农杆菌介导的三月茄遗传转化体系的优化研究

以普通三月茄为材料,利用农杆菌介导法对茄子进行遗传转化.通过设置一系列对照组,筛选出最佳诱导分化培养基及高效的抗生素组合、对比茄子子叶与下胚轴的诱导分化效果,从而对茄子的遗传转化体系进行优化和改良.结果表明:最佳诱导培养基为MS+6-BA 2 mg/L+ZT 1 mg/L;使用子叶作为外植体时,农杆菌介导的茄子遗传转化率达到了11.02%,其愈伤组织和不定芽的诱导率均显著高于下胚轴;当采用Carb 250 mg/L+Kan 100 mg/L的组合时,可以得到最佳的诱导效果,且在一定范围内,适当降低Carb与Kan浓度的比值,可以提高出愈率.     

胡萝卜遗传转化体系的建立

以新黑田五寸胡萝卜下胚轴为外植体,研究对胡萝卜抗性植株的影响因素及目的基因的整合情况,建立了较为完善的转化体系。实验结果表明:以胡萝卜下胚轴为材料,用苗龄7d,共培养2d,浸染15min的体系,Kan抗性芽的分化频率可达52%。获得抗性愈伤培养基:B5+0.1mg/L2,4-D+0.2mg/LKT+75mg/LKan+500mg/LCef,抗性芽诱导培养基:B5+100mg/LKan+500mg/LCef;抗性植株生根培养基:B5+0.1mg/LIBA+75mg/LKan+300mg/L:Cef;对转基因植株进行了PCR分子学检测,初步证明外源基因已整合到胡萝卜基因组中。     

不同植物生长调节剂对莴苣愈伤组织的诱导与植株再生的影响

探讨了莴苣组织培养中不同植物生长调节剂对莴苣愈伤组织的诱导及植株再生的影响.试验结果表明,采用下胚轴为外植体进行愈伤组织诱导,MS 2,4-D 1.0 mg/L 6BA 0.5 mg/L NAA 0.1 mg/L有利于下胚轴愈伤组织的生成,诱导率达95%;MS 6BA 1.0 mg/L NAA 0.2 mg/L培养基有利于从愈伤组织上诱导出芽,诱导率可达100%;幼苗经1/2MS NAA 0.5 mg/L培养基诱导生根后成为完整的植株.     

新疆大叶紫花苜蓿(Medicago sativa.L)子叶、下胚轴、根的植株再生

随着植物抗逆性研究和植物转基因技术的发展,通过异源目的基因转化培育耐盐碱苜蓿品种的研究已引起人们的关注,植物受体高频再生体系的建立是异源转化高效的基础。选取新疆大叶紫花苜蓿种子萌发5～7d无菌苗的子叶、下胚轴及根为外植体,诱导愈伤培养基为MS 2,4-D0.1～3.0mg/L(8种不同水平)或MS 2,4-D2.0mg/L KT0.01～0.5mg/L(10种不同水平),诱导芽培养基为MS 6-BA0.5mg/L NAA0.05mg/L,生根培养基为MS。结果表明,外植体在MS 2,4-D2.0mg/L KT0.2mg/L培养基中能够产生状态较好可再分化的愈伤组织,子叶、下胚轴、根的平均出愈率分别为93.1%、100%、100%。愈伤组织在MS 6-BA0.5mg/L NAA0.05mg/L培养基中培养40～80d中均可分化芽,子叶、下胚轴、根的芽平均分化率为50%、78%、50%,将2cm以上的芽转入MS培养基中诱导生根,14d后,生根的小植株炼苗移入花土中,成活率达90%以上。子叶、下胚轴、根在该体系中均能获得再生植株,根也是一种较好的植株再生材料,以根为外植体进行植株再生的研究报道还较少。     

