橡胶基因组中一个与酿酒酵母脯氨酸特异性通透酶基因部分同源的多态性片段的克隆及序列测定

橡胶树(Hevea brasiliensis Muell.Arg.)的传统种植区主要分布于高温多雨的热带地区,抗旱基因或DNA标记的筛选鉴定对于橡胶耐旱品系的选育及橡胶树向温光和雨量相对不足的非传统植胶区的拓展具有十分重要的意义.RAPD分析是目前遗传多态性研究及特异性基因片段鉴定最有效的分子学工具之一.本研究借助聚合酶链式反应(PCR)对来自37个橡胶无性系的基因组DNAs进行了RAPD分析.结果显示,多态性及特异性扩增条带的数量随无性系及引物的不同而有所差异,有些扩增带为一些无性系共有,而另一些则仅存在于个别或少数无性系之中.根据引物OPB-12的两个特异性扩增条带(1.2和1.4 kb)在各无性系中单独或同时存在与否,我们鉴定出了两个相应的特异性RAPD标记,其中1.4 kb扩增带尤其引人注目.克隆及测序结果表明,该RAPD片段与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)脯氨酸特异性通透酶基因存在一定程度同源性.针对该片段设计一对特异性引物并再次对基因组DNA进行更严格条件下的PCR扩增,结果从14个参试无性系中获得了该1.4kb条带.这种由RAPD标记通过特异性引物设计转化得到的SCAR(序列特异性扩增区)标记可用于橡胶树优良或特异性基因的筛选及鉴定.     

菊芋凝集素基因组片段的PCR扩增及克隆

通过PCR扩增 ,获得了菊芋凝集素基因 (hta)的编码区基因组片段hta - g。DNA序列分析表明 ,PCR产物长 70 2bp ,包括 444bp的编码区序列 ,编码区被一个 2 5 8bp的内含子分成 2个长度分别为 2 1 0bp及 2 34bp外显子 ,内含子边界序列符合GT/AG规则。与htacD NA序列的比较分析表明 ,hta - g的编码区序列与htacDNA序列高度同源 ,同源性在 93%～98%。     

柑橘LEAFY同源基因片段的克隆及分析

在提取大三岛脐橙(Citrus sinensis(L)Osbeck)基因组DNA的基础上，利用Uneven PCR的方法克隆了脐橙中的LEAFY(LFY)同源基因片段。经对该基因片段的核苷酸序列分析表明，它和烟草中的LFY同源基因NFY基因在结构上高度保守，同源性高达90%以上。     

伪狂犬病毒粤A毒株TK基因的扩增、克隆与序列测定

以华南农业大学兽医学院传染病教研室分离的伪狂犬病毒粤A毒株（PRV YA）的基因组为模板，利用聚合酶链反应（PCR）扩增TK基因，获得预定大小的片段，将这一自然克隆到PMD18－T载体中。对重组质粒PMD18－TK进行PCR鉴定、限制性内切酶分析和克隆片段的序列测定、比较，证实了克隆片段的可靠性。     

文心兰GAPDH基因片段的克隆及序列分析

采用Trizol法提取文心兰花期花葶总RNA,并运用RT-PCR方法克隆了文心兰GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)基因的2个部分序列,长度均为875 bp,编码291个氨基酸残基.序列分析结果表明,与其它已登录物种的GAPDH基因相比,其核苷酸序列的同源性均在79％以上,与蕙兰(JN177724.1)同源性高达到92％,氨基酸序列的同源性也在85％以上;且与单子叶植物的同源序列表现出较高的相似性.本研究已克隆出文心兰GAPDH基因的部分cDNA同源序列片段,分别命名为OnGA1和OnGA2,并在GenBank注册,登录号分别为JN981141和JN981142.     

梭菌氢酶基因部分片段的同源克隆及敲除载体的构建

为从分子水平探索典型铁还原菌-梭菌的铁还原能力与其氢酶产氢之间的关系,以从水稻土中分离得到一株具有高铁还原能力和高产氢能力的梭菌为材料,通过同源克隆获得长度为761bp氢酶基因的部分序列。生物信息分析发现,该基因片段覆盖氢酶的活性中心,是氢酶的主要功能结构域。采用Overlap PCR的方法构建含有四环素抗性基因的氢酶基因敲除载体(pMD-19-HTH),以期进一步构建氢酶基因缺失的梭菌突变体,为分析氢酶产氢与铁还原的关系奠定基础。     

银杏漆酶同源基因片段的克隆与分析

[目的]克隆银杏漆酶同源基因,为今后深入研究漆酶在银杏体内的功能提供基础。[方法]在提取银杏雄株叶片基因组DNA的基础上,利用PCR的方法克隆银杏漆酶同源基因片段。[结果]获得了一段基因序列,经对该基因片段的核苷酸序列分析表明,它与桃漆酶同源基因在结构上高度保守,相似性高达68％。[结论]成功克隆了银杏漆酶同源基因的部分序列。     

