山羊乳腺上皮细胞培养体系的建立

为研究乳腺上皮细胞增殖和分化特性及其基因表达的分子机制 ,建立了山羊乳腺上皮细胞培养体系。用无菌手术法从健康第二胎泌乳期山羊乳腺取得组织块 ,在体外条件下用组织块法进行原代培养。基础培养液用 RPMI1 6 4 0 ,含胎牛血清 1 5 0 m L/ L,添加 EGF(1 0 μg/ L)、胰岛素 (0 .1 m g/ L)、E2 (1 μg/ L)、氢化可的松 (0 .1mg/ L)、孕酮 (1 m g/ L)、青霉素 (0 .1 g/ L)及链霉素 (0 .0 5 g/ L) ,在铺有胶原的塑料培养板上培养。从细胞接种存活率、细胞群体倍增时间、细胞生长曲线和细胞分裂指数 4个方面考察了乳腺上皮细胞的生物学性状。结果表明 ,在此培养体系中 ,山羊乳腺上皮细胞生长良好 ,增殖旺盛。细胞产物电泳及蛋白印迹分析结果表明 ,培养的细胞为山羊乳腺上皮细胞 ,并具有表达山羊酪蛋白的功能     

脂质体介导外源基因体外转染牦牛乳腺上皮细胞条件的优化

[目的]优化脂质体介导外源基因体外转染牦牛乳腺上皮细胞的条件。[方法]通过胶原酶消化法和组织块贴壁法,体外分离培养得到牦牛乳腺上皮细胞。采用免疫细胞化学技术检测细胞角蛋白在细胞内的表达。以绿色荧光蛋白为报告基因,通过脂质体介导外源基因转染牦牛乳腺上皮细胞,统计在不同细胞融合度、脂质体浓度、脂质体与质粒的比例、转染时间下的转染效率,寻求最佳转染条件。[结果]牦牛乳腺上皮细胞在细胞融合度为81%～90%,脂质体的量为1.8μl,脂质体与质粒比例为2∶1,转染时间为4h时,转染效率最高。[结论]该研究可为乳腺生物反应器构建提供试验依据。     

金银花水提取物对山羊乳腺上皮细胞增殖及β 酪蛋白表达的影响

采用MTT比色法、Western blotting和实时荧光定量PCR,检测不同质量浓度金银花水提取物对体外培养的山羊乳腺上皮细胞增殖活性和泌乳能力的影响。结果表明,培养液中金银花水提取物为1 000 mg/L时,对体外培养的山羊乳腺上皮细胞有明显促增殖作用（P<0.01）;培养液中金银花水提取物为1 000、500 mg/L时,β 酪蛋白的表达量极显著高于对照组。可见：1 000 mg/L金银花水提取物能促进山羊乳腺上皮细胞增殖并提高泌乳能力。     

人乳铁蛋白基因乳腺特异性表达载体的构建及转染研究

构建了携带人乳铁蛋白(LTF)基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因的乳腺特异性表达载体(pEBL),用脂质体法转染泌乳期莎能奶山羊乳腺上皮细胞,转染后于荧光显微镜下观察GFP表达情况。用G 418对转染细胞进行筛选,获得抗性细胞克隆,并对转染细胞进行PCR检测。结果显示,pEBL构建成功,转染6 h后可观察到细胞有GFP表达,PCR检测阳性克隆细胞转有LTF基因。表明pEBL载体已转染山羊乳腺上皮细胞,为进一步建立转基因动物乳腺生物反应器奠定了基础。     

山羊乳腺上皮细胞的光镜观察

采用电穿孔转化法,将EGFP(增强型绿色荧光蛋白)基因转化体外培养的山羊乳腺上皮细胞。细胞穿孔转化7d后在荧光显微镜下观察。结果显示,EGFP基因成功地转入体外培养的山羊乳腺上皮细胞,EGFP基因获得表达,6种电穿孔参数的转化效果基本相同。     

脂质体介导外源基因体外转染牦牛乳腺上皮细胞条件的优化(英文)

[目的]优化脂质体介导外源基因体外转染牦牛乳腺上皮细胞的条件。[方法]通过胶原酶消化法和组织块贴壁法,体外分离培养得到牦牛乳腺上皮细胞。采用免疫细胞化学技术检测细胞角蛋白在细胞内的表达。以绿色荧光蛋白为报告基因,通过脂质体介导外源基因转染牦牛乳腺上皮细胞,统计在不同细胞融合度、脂质体浓度、脂质体与质粒的比例、转染时间下的转染效率,寻求最佳转染条件。[结果]采用胶原酶消化法,24h内细胞团块贴壁生长,纤维样细胞沿着细胞团块生长,后上皮样细胞爬出。上皮细胞与纤维细胞界限明显,细胞呈椭圆形,排列紧密,岛屿状生长。纯化至5代左右可得到较纯的上皮样细胞。采用组织块贴壁法,6d左右组织块周围出现细胞晕,有少量纤维样细胞生长;8d左右,上皮样细胞长出,并往外不断铺展。在荧光显微镜下观察,试验组细胞角蛋白检测呈阳性,细胞质呈绿色,细胞核复染呈红色。牦牛乳腺上皮细胞在细胞融合度为81%～90%,脂质体的量为1.8μl,脂质体与质粒比例为2∶1,转染时间为4h时,转染效率最高。[结论]该研究可为乳腺生物反应器构建提供试验依据。     

