沙地云杉ISSR-PCR反应体系的初步优化

以沙地云杉叶基因组DNA为材料,采用单因素试验方法对ISSR-PCR体系中的主要成分Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物浓度、退火温度进行筛选,建立并优化沙地ISSR-PCR反应体系。结果表明,UBC835是最适引物,适宜退火温度为50℃。沙地云杉ISSR-PCR分析的最适反应体系(20μL PCR反应体系)为:2.0 mmol/L Mg2+、1.0 U/μL Taq DNA聚合酶、0.25 mmol/L dNTPs、0.25μmol/L引物、50 ng/μL模板DNA。PCR扩增程序:94℃预变性4 min;94℃变性45 s,50℃退火45 s,72℃延伸2 min,40个循环;72℃延伸7 min,4℃保存。     

枣树基因组DNA提取及其RAPD体系优化

以不同生长期的枣和酸枣为研究对象,采用CTAB法提取枣基因组DNA;通过单因素5水平试验,筛选模板、Mg2+、Taq酶、dNTPs和随机引物的浓度及其用量,建立了枣和酸枣RAPD技术最优体系,即25μl反应体系中各组分含量为10×Taq Buffer+KCl 2.5μl;Taq DNA聚合酶0.04 U/μl;MgCl22.0 mmol/L;模板DNA2 ng/μl;引物0.3μmol/L;dNTP为0.2 mmol/L。适宜的扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃循环变性50 s,36℃退火50 s,72℃延伸1.5 min,38个循环;72℃延伸10 min。     

大蒜RAPD反应体系的建立及优化

该试验以弥渡紫皮大蒜叶片基因组DNA为试材,采用不同浓度MgCl2、引物、dNTP、TapDNA聚合酶对大蒜的RAPD体系进行单因素反应条件优化.结果表明,25μL总反应体积中,最佳浓度配比为模板DNA 40ng,MgCl2 2.0 mmol/L,引物12 pmol,dNTP 50μmol/L,Taq DNA聚合酶1 unit,10×反应缓冲液2.5μL.扩增程序为94℃变性3 min,94℃变性30 s,37℃退火30 s,72℃延伸1 min,共35个循环,72℃最终延伸10 min.     

黄皮RAPD-PCR反应体系的优化

以5′-GTCGTTCCTG-3′为随机引物,以酸黄皮为试材,对黄皮RAPD反应体系进行了优化研究,结果表明:20μL反应体系中,Taq DNA聚合酶、Mg2 、随机引物、模板DNA和dNTPs 5种主要成分的适宜浓度和用量分别为2.0 U、2.5 mmol/L、0.5 umol/L、50 ng、0.20 mmol/L。适宜的扩增程序为94℃预变性3 min,1个循环;94℃变性45 s,36℃退火45 s,72℃延伸1 min,38个循环;72℃后延伸7 min。     

黑木耳菌丝体DNA提取及RAPD扩增条件的优化

对黑木耳菌株基因组DNA进行RAPD-PCR反应体系及扩增程序优化.结果表明,采用CTAB法快速提取到较高质量黑木耳基因组总DNA用于RAPD-PCR扩增,确定黑木耳基因组DNA RAPD-PCR最适25μL反应体系为:模板DNA浓度15 ng/μL,Mg2 浓度2.0 mmol/L,Taq DNA聚合酶1 U,dNTP浓度150μmol/L,10碱基引物浓度10 pmol,10×缓冲液,其余用重蒸馏水补充.扩增程序为:预变性94℃5 min,变性94℃1 min,退火36℃1 min,延伸72℃1.5 min,共40个循环,72℃最终延伸7 min.     

大葱RAPD反应体系的优化

研究了大葱基因组DNA的提取方法,并对Mg2 浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Taq酶用量进行了优化,建立了RAPD最佳反应体系,即20μl反应体系中10×Buffer缓冲液2μl,Mg2 浓度2.5 mmol/L,dNTPs浓度0.22 mmol/L,引物浓度0.65μmol/L,Taq酶1 U(2.5 U/μl),模板DNA 60 ng,用灭菌超纯水补足20μl。扩增程序为:94℃预变性3 m in;94℃变性40 s,38℃退火45 s,72℃延伸1 m in,40个循环;最后72℃延伸10 m in。     

人参黑斑病菌RAPD反应体系的优化

采用改良的CTAB法提取人参黑斑病菌的基因组DNA,建立人参黑斑病菌RAPD反应的体系.最佳体系容积为25μL,其中包括10×Taq配套缓冲液2.5μL,模板DNA 20 ng/μL,引物15 pmol/L,dNTP 150μmol/L,Taq DNA聚合酶1 U,Mg2+1.5 mmol/L,其余部分用DW补充.PCR扩增程序为:94℃预变性5 min,94℃变性1 min,40℃退火1 min,72℃延伸2 min,40次循环,72℃延伸7 min.     