牙鲆精氨酸酶基因片段的克隆及序列分析

根据Gen Bank中虹鳟、大菱鲆、斑马鱼及其他生物的精氨酸酶基因序列设计并合成一对引物,并提取变态期牙鲆仔鱼总RNA作为模板进行RT-PCR,得到一条c DNA片段。将产物连接到T载体中,转化、扩增重组质粒。提取大肠杆菌中的重组质粒进行DNA测序。将DNA测序所得到的基因序列翻译成蛋白序列和已知的大菱鲆、鲤鱼、虹鳟、斑马鱼的精氨酸酶基因序列进行同源性分析。结果显示,利用RTPCR的方法扩增出一条284 bp的目的基因片段,比对结果发现,其与大菱鲆、鲤鱼、斑马鱼以及虹鳟精氨酸酶基因蛋白序列的同源性分别为96%、85%、84%和82%。对蛋白序列进行生物信息学分析发现,整个蛋白序列中无信号肽,无糖基化位点,无跨膜结构域,但含有一个典型的arginase结构。在N-端第38~44、57~64、71~76、89~94区段有β-折叠中心;第7~18、50~52、81~87区段可能形成α螺旋区域。Arg蛋白N端第37~45和第74~77区段为优势抗原表位区域。     

木豆Actin基因片段的克隆及序列分析

根据大豆Actin基因的保守序列设计一对引物Primer 1和Pri mer 2,以木豆叶片总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增出Actin基因片段并克隆到PMD-18T载体。阳性克隆经PCR检测后测序,序列分析结果表明,该片段长302bp,编码100个氨基酸;所得序列与GenBank中注册的其他植物Actin基因核苷酸序列的同源性均在89%以上,其中与大豆的同源性达94%;与氨基酸序列的同源性均在90%以上。     

互花米草中NHX基因片段的克隆与序列分析

利用同源克隆方法从盐生植物互花米草（Spartina alterniflora）中分离并克隆出Na~＋/H~＋逆向转运蛋白基因的1段cDNA片段,长度为951 bp,推测编码317个氨基酸。氨基酸序列的对位排列分析显示,该cDNA片段对应的氨基酸序列与已知的植物液泡膜型Na~＋/H~＋逆向转运蛋白的氨基酸序列有较高的相似性,且与禾本科植物中的同源物之间的关系更为密切。     

枇杷LEAFY同源基因的克隆及序列分析

为从分子水平研究枇杷成花的机理,通过分析植物花分生组织决定基因LEAFY(LFY)同源基因的保守区序列,设计了1对简并引物,用PCR方法从枇杷栽培品种‘早钟6号’基因组DNA中扩增出1个1317bp的片段,把该片段克隆到pUCm-T载体,测序和序列分析结果表明获得了枇杷LFY同源基因(ejLFY)3’端的1个片段,该片段有1个911bp的内含子,编码区共编码130个氨基酸,其序列已经在GenBank中登记(登录号为AY551183)．在GenBank中进行同源性搜索,发现该基因片段与其他作物中已经报道的LFY同源基因的同源性大都在94％以上,特别是与同属于蔷薇科的苹果的同源性最高,达到98％的同源性,推测它们具有相似的功能．     

甘薯抗病基因同源序列的克隆与分析

对根据紫花苜蓿（Medicago truncatula）NBS区域的保守序列等设计的16对简并引物进行优化,筛选出6对简并引物,以甘薯的基因组DNA为模板进行PCR扩增,克隆甘薯抗病基因同源序列（RGA）。结果克隆出342个不同的甘薯RGA,这342个甘薯RGA和已知的抗病基因历、N、RGCl等具有高度同源性（Evalue〈e×10^-20）。根据抗病基因同源序列的相似性,利用Cluxtalw软件将其分为22个不同的类群。这些甘薯的抗病基因同源序列已提交GenBank（编号：DQ903322至DQ903664）。在342个甘薯RGA中,除7个是TIR外,其余属于DOD—TIR类型。用Blastx和DNAman软件对342个甘薯RGA进行列队比较,发现有9个含有抗线虫病RGC1序列的RGA,它们与RGC1的同源件为50％～100％．     

黑豆NBS类抗病基因同源片段的克隆与分析

根据已克隆的抗病基因保守结构域设计简并引物,以湖南黑豆（HH）为试材,通过RT-PCR,从cDNA中扩增抗病基因同源序列,测序鉴定出2个含有通读阅读框的DNA片段：FNBSl、FNBS3。FNBS1大小为534bp,编码178个氨基酸;FNBS3大小为513bp,编码169个氨基酸。BLASTP分析表明,2个片段均具有NB-ARC结构域（与植物抗病有关）,并且包含p-loop、Kinase-2、HD等结构域。基因FNBSl与大豆基因RPMl-like编码的氨基酸序列的同源性为98％,基因FNBS3与大豆基因N-like 编码的氨基酸序列的同源性为99％,推测FNBS1、FNBS3可能是黑豆NBS-LRR类抗病基因的核心区域。     

白羊草肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

根据几种禾本科植物肌动蛋白基因的保守序列设计一对简并引物,以白羊草(Bothriochloa ischaemum)幼叶总RNA为模板,采用RT-PCR方法克隆获得一个肌动蛋白基因cDNA片段,命名为BiACT,该基因片段长度为720bp,编码240个氨基酸残基。氨基酸比对分析结果表明,BiACT基因编码的氨基酸与其他植物肌动蛋白的氨基酸序列具有较高的同源性。     