库伦大三棱荞麦愈伤组织诱导的研究

以库伦大三棱荞麦为研究对象,以子叶、下胚轴为外植体诱导愈伤组织,为建立荞麦的遗传转化体系奠定基础。研究结果表明:去皮荞麦种子的最适消毒条件是0.1%升汞消毒1.5min;以子叶为外植体诱导愈伤组织的最适培养基为MS+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉+1.2mg/L6-BA+0.05mg/L NAA+0.1mg/L2,4-D;以下胚轴为外植体诱导愈伤组织的最适培养基为MS+30g/蔗糖+7g/L琼脂粉+0.5mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+0.05mg/L2,4-D;下胚轴比子叶更适合作为外植体诱导愈伤组织。     

Landersberg生态型拟南芥愈伤组织的诱导和植株再生体系的研究

以landersberg生态型的拟南芥为试材,建立了一套简便有效的组培体系。无菌苗的生长采用竖直培养,易于收集外植体。莲座叶、叶柄、下胚轴、根分别作为外植体在B5+5 mg/L2,4-D+0.5 mg/L KT培养基上诱导愈伤组织,结果表明,莲座叶作外植体出愈慢,出愈率低,愈伤组织质量较差;叶柄、下胚轴和根作外植体出愈快,且愈伤组织质量好,后期易分化。根外植体在MS+5 mg/L KT+0.1 mg/L IAA配方的出芽诱导培养基上诱导2～3周后,愈伤组织能有效分化出芽,分化率达100％。分化出的芽移至MS+2 mg/L NAA培养基上竖直培养,2周左右诱导分化出根,然后移至MS培养基上开花结果。     

甜瓜红心脆和早皇后再生体系的建立

为了初步筛选出适宜诱导甜瓜红心脆、早皇后子叶和下胚轴愈伤组织和不定芽的培养基,以及筛选适宜其不定芽伸长和生根的培养基,采用组织培养的方法,以甜瓜红心脆和早皇后种子为材料、子叶和下胚轴为外植体,进行添加不同浓度6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、吲哚乙酸(IAA)激素组合的MS培养基诱导愈伤组织和不定芽、不定芽伸长、芽生根的研究。试验结果表明,MS+0.5 mg/L IAA、MS+1.0 mg/L IAA培养基不利于红心脆子叶愈伤组织的诱导,其余培养基均有利于其子叶和下胚轴愈伤组织的形成;MS和MS+0.3 mg/L IAA培养基不利于早皇后子叶愈伤组织的形成,MS培养基不利于其下胚轴愈伤组织的诱导,其余培养基均有利于其愈伤组织的形成;适宜诱导红心脆子叶不定芽的培养基是MS+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA、MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA,适宜诱导早皇后子叶不定芽培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA;适宜诱导红心脆、早皇后下胚轴不定芽的培养基分别为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA、MS+0.3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA;MS+0.5 mg/L 6-BA、MS+1.0 mg/L IAA培养基分别适宜红心脆、早皇后不定芽伸长;2个品种适宜的生根培养基均是1/2MS+1.0 mg/L IBA。研究初步建立了甜瓜红心脆、早皇后的再生体系,为其遗传转化研究作了准备。     

紫花苜蓿的组织培养与快繁技术研究

以紫花苜蓿为材料,研究了不同外植体和不同激素处理对苜蓿愈伤和胚状体分化的影响。结果表明,子叶和下胚轴作外植体,在MS+2,4-D 2.0mg/L+NAA 1.0mg/L+BA 0.5mg/L培养基上愈伤组织诱导率较高,下胚轴的诱导率要高于子叶;下胚轴在MS+BA 3.0mg/L培养基中胚状体分化率最高。     