玉米自交系SSR技术反应体系的优化

以玉米自交系为材料,研究了PCR反应体系的Mg(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、模板DNA浓度及退火温度对玉米自交系SSR扩增结果的影响,确定适合玉米自交系SSR分子标记研究的优化体系.最终确定总反应体系为20μmol/L,Mg(2+)浓度3.0mmol/L、dNTPs 0.1mmol/L、引物0.45μmol/L、Taq DNA聚合酶0.4U、模板DNA 50ng.PCR扩增条件:94℃预变性5 min;94℃ 45s,56℃ 45s,72℃ 1 min,35个循环;最后72℃5 min.     

花生基因组SRAP-PCR体系的优化

【研究目的】研究花生基因组SRAP-PCR的扩增条件,建立其优化扩增体系;【方法】对模板DNA、引物、dNTP mixture、Taq DNA聚合酶浓度及退火温度设置不同梯度,研究各因素对PCR结果的影响;【结果】扩增程序为:94℃变性2min,1Cycle;94℃变性30s,48℃复性30s,72℃延伸1min,40Cycles;72℃延伸7min。反应体系成份为:DNA模板80ng,左右引物各200ng,dNTP mixture2.0mmol/L,Taq DNA聚合酶3U,10×Buffer8μl,总体积60μl。【结论】建立了满足花生基因组SRAP-PCR的优化扩增体系。     

菜心ISSR-PCR反应体系的优化

以菜心(Brassica campestris L. ssp. Chinensis Var. utilis Tssen. et Lee.)为材料, 对影响ISSR-PCR扩增结果的因素如Mg2 、 Taq DNA聚合酶、 dNTPs、 Primer、模版DNA的浓度及引物退火温度、延伸时间和循环次数进行了探讨, 确立了适合菜心ISSR-PCR分析的最佳反应体系和PCR扩增参数 在25 μL反应体系中含10×buffer 2.5μL, 2.0 mmol/L Mg2 , 0.5 U Taq DNA聚合酶, 0.2 mmol/L dNTPs, 0.5 μmol/L引物, 30 ng模板DNA. PCR扩增程序 94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性1 min, 49.7～56 ℃退火(退火温度随引物不同而定)1 min, 72 ℃延伸45 s, 40个循环; 72 ℃延伸5 min.     

大字杜鹃RAPD反应体系的优化

以大字杜鹃为材料,以改进的CTAB法提取大字杜鹃叶片总DNA,分别就模板DNA浓度,引物浓度,DNTP浓度,TaqDNA聚合酶量及镁离子浓度对大字杜鹃RAPD反应结果的影响进行研究．通过对各因子的组合比较,建立了大字杜鹃RAPD反应的优化体系,即总反应体积为25pL,其中包括10×Taq酶配套缓冲液2．5pL,模板DNA浓度50mg／L,引物浓度0．5μmol／L,dNTP浓度0．15mmol／L,TaqDNA聚合酶1U,Mg^2＋浓度2．0mmol／L,其余用重蒸馏水补足．扩增程序为94℃预变性5min,94℃变性1min,38℃退火40S,72℃延伸2min,共41个循环,72℃延伸7min．     

假臭草DNA提取及RAPD反应体系的优化

以假臭草叶片为材料,对影响其随机扩增多态DNA（RAPD）反应的各因素进行优化．建立了假臭草RAPD的优化反应体系和程序,即在10μL反应体系中,5ng（／10μL）模板DNA,1．0μmol／L随机引物F15,150μmol／LdNTPs,2．0mmol／LMg^2＋,1．0UTaqDNA聚合酶;扩增程序为95℃预变性4min,95℃变性40S,36℃退火40S,72℃延伸1min,10个循环,后94℃变性30s,35℃退火30s,72℃延伸1min,35个循环,72℃延伸5min,4℃保温。     

正交设计优化茄子SSR反应体系

以茄子基因组DNA为模板,利用正交设计方法对茄子SSR反应体系中的Mg^2＋、模板DNA、Taq聚合酶、dNTP、引物5个因素进行了优化,同时对反应程序中的退火温度及循环次数进行筛选。结果确定了茄子10μL体积SSR反应体系的最优条件为：Buffer为1μL,Mg^2＋为2．25mmol·L^-1,dNTP为400μmol·L^-1,上下游引物各为39.60ng,Taq聚合酶为0．75U,DNA约为100ng。PCR程序为94℃预变性2min：然后进行35个循环的94℃变性30s,52℃复性30s,72℃延伸45s;72℃延伸8min后4℃保存。     