猪围脂滴蛋白基因cDNA部分片段的克隆及序列分析

采用比较基因组学和简并PCR方法,根据人、小鼠和大鼠等物种PLIN基因的序列,设计简并引物,克隆了猪PLIN基因包括起始密码子的部分cDNA序列,大小为978 bp(GenBank登录号为EU416277)。该序列与人和小鼠相应序列的相似性分别为87%和83%,编码325个氨基酸,具有1个PAT-1结构域、2个蛋白激酶A位点和1个富含谷氨酸的酸性基序,预测的氨基酸序列与人、小鼠、牛和绵羊相应区域序列的相似性分别为87%,82%,86%,86%。该基因的克隆为进一步研究其功能奠定了基础。     

桃基因组中R类抗病基因同源序列的克隆与序列分析

许多抗病基因均具有核苷酸结合位点(NBS)和富含亮氨酸重复区(LRR)。根据已知的NBS-LRR型抗病基因蛋白质的保守序列,设计简并引物,用以扩增桃基因组中的抗病基因同源序列。获得一条大小约500 bp的扩增片段,克隆测序后得到4个NBS-LRR类抗病基因同源片段(PNBS1、PNBS2、PNBS3、PNBS4)。推导的氨基酸均具有P-loop(激酶1a)保守区和中间的激酶2a、激酶3a保守区,除PNBS4外,均具有3端疏水结构域。它们与已克隆的N、L6、PRS2 等抗病基因在核苷酸水平上的同源性为21 1%~58 8%;在氨基酸水平上的同源性为18 8%~41 4%。这些抗病基因同源片段(RGA)可做为分子标记筛选桃的抗病候选基因。     

橡胶树树皮HbbHLH基因三端序列的克隆及表达分析

[目的]为今后深入了解茉莉酸诱导橡胶树乳管分化的分子机理奠定基础。[方法]根据bHLH转录因子基因保守区设计引物,以橡胶树树皮RNA反转录第一链cDNA为模板,获得橡胶树树皮组织bHLH基因的EST序列,以此序列设计巢式引物,应用3′RACE技术对其三端序列进行克隆,并利用半定量RT-PCR分析该基因在茉莉酸处理后4 h、8 h、1 d、2 d、3 d的表达情况。[结果]克隆共得到1 084 bp的HbbHLH基因3端序列,序列分析发现该基因属于MYC型HLH结构域。表达分析结果显示,茉莉酸处理后,bHLH基因在8 h内表达逐渐增强,1 d、2 d时表达稳定最高,3 d时表达水平开始减弱。[结论]茉莉酸对HbbHLH基因的表达具有调控作用。     

太子参GAPDH基因的克隆及序列分析

为了获取可靠内参基因,采用同源克隆技术和c DNA末端快速延伸技术,首次从太子参中克隆3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)的部分c DNA序列,命名为Ph GAPDH,序列长度为981 bp,包含699 bp的部分阅读框,推测其编码232个氨基酸,还含有282 bp的3'UTR。序列分析结果表明,太子参Ph GAPDH基因编码的氨基酸序列与同科植物香石竹(Dianthus caryophyllus)氨基酸序列同源性高达99%。PCR分析结果表明,Ph GAPDH基因在太子参不同种源块根、同一种源不同组织及不同生长时期的表达水平较稳定,可以作为太子参功能基因研究的内部参考基因。     

土人参Actin 基因片段的克隆及序列分析

为土人参功能基因的表达与调控提供内参基因,根据已知植物Actin基因的保守区设计简并性引物,采用RT-PCR方法扩增得到土人参的Actin基因片段,将该片段连接于p GEM-T载体,测序获得一段大小为598 bp的基因片段,该片段编码198个氨基酸。通过生物信息学软件分析,该序列与其他植物Actin基因的cDNA序列同源性均在85%以上,氨基酸序列的同源性达到86%以上,表明试验克隆所得基因片段为土人参Actin基因片段。将该Actin基因片段命名为TpActin1,并登陆在Gena Bank,登录号为MH333039。     

葡萄抗霜霉病基因同源序列的克隆与分析

依据抗病基因在保守区域序列同源的原理,针对已知抗病基因NBS保守结构区域设计9条简并引物,以高抗霜霉病的葡萄品种贝达为材料,人工接种葡萄霜霉病菌15d后,应用PCR技术从叶片cDNA中分离出2条抗霜霉病基因同源序列VR5和VR16,并提交到Genbank,其中VR5含有507bp,登录编号为JQ763391;VR16含有562bp,登陆编号为JQ763392.2条序列均含有p-环(GGVGKTT)、kinase-2(VLDD)、kinase-3(GSRII)及HD(即GLPL)等植物抗病基因中的保守结构.聚类分析结果表明,VR5与亚麻抗病基因L6聚为一类,VR16与拟南芥抗病基因RPS2聚为一类,编码氨基酸序列同源性分别为38％和56％.