亚麻品种范妮再生体系的建立和抗生素阈值筛选

[目的]建立亚麻品种范妮器官发生途径的高频再生芽、再生根体系,确定抗生素筛选阈值,为遗传转化改良亚麻品质奠定基础.[方法]以亚麻品种范妮幼苗下胚轴为外植体,用软件SPSS17.0进行正交试验设计,在不同激素组合的20种培养基上进行愈伤和芽诱导,9种生根培养基上进行再生根诱导.用不同浓度抗生素Kan、Hyg确定适于抑制范妮下胚轴切段出愈的阈值.[结果]20种不同激素组合的培养基均能诱导出愈伤并直接得到再生芽,以1/2MS+ 0.5 mg/L 6-BA+ 0.9 mg/L KT+ 0.2 mg/L IAA诱导的外植体出芽块数最多,出愈率达(99.7±0.65);,褐化率(0.83±1.44);,出芽块数占总数的(93.2±5.89);,诱导再生根最佳培养基组成为:1/2MS+0.3 mg/L NAA+ 0.05 mg/L IBA.Kan和Hyg适于范妮的筛选阈值为120和40mg/L.[结论]不同基因型的亚麻品种所需的最佳再生体系不同,通过直接器官发生途径确立的范妮高频再生体系,为加快亚麻品质改良的遗传转化和筛选工作奠定了基础.     

Study on the Plant Regeneration and Agrobacterium turnefaciens-mediated Transformation Conditions of Alfalfa

[目的]建立苜蓿植株再生体系和农杆菌遗传转化体系.[方法]以“猎人河”苜蓿品种为受体材料,对影响苜蓿植株再生和遗传转化的相关因素进行了研究.[结果]最佳愈伤诱导培养基为改良SH +4.0 mg/L 2,4-D +0.5 mg/L 6-BA,最佳继代培养基为MSO+0.5mg/L NAA+ 1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L AgNO3,而最佳分化培养基为MS,苜蓿植株再生的最佳外植体是下胚轴.苜蓿农杆菌遗传转化的选择压确定为60 mg/L卡那霉素(Kan),最适宜的抗菌素为350 mg/L羧苄青霉素(Carb),农杆菌菌液的最适OD600为0.6,最佳侵染时间为10 min.[结论]该研究为今后苜蓿的基因工程研究奠定了基础.     

农杆菌介导冷调节基因（Cbcor15a）遗传转化甘蔗体系的建立

【目的】利用农杆菌介导法,将外源冷调节基因Cbcor15a导入甘蔗愈伤组织,建立快速、高效的甘蔗遗传转化体系,为培育具抗寒性甘蔗品种奠定基础。【方法】以新台糖22号（ROC22）为材料,通过对愈伤组织诱导、分化、生根等培养基进行优化,筛选出外源基因转化甘蔗的适合激素种类与用量、PPT用量、抗生素种类与用量;利用甘蔗转基因二元植物表达载体pCambia1300-Cbcor15a-bar,通过农杆菌介导法将目的基因Cbcor15a导入甘蔗愈伤组织。【结果】当农杆菌菌液OD600为0.4、侵染20 min时有利于愈伤组织分化;甘蔗愈伤组织诱导和分化培养阶段的最佳PPT为0.50mg/L。侵染后在共培养中添加500.00 mg/L抗生素Cef能有效抑制农杆菌,添加300.00 mg/L抗生素Cef能促进愈伤组织分化成苗,添加200.00 mg/L抗生素Cef能促进幼苗生根。MS培养基中添加低量NAA更有利于甘蔗愈伤组织的分化;在促进细胞分裂时KT的效果明显优于6-BA。MS培养基中添加5.00 mg/LNAA和70.00g/L蔗糖能有效促进分化苗生根。利用建立的遗传转化体系可获得286株转冷调节基因Cbcor15a的甘蔗转化植株;选取83株通过PPT抗性筛选后长势良好的转化植株进行阳性检测,其中有4株呈阳性。【结论】利用农杆菌介导的Cbcor15a基因转化甘蔗的遗传转化体系能成功将Cbcor15a基因整合到甘蔗基因组。     

