猪乳铁蛋白N叶(PLF-N)在毕赤酵母中的表达及抑菌活性鉴定

根据猪乳铁蛋白N叶(PLF-N)的蛋白序列和毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子的偏嗜性,通过全基因合成法合成改造后的PLF-N基因片段,将其克隆到pGAPZα-A质粒中构建分泌型重组酵母表达载体 pGAPZα-A- PLF。pGAPZα-A- PLF 通过限制性内切酶Avr Ⅱ酶切线性化后,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞SMD1168内。PCR检测结果发现,PLF-N基因与毕赤酵母染色体稳定结合,Zeocin抗性筛选,得到高拷贝转化子。在GAP启动子调控下,PLF-N重组蛋白获得分泌表达,其分子质量约为38 ku,上清表达量约为364 μg/mL。琼脂糖孔穴扩散法检测结果显示,该表达产物对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有较好的抑菌活性,且对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度(MIC)分别为12.5、25.0 μg/mL。     

猪α干扰素基因在毕赤酵母中的分泌表达

将猪α干扰素(PoIFN-α)基因克隆入毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA中,电转化毕赤酵母KM71H菌株,抗生素ZeocinTM浓度梯度筛选高抗性转化子,以PCR鉴定阳性重组菌株。筛选出的高拷贝重组菌株分别通过BMGY/BMMY培养基和YPG培养基,用甲醇诱导表达。SDS-PAGE和Westernblot印迹杂交结果证实,表达产物为重组PoIFN-α融合蛋白,经细胞毒性试验检测(WISH/VSV系统),表达产物的抗病毒活性为4.1×104IU/mL。     

人乳铁蛋白cDNA的克隆及在家蚕细胞中的表达

从人的乳腺组织中克隆了人乳铁蛋白(hLF)cDNA,其DNA序列与GenBank中另外4个hLF cDNA序列具有高度的同源性(同源性达到99%)。将人乳铁蛋白cDNA克隆在质粒pBacPAK8的BamHⅠ位点和XhoⅠ位点,构建成重组转移质粒pBacPAK-hLF。该质粒DNA与已线性化BacPAK6DNA共转染家蚕细胞BmN,在培养的贴壁细胞中挑出空斑,经过3轮纯化,获得重组病毒BmNPV-hLF。蛋白质免疫印迹法检测到在重组病毒感染的家蚕细胞中存在人乳铁蛋白基因的表达产物,分子量约78kD,ELISA法测定结果表明家蚕细胞中重组人乳铁蛋白(rhLF)相对表达量在表达120h达到最高值,约为13.5mg/L。体外生物活性试验表明重组hLF对大肠杆菌JM109具有抑菌活性。     

东北林蛙皮肤抗菌肽基因在毕赤酵母中表达条件的优化

目的:确定毕赤酵母表达东北林蛙皮肤抗菌肽dybowskin-1ST基因的最佳诱导表达条件。方法:本研究将PCR合成的dybowskin-1ST基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建pPIC9K-dybowskin-1ST诱导型表达载体。表达载体经线性化后转化巴斯德毕赤酵母GS115,应用BMMY培养基诱导表达。采用单一变量法及正交试验法,对甲醇诱导的浓度、时间和温度进行了优化,通过SDS-PAGE电泳分析和体外抑菌试验检测目的肽表达丰度。结果:最佳诱导条件:甲醇终浓度为0.5%、诱导时间为72 h、诱导温度为28℃,在此条件下表达产物SDS-PAGE电泳条带灰度值为117,抑菌环直径为28.16mm,可为规模化的抗菌肽表达提供参考数据。     

猪传染性胃肠炎病毒YK株N基因的原核表达与N蛋白的生物学活性检测

将猪传染性胃肠炎病毒的N基因克隆到表达载体pET28a后,转化到BL21(DE3)大肠杆菌表达系统中.通过筛选表达温度和IPTG的浓度,使N基因在原核表达系统中表达并使目的表达产物产量达到最高值.将诱导表达的产物进行SDS-PAGE蛋白电泳和Western检验,证明该表达产物是猪传染性胃肠炎病毒的N蛋白.试验结果说明,猪传染性胃肠炎病毒N基因能够在原核表达系统中大量表达,而且表达的蛋白质具有生物学活性.     

表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌微胶囊制备工艺的优化

为使重组乳酸乳球菌在发酵生产后便于存储、运输,本试验利用可表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363制备微胶囊,优化微胶囊的制备工艺条件,并对胶囊化后重组菌的相关生物学特性进行检测。通过对不同壁材及壁材浓度进行控制单一变量试验,测定其包埋量,以筛选出最佳壁材及浓度。通过模拟胃肠液环境试验,比较微胶囊释放率,并对不同壁材进行保存期试验,比较最低活菌数,利用响应面试验确定最佳工艺条件,使用最佳工艺条件制备微胶囊后进行验证。优化后的结果为:选取海藻酸钠和壳聚糖作为壁材,在海藻酸钠浓度为2.49%,壳聚糖浓度为0.96%,CaCl₂浓度为6.67%,凝固时间为57 min的条件下微胶囊效果最佳,预测包埋量为7.85×10⁸ CFU/g。微胶囊在模拟胃液中稳定存在,在模拟肠液中可完全破裂,能释放出微胶囊内95%以上的乳酸乳球菌。海藻酸钠-壳聚糖微胶囊在4 ℃保存3周后,微胶囊中活菌数为1.41×10⁷ CFU/g。对微胶囊的最佳工艺条件验证结果为微胶囊的包埋量为8.08×10⁸ CFU/g;常温保存2周后,活菌数仍可达到3.89×10⁶ CFU/g;ELISA方法检测微胶囊内重组乳酸乳球菌可见表达的牛乳铁蛋白肽,抑菌试验可见微胶囊内重组乳酸乳球菌表达的牛乳铁蛋白肽对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌仍具有明显的抑制作用。以上结果表明,表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌可制备成为低成本、保存期长、耐胃液的微胶囊,为重组乳酸菌在生产中的进一步应用奠定基础。     

