX11基因,命名为PePEX11,并对PePEX11蛋白进行生物信息学分析,其次采用实时荧光定量PCR分析PePEX11在胡杨中的表达模式,同时构建植物表达pCAMBIA1301-35S::PePEX11转化拟南芥,最后检测盐胁迫条件下转PePEX11拟南芥的抗氧化能力。结果PePEX11基因cDNA全长543 bp,编码180个氨基酸,PePEX11蛋白具有多个跨膜结构域,在膜上发挥作用。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在胡杨体的成熟叶中表达量最高,幼叶次之,茎中最少;胡杨PePEX11基因受盐胁迫上调表达。功能分析显示,在含有100 mmol/L NaCl的培养基上,转PePEX11基因拟南芥株系的根长均显著长于野生型;对盆土中的移栽后12 d的幼苗150 mmol/L NaCl盐处理2周,转基因株系表现为营养生长良好,耐盐性较强。超表达PePEX11基因能显著提高(P＜0.05)拟南芥多种抗氧化酶的活性。DAB组织染色结果表明,转基因株系叶片中H₂O₂的含量明显少于野生型。结论本研究从胡杨中克隆PePEX11基因,并证明PePEX11能够提高拟南芥在盐胁迫下的抗氧化能力,提升耐盐能力。      

2020-06ml 目录

目的异形叶性是植物为适应环境在同一植株上产生多种形态成熟叶片的现象。胡杨是典型的木本异形叶植物,前人研究发现,胡杨异形叶片间展现出不同的生理特性及环境适应性。本研究拟通过对胡杨异形叶差异表达miRNA及其靶基因功能的分析,揭示胡杨叶片形态及其生理变化的分子调控机制。方法以成年胡杨披针形叶和锯齿卵圆形叶为实验材料,通过高通量测序对其miRNA的表达模式及差异表达miRNA的靶基因功能进行比较研究。结果共获得6个高质量的sRNA文库,各文库有效序列占原始序列的56% ~ 81%。通过比对,共鉴定517个已知miRNA和127个新预测miRNA,主要长度分布区间为20 ~ 22 nt,其中的389个miRNA匹配至54个已知的miRNA家族。两种形态叶片共同检出的miRNA有369个,与披针形叶片相比,锯齿卵圆形叶中7个miRNA上调表达,15个下调表达。通过靶基因预测及功能分析,发现差异表达miRNA参与调控胡杨异形叶的抗逆相关途径,如对盐胁迫的响应,磷酸肌醇代谢,角质、软木脂和蜡的生物合成,碱基切除修复和RNA降解等代谢途径。利用实时荧光定量PCR验证了5个差异表达miRNA的表达趋势与高通量测序结果一致,通过PCR检测发现差异表达miRNA与其靶基因存在一定的负调控关系。结论胡杨异形叶中miRNA表达模式存在差异。其中,调控植物生长发育的保守的miR167、miR166及调控植物抗逆性的miR172在锯齿卵圆形叶中表达量上调,参与植物逆境响应的保守的miR169、miR396在锯齿卵圆形叶中下调表达,推测差异表达miRNA引起了异形叶间形态的差异,同时使锯齿卵圆形叶对不利环境具有较强的耐受性。这与我们前期有关胡杨异形叶形态与生理特性的研究结果相一致。      

辣椒推定WRKY基因cDNA的生物信息学分析

[研究目的]该研究在利用同源克隆法分离到一个推定的辣椒WRKY转录因子的基础上,采用多种生物信息学方法对该序列进行特征分析和功能预测,以获得该基因及其编码蛋白更多的功能提示.[主要方法]应用Blast、ORF Finder、Wolf Psort、DNAMAN等软件或数据库,进行序列的相似性比较,开放读码框预测、保守域和编码蛋白质的功能等分析.[研究结果]所得到的序列是WRKY基因家族中的一个全长cDNA序列,与其它植物具有较高的同源性,该基因编码的蛋白具有WRKY保守结构域和锌指结构特征,亚细胞定位预测结果显示该蛋白定位于细胞核,具有WRKY转录因子的三维结构特征.[结论]所获得序列为辣椒WRKY基因家族的新成员,具有WRKY转录因子家族的基本特征,进化上有高度保守性.可能在调控植物的生长发育以及干旱、高温、高盐等逆境应答过程中起重要调节作用.因此.这一辣椒WRKY新基因有进一步研究的价值.     

盐胁迫下胡杨的离子响应

分析土壤和植物组织中的各种离子关系,发现胡杨对盐分不是简单的抿吸机制;对根系环境中的ＮａＣｌ,胡杨吸收的钠离子显著少于不耐盐的杂种胡杨,而吸收的氯离子却大大超过后者,这与以往报道盐胁迫的胡杨根细胞中形成大量富含氯离子的小液泡是一致的,是一种特殊的区隔化构造,与杂种胡杨相比,胡杨有相对较发达的茎干组织,根和茎干占植株总生物量的比例较大,能吸收和储存有害盐离子而减少其进入叶组织,这是胡杨抗盐性的形态解     

白桦抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因克隆及表达分析

从白桦（Betula platyphylla Suk．）cDNA文库中获得一个抗坏血酸过氧化物酶（APX）基因全长cDNA序列,该序列去除polyA后长1049bp,其ORF全长750bp,编码250个氨基酸,编码蛋白的相对分子质量为27712．7,理论等电点6．08,保守区分析确定其含有APX蛋白保守序列,属于植物POD超家族。利用实时定量RT—PCR进一步分析白桦苗木在0．8％NaCl胁迫处理下不同时间点APX基因的表达情况。结果表明,盐胁迫处理诱导了APX基因在白桦叶片中的表达,说明APX基因与植物抗盐相关。     