凹叶厚朴用于细胞悬浮培养的愈伤组织的制备研究

目的 研究凹叶厚朴适用于细胞悬浮培养的愈伤组织。方法 通过对基本培养基（B₅、MS和1/2MS）、外植体（茎段、顶芽和叶片）、激素浓度及组合进行筛选的方法进行厚朴愈伤组织诱导和继代研究。结果 B₅ 为最适合厚朴愈伤组织诱导的基本培养基;顶芽是最佳诱导愈伤组织的材料;最适合厚朴愈伤组织诱导的培养基为B₅+2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA;最佳继代培养基为B₅+2.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA,愈伤组织生长倍数达到2.87倍。结论 初步筛选出凹叶厚朴用于细胞悬浮培养的愈伤组织,为凹叶厚朴细胞培养奠定基础。     

半夏再生体系的建立

【目的】优化半夏再生条件,以获得优质半夏种苗.【方法】筛选出适宜的外植体后,使用3种激素2,4-D,KT,IAA利用正交设计法设置9个处理组对半夏愈伤组织进行诱导.选取长势良好,大小均一的半夏愈伤组织接于4种培养基中进行愈伤组织增殖.选取半夏叶柄诱导出的愈伤组织将其接于5种培养基中进行愈伤组织分化,观察不同培养基对半夏愈伤组织生根和出芽的影响,最后进行炼苗与移栽.【结果】在叶柄、叶片及块茎3种外植体中,叶柄是半夏愈伤组织诱导的最佳外植体;最有利于半夏愈伤组织诱导的培养基为MS+0.5 mg/L 2,4-D+1.5 mg/L KT+1.0 mg/L IAA;在暗培养条件下,将半夏愈伤组织继代于MS+2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L IAA中生长最快;MS+0.2 mg/L 2,4-D+1.5 mg/L 6-BA培养基最有利于半夏愈伤组织的生根和出芽.     

提高花椰菜游离小孢子胚胎植株再生率研究

以花椰菜小孢子球型胚胎为供试材料,进行提高球型胚胎植株再生率研究。结果表明:球型胚胎成活率与胚胎的日龄、培养基的水分状况和添加活性炭有关。20 d的球型胚胎转移到MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+琼脂7 g/L+活性炭100 mg/L时,胚胎成活并形成愈伤组织的频率最高。激素组合6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L最适宜花椰菜胚胎愈伤组织分化出再生植株,分化率达到100%,平均每块愈伤组织胚芽分化数量达到6.52个。     

反义AcInv基因转化马铃薯方法的研究

马铃薯反义AcInv基因,采用农杆菌介导法,选用生产上推广的9个普通四倍体栽培种,对影响转化的各个因素进行了优化研究。结果表明:在愈伤组织诱导过程中,卡那霉素(Km)的适宜浓度为100 mg/L;生根过程中为50 mg/L。外植体的预培养为:茎段2 d,叶盘3 d效果较好;农杆菌浓度当OD600值为0.5时对茎段和叶盘的转化效果均较佳;茎段和叶盘侵染时间分别达8 min和10 min时转化率较高;外植体与农杆菌共培养时间分别为2 d和3 d时,茎段和叶盘的转化率较高;各个品种的外植体在卡那霉素抗性培养基上均能形成愈伤组织,但只有1号(“大西洋”)最后从愈伤组织上分化成苗,形成正常植株,植株再生率为11.2 %,PCR扩增检测表明大部分转基因植株为阳性。     

菊花幼嫩花瓣愈伤组织的诱导和植株再生

以菊花幼嫩花瓣作为供体材料,ＭＳ作为基本培养基,在激素组合为６ＢＡ１～３ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ１ｍｇ／Ｌ或２,４ Ｄ１～３ｍｇ／Ｌ＋ＫＴ１ｍｇ／Ｌ的范围内均能诱导出愈伤组织,但以ＭＳ附加６ＢＡ２ｍｇ／Ｌ和ＮＡＡ１ｍｇ／Ｌ的诱导率最高,可达１００％。将愈伤组织转移到ＭＳ＋６ＢＡ２ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０２ｍｇ／Ｌ的培养基上,分化芽的频率为７７８％。将３ｃｍ左右的茎段转移到不含激素的ＭＳ培养基或ＭＳ＋ＮＡＡ０１ｍｇ／Ｌ的培养基上,生根率可达９５％以上。     