牛胃溶菌酶基因在毕赤酵母中的表达、发酵参数优化及抑菌活性研究

为了利用毕赤酵母表达系统表达具有生物学活性的重组牛胃溶菌酶(rcsLYZ)蛋白,试验构建了能分泌表达rcsLYZ的重组酵母菌株,并通过因子筛选试验(Plackett-Burman)设计和响应面方法研究了接种量等参数对rcsLYZ活性的影响,并且利用管碟法检测了rcsLYZ的抑菌效果。结果表明:培养体积、诱导时间和甲醇浓度对rcsLYZ表达水平有显著影响(P0.01);响应面法优化后rcsLYZ活性为415.2 U/mL(培养体积为42 mL,诱导时间为89 h,甲醇浓度为1.1%),与理论预测最大值(431 U/mL)接近;rcsLYZ活性相较于优化前有较大提高;rcsLYZ对溶壁微球菌、藤黄微球菌及金黄色葡萄球菌具有较好的抑制作用,对大肠杆菌、铜绿假单胞菌和蜡样芽孢杆菌无抑制作用,说明rcsLYZ可以在毕赤酵母中表达,优化后活性较好,对部分细菌有抑菌效果。     

乳铁蛋白抑制常见口腔及肠道致病菌的体外活性研究

试验旨在研究乳铁蛋白对常见口腔/肠道致病菌的抑制和细菌生物膜清除作用。选择重组人乳铁蛋白(rhLF)、牛乳铁蛋白(bLF)和蛋清溶菌酶(阳性对照组),对金黄色葡萄球菌等7种菌进行抑菌、细菌生物膜形成和清除等试验。结果表明:(1)最低抑菌浓度试验表明,rhLF、bLF对金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、沙门氏菌、牙龈卟啉单胞菌等具有较强的抑制作用;(2)抑菌圈试验表明,rhLF对金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌的抑制效果优于bLF,而对沙门氏菌、牙龈卟啉单胞菌的抑制效果差于bLF(P0.05);(3)生物膜形成抑制试验表明,不同浓度的rhLF对金黄色葡萄球菌的抑制作用均显著高于bLF(P0.05),浓度为5 mg/mL的rhLF抑制效果达到99%;(4)生物膜清除试验表明,不同浓度的rhLF对金黄色葡萄球菌的生物膜清除效果均显著高于bLF(P0.05),浓度为5 mg/mL的rhLF抑制效果达到56%。研究结果表明,乳铁蛋白对常见口腔/肠道致病菌,尤其对金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、沙门氏菌、牙龈卟啉单胞菌等,具有一定的抑制作用;同时对细菌生物膜形成具有抑制和清除作用。     

家蝇幼虫防御素基因MddⅠ在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性鉴定

根据家蝇幼虫防御素基因(MddⅠ)序列,设计合成含有KpnⅠ和XbaⅠ酶切位点的特异性引物,PCR扩增出MddⅠ基因全长序列。克隆并测定序列后,构建真核表达质粒pGAPZαAMddⅠ,将其在毕赤酵母(P.pastoris)GS115中分泌表达,并对表达产物进行抑菌活性分析。结果表明,Mdd 1基因在P.pastoris如中成功表达,分子量约为10.3 kDa,抑菌结果显示MddⅠ基因的真核表达产物对猪源链球菌有抑制作用。该试验成功构建了表达MddⅠ基因的P.pastoris菌株,为进一步研究MddⅠ真核表达产物的生物学活性和免疫学活性奠定了基础。     

猪β-防御素1在毕赤酵母中的串联表达

猪β-防御素1(pBD1)是在猪体内广泛分布的一种抗菌肽,在猪的先天免疫系统中发挥重要的作用。本试验为实现pBD1在巴斯德毕赤酵母中的高效表达,根据pBD1基因的成熟肽序列和巴斯德毕赤酵母密码子的偏好性,设计合成pBD1三倍串联体(3pBD1)基因序列,将合成的目的基因克隆到表达载体pHLI-S1中,构建重组表达载体pHLI-S1-3pBD1,线性化后的pHLI-S1-3pBD1电转化至毕赤酵母宿主菌GS115,PCR鉴定阳性转化子,MM平板和MD平板鉴定Mut表型。将鉴定为阳性的Mut~+型重组酵母菌株进行甲醇诱导表达,SDS-PAGE分析表达上清液。结果显示,获得的重组酵母菌株为Mut~+表型,经甲醇诱导表达后,表达上清液中含有分子量为22 kDa的目的蛋白。结果表明,获得了能够表达3pBD1的重组巴斯德毕赤酵母。