小麦脱水素基因TaDHN-1的特征及其对非生物胁迫响应

【目的】分析小麦脱水素基因特征及其在干旱、高盐、低温和高温胁迫过程中的表达模式,探讨脱水素在小麦抗逆过程中的功能,为脱水素基因在小麦抗逆分子育种中的应用提供理论依据。【方法】利用RT-PCR克隆小麦脱水素基因,通过生物信息学分析研究其编码蛋白特征;采用qRT-PCR分析该基因表达特性模式。【结果】克隆了包含完整编码区的小麦脱水素基因TaDHN-1,序列分析显示该基因cDNA长487 bp,编码112个氨基酸,推测编码蛋白分子量约为11.5 kD,等电点为6.6。氨基酸序列分析表明,TaDHN-1在C端具有保守的K片段,属于Kn类脱水素;二级结构预测显示,该脱水素无规则卷曲占整个蛋白的82.1%,具有很高的亲水性;PredictProtein预测显示,该脱水素无跨膜区域,亚细胞定位于细胞质中。表达特性分析表明,TaDHN-1受植物激素ABA的诱导;在干旱、高盐和低温胁迫条件下,该基因均受胁迫的诱导而表达上调,但对42℃高温胁迫不敏感;在种子发育过程中,TaDHN-1的表达呈下调趋势,且在种子发育后期的表达量极低,推测TaDHN-1不参与小麦种子成熟后期的脱水保护过程。【结论】小麦脱水素基因TaDHN-1属于脱水素基因家族的Kn亚类。该基因通过依赖ABA的非生物胁迫响应路径发挥功能,可能参与了小麦对干旱、高盐和低温胁迫的耐受调节过程,但对高温胁迫不敏感,也未参与种子发育后期的脱水保护过程。     

盐胁迫下3种杨树的抗氧化能力与耐盐性研究

以抗盐性不同的胡杨、群众杨和I-214杨3种杨树为材料,对NaCl胁迫下叶片中的盐离子含量、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性以及丙二醛（MDA）含量和电解质外渗率的动态变化进行分析和对比,探讨3种杨树抗氧化能力的差异及其与抗盐性的关系．结果显示,在长期且不断提高的盐胁迫下,群众杨叶片中Na+、Cl－离子浓度不断升高,特别是在盐处理后的第28 d,叶片中的盐离子含量达到最高时,SOD和POD的活性大幅度下降,叶片中MDA的含量和电解质外渗率随之大幅度上升,叶片出现了严重的盐害症状．与群众杨相比,I-214杨叶片中Na＋、Cl－浓度也有相同的变化趋势,但其MDA和电解质外渗率增加幅度较小,盐害症状也较轻. 与前两种杨树明显不同,胡杨在轻度盐胁迫下（土壤NaCl浓度58.5 mmol/L）,叶片中SOD和POD的活性就显著上升,并且在盐胁迫期间,胡杨叶片中盐离子含量、MDA的含量和电解质外渗率都没有明显的变化．因此,在长期盐胁迫条件下,群众杨和I-214杨叶片中电解质外渗率的增加与盐离子的大量积累有关,而叶片电解质外渗主要是膜脂过氧化的结果．活性氧清除酶（SOD、POD）活性的下降,是导致这两种杨树膜脂过氧化和电解质外渗率增加的主要原因．而胡杨在盐胁迫初始阶段就能大幅度上调SOD、POD活性,以避免活性氧对膜的伤害．在长期不断提高的盐胁迫条件下,胡杨的排盐性强,降低了盐诱导的膜脂过氧化,最终减少了电解质外渗率,从而提高了抗盐性．      

甘蔗S-腺苷蛋氨酸脱羧酶基因Sc-SAMDC的克隆和表达分析

【目的】克隆甘蔗(Saccharum officinarum)S-腺苷蛋氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase,SAMDC)基因,并进行序列特征、原核表达和不同逆境胁迫下表达特性分析。【方法】通过对甘蔗茎全长cDNA文库测序和分析,获得SAMDC基因cDNA全长,命名为Sc-SAMDC,并进行序列分析。随后将编码S-腺苷蛋氨酸脱羧酶的cDNA片段克隆到原核表达载体pET29a(+)中,构建融合表达质粒,转化至Esherichia coli BL21(DE3)中进行表达。最后利用定量PCR技术分析甘蔗幼苗中该基因在不同外源胁迫下的表达特性。【结果】序列分析显示,甘蔗Sc-SAMDC基因(GenBank Accession number:GQ246459)cDNA全长1968bp,存在3个读码框(袖珍读码框tORF、上游读码框uORF和主读码框mORF),mORF长1200bp,编码399个氨基酸的SAMDC酶原,预测分子量为43.6kD,该酶原含有两个高度保守的功能结构域(酶原剪切位点和PEST结构域)。原核表达产物经SDS-PAGE表明,Sc-SAMDC以融合蛋白形式表达,相对分子量约为50kD。定量PCR分析表明,Sc-SAMDC基因在聚乙二醇(PEG)、NaCl、水杨酸(SA)和H2O2外源胁迫下表达特性不同,受PEG和NaCl的诱导,受SA和H2O2的抑制。【结论】本研究成功地克隆了Sc-SAMDC基因并在原核生物中进行了表达研究,分析了该基因的表达特性,为其进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。