Early Identification of Stable Transformation Events by Combined Use of Antibiotic Selection and Vital Detection of Green Fluorescent Protein （GFP） in Carrot （Daucus carota L.） Callus

Genetic transformation is a useful technique to complement conventional breeding in crop improvement. Although carrot has been a model organism for in vitro embryogenesis study, genetic transformation of carrot is still lengthy and labor intensive. An efficient transformation and detection system is desirable. Direct infection of Agrobacterium to carrot calli has provided an easy way for carrot genetic transformation. To improve the efficiency of antibiotic selection in this method, we report the combined use of an improved green-fluorescent protein, referred to as smGFP, to establish a versatile selection method for carrot callus transformation system. By combining antibiotic selection with the bright fluorescence observed in the callus tissue, we were able to easily identify stable transformants in early stage of the transformation process. In addition to the GFP expression of the callus cells, the transgenic nature of callus cells was confirmed with Southern and Western analysis. We found we can link the simplicity of carrot-callus-cell transformation, early detection of stable transformants with antibiotic selection, visualization of GFP fluorescence, and molecular analysis （Southern and Western） of callus tissue （non-photosynthetic tissue） to provide a more efficient way in identifying stable transformants at early stage of carrot transformation.     

不同培养基及ZT诱导对洋桔梗玻璃化的影响

以洋桔梗叶片为材料,以培养基MS＋6-BA 0．5mg／L＋IBA 0．2mg／L为对照,将在对照培养基上培养的叶盘转接到含不同激素组合（6-BA 0．2—0．5mg,L、IBA 0．05～0．1mg／L、NAA 0．01～0．2mg／L、ZT 0．5～1．0mg／L）的培养基中培养30d;将不同分化时期的愈伤组织每隔3d转接到MS培养基中培养30d,观察洋桔梗不定芽分化情况。结果表明,将已诱导15d的叶盘转接到MS＋6-BA0．3mg／L、MS＋6-BA 0．4mg／L＋IBA 0．05mg／培养基中培养,利于正常不定芽的生长,分化总芽数和正常芽总数、平均每叶盘正常芽数明显高于对照,正常苗率与对照相差不明显。此外,将现芽点6d以前的不同分化程度的愈伤组织接到MS培养基中,则不利于正常不定芽的诱导分化;将现芽点第6d的愈伤组织转接到MS培养基中继续培养,其总分化芽数、正常芽总数、平均每叶盘正常分化芽数均高于对照而正常苗比率与对照相差不明显．显,说明现愈伤后不定芽的分化还继续需要外源激素的参与,以减少不定芽的玻璃化。     

Induction and Genetic Identification of Embryogenic Calli from Hybrids of Shatian Pummelo

Shatian pummelo （Citrus grandis L. Osbeck cv. Shatian） is an elite variety in China, and the regeneration of the embryogenic callus is difficult. Diploid Shatian pummelo was used as the female and crossed with the allotetraploid somatic hybrid NS （Nova Tangelo ＋ Succari Sweet orange）, [ （ C reticulata Blanco x C. paradisi Macf.） cv. Nova ＋ C sinensis L. Osbeck cv. Succari]. About 90 days after pollination, the embryos obtained from crosses were cultured on the solid media of MT ＋ ME （malt extraction, 500 mg L^-1） and MT ＋ GA3 （1 mg L^-1）. The embryogenic callus was initiated from the embryoids and plantlets＇ hypocotyls and could be subcultured. Flow cytometry and SSR analysis verified that the callus was from the triploid hybrids. The callus had embryogenesis capacity and produced a large number of embryoids on MT ＋Lactose （50 g L^-1） medium after being subcultured for two years. It is comparatively easier to obtain the callus from the hybrid embryo than from Shatian pummelo itself. The callus is valuable for the conservation and utilization of Shatian pummelo.