椰子基因组DNA的提取及RAPD反应体系的优化

以椰子叶片为实验材料,探索了椰子基因组DNA的提取方法,并对影响RAPD反应的各因素进行了优化,建立了椰子的优化反应体系和程序。试验最终建立的椰子RAPD反应总体积为20μL,各有关成分的最佳浓度分别为Mg2＋2.5 mmol/L,Taq DNA0.75 U,dNTP 0.2 mmol/L,Primer 1μmol/μL,模板DNA2.5 ng/μL。PCR循环程序为：94℃预变性1.5min;94℃变性20 s,36℃退火20 s,72℃延伸45 s,35个循环;最后72℃延伸3 min。     

珙桐基因组DNA的提取及ISSR-PCR体系的优化

采用改良的CTAB法提取珙桐基因组DNA,并采用正交试验设计方法优化其ISSR-PCR反应体系。结果表明：改良CTAB法提取基因组DNA的质量符合ISSR-PCR扩增反应的要求。最佳反应体系为：20μL反应液中含有2.0μL10×buffer、2.75 mmol/L Mg^2＋、0.125 mmol/L dNTPs、0.7μmol/L引物、0.75 UTaq酶和40 ng模板;PCR反应参数为：94℃5 min;94℃30 s,53.2℃45 s,72℃1 min,共40个循环;72℃7 min。     

北五味子RAPD-PCR反应条件优化

以采自吉林省汪清地区野生北五味子叶片为材料,提取其基因组DNA,并以此为模板进行北五味子RAPD—PCR反应条件的优化．结果表明,PCR反应混合液为：25μLPCR反应体系中加入20ng模板DNA,200μmol／LdNTPs,0．3μmol／L引物,2．0mmol／LMg^2＋,1UTaqDNA聚合酶,2．5μL 10×Buffer;PCR反应程序为：94℃预变性5min后,在94℃变性1rain,40℃退火1min,72℃延伸2min,共40个循环后,在72℃下最后延伸5min时,在不同引物中均扩增出清晰而稳定的DNA电泳谱带．     

南瓜SRAP反应体系的建立与优化

以‘密本’南瓜作为筛选体系的材料,通过单因素试验对南瓜20μL SRAP-PCR扩增体系的Mg^2＋、dNTP、 Taq酶、引物及DNA浓度和扩增程序的退火温度与循环次数进行优化,筛选出各组分的最佳浓度、最佳的退火温度和最佳循环次数。试验结果确立南瓜最佳的20μL SRAP体系为：0.2 mmol · L ^-1 dNTP ,1.5 U Taq酶,80 ng DNA ,0.16μmol·L^ -1的单条引物,Mg^2＋1.5 mmol·L^ -1,2μL 10＆#215;Buffer ;最佳扩增程序为：94℃预变性5min;94℃1 min ,35℃1 min ,72℃1 min ,5个循环;94℃1 min ,52℃1 min ,72℃1 min 35个循环;最后72℃延伸10 min。选用17个南瓜品种对确立扩增体系及扩增程序进行验证,检测结果表现为扩增产物条带清晰明亮、多态性丰富、特异性强、重复性好,表明本试验所确定的反应体系及反应程序适用于南瓜的SRAP分子标记。     

海带属配子体DNA提取及ISSR-PCR体系优化

为了建立一个重现性好、稳定性高,适用于海带属ISSR遗传分析的PCR反应体系,从海带属配子体材料中提取基因组DNA作为模板,应用正交设计试验对反应体系中各因子的不同浓度进行组合优化。结果显示：适用于海带ISSR 扩增反应的最佳体系(20 μL)为：1×PCR buffer,1.2 mmol/L Mg2 +,0.2 mmol/L dNTPs,1.0 μmol/L ISSR 引物,40 ng 模板DNA,0.25 U Taq DNA 聚合酶;扩增PCR 程序为：95℃预变性3 min;95℃变性45 s,52℃退火45 s,72℃延伸2 min,共38 个循环;最后72℃延伸10 min。在优化的海带ISSR 反应条件下,扩增条带稳定,重现性好,为应用ISSR 分子标记技术进行海带属遗传多样性研究和分子鉴定奠定了技术基础。     

天麻PCR反应体系的建立

 通过对Mg²⁺,dNTP,随机引物、模板DNA,TaqDNA聚合酶浓度等反应参数的系统研究,建立了天麻RAPD分析体系。该体系反应总体积20 μL, 其中MgCl₂ 2.5 mmol/L, dNTP 0.25 mmol/L,模板20 ng,随机引物0.3 μmol/L,Taq酶1.5 U. 反应程序为94 ℃预变性5 min,94 ℃变性35 s,36 ℃退火35 s,72 ℃延伸1 min,40个循环,最后72 ℃延伸5 min. 结果表明该体系具有良好的稳定性和重复性,可应用于天麻的演化、系统分类、品种鉴定等研究。