二甲基苯蒽诱导山羊乳腺上皮细胞体外转化研究

分别用5,10和15μg／mL二甲基苯蒽(DMBA)的完全培养液处理体外培养的山羊乳腺上皮细胞36, 24和12 h,再以25 ng／mL佛波酯(TPA)作用2周,研究DMBA和TPA对山羊乳腺上皮细胞的诱导转化作用,确定最佳诱导转化条件,探讨二甲基亚砜(DMSO)对细胞增殖的影响。结果表明,用含15μg／mL DMBA的完全培养液培养12 h,再用TPA连续作用4 d,几乎无山羊乳腺上皮细胞存活,10μg／mL DMBA培养24 h转化效果较差,5μg／mL DMBA培养36 h转化效果最佳;转化的山羊乳腺上皮细胞体积增大、核浓缩、生长排列紊乱、无规则并出现转化灶; DMSO对细胞生长有抑制作用．随培养时间延长抑制作用减弱。试验初步建立了乳腺上皮细胞的体外转化系统。     

消化法培养山羊乳腺上皮细胞

为了寻找更加有效的山羊乳腺上皮细胞分离纯化方法。用2 g/L胶原酶和0.5 g/L胰蛋白酶相结合的消化法培养山羊乳腺上皮细胞,2~3 d细胞铺满单层,形态如铺路石。所得细胞再经0.5 g/L胰蛋白酶/0.2 g/L EDTA纯化3~4次,得到比较纯净的山羊乳腺上皮细胞。细胞鉴定结果表明,所得到的细胞角蛋白染色呈阳性,阳性率大于90%,波形蛋白染色呈阴性,具有典型的上皮细胞特性。消化法适用于山羊乳腺上皮细胞的体外培养。     

黄芪多糖对H_2O_2诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤及凋亡的影响

[目的]本试验旨在研究黄芪多糖(APS)对H_2O_2诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡、氧化损伤及相关基因、蛋白表达的影响。[方法]体外培养奶牛乳腺上皮细胞并用H_2O_2(600μmol·L~(-1),2 h)诱导建立乳腺上皮细胞氧化应激模型;试验分组:空白对照组、H_2O_2组、H_2O_2+APS组(8 mg·mL~(-1)APS)。[结果]与空白对照组相比,H_2O_2组细胞活力显著下降(P0.05);与H_2O_2组相比,H_2O_2+APS组的细胞凋亡率和细胞中的活性氧(ROS)含量均显著降低(P0.05),而超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著升高(P0.05),从而缓解H_2O_2诱导奶牛乳腺上皮的氧化损伤;此外,与H_2O_2组相比,H_2O_2+APS组凋亡基因Bax/Bcl-2 mRNA比值及Caspase-3 mRNA的表达量极显著降低(P0.01),Bax蛋白表达水平显著降低(P0.05),且APS降低了H_2O_2诱导细胞凋亡率。[结论]APS能够提高H_2O_2诱导的奶牛乳腺上皮细胞抗氧化酶活性,并减缓氧化损伤引起的奶牛乳腺上皮细胞凋亡。     

西农萨能奶山羊乳腺上皮细胞体外培养

用无菌手术法取健康的泌乳期西农萨能奶山羊的乳腺组织,用组织块法进行体外条件下的培养。基础培养液为D—MEM／F-12,含10％胎牛血清,添加EGF(0．01mg／L)、氢化可的松(1mg／L)、孕酮(1mg／L)、胰岛素-转铁蛋白-硒钠(5mg／L)、青霉素(0．05g／L)及链霉素(0．05g／L)。结果表明,获得良好的山羊乳腺上皮细胞原代培养物,传代培养细胞增殖旺盛,长势良好。     

转甜味蛋白Brazzein基因乳腺特异表达载体的山羊体细胞株筛选

[目的]建立通过山羊乳汁获取甜味蛋白Brazzein的方法.[方法]将前期工作中构建的Brazzein基因山羊乳腺特异表达载体STP-pBC1进行线性化,采用脂质体法转染山羊成纤维细胞,以期获得转基因阳性细胞.[结果]采用脂质体法转染山羊成纤维细胞后,通过最适G418浓度（400 μg/ml）筛选获得转基因阳性细胞;转基因阳性细胞形态呈现梭形且核仁清晰,其生长曲线呈现正常的“S”;转基因阳性细胞经冷冻复苏后,仍呈现与冷冻前新鲜转基因细胞相似的形态和生长曲线;PCR鉴定结果表明,STP-pBC1已整合入转基因细胞的基因组中.[结论]成功获得乳腺特异的转甜味蛋白基因Brazzein的山羊成纤维细胞株.     

麦洼牦牛乳腺上皮细胞系的建立及其生物学特性

为建立麦洼牦牛乳腺上皮细胞的体外培养方法,采用组织块贴壁法及Ⅰ型胶原酶消化法,从麦洼牦牛乳腺组织中成功分离并获得纯化的乳腺上皮细胞,并利用细胞角蛋白18的免疫荧光染色对乳腺上皮细胞进行鉴定。通过细胞生长曲线、群体倍增时间、细胞接种存活率、细胞活力等生物学特性的检测,建立并鉴定麦洼牦牛乳腺上皮细胞系。结果显示,乳腺细胞形态良好,细胞接种存活率达91%,群体倍增时间26.97h,细胞生长曲线呈典型"S"型,细胞传至25代以上仍保持旺盛的增殖活力。可见,通过对细胞传代及反复冻存和复苏已成功建立麦洼牦牛乳腺上皮细胞系,获得大量的乳腺上皮细胞,使麦洼牦牛物种在细胞水平上得以保存,为建立牦牛乳腺生物反应器及泌乳调控机制研究提供基础。     

奶山羊乳腺上皮细胞系的建立

乳腺上皮细胞系的建立为乳蛋白基因表达调控机制的研究及乳腺表达载体的检测提供有利条件。本研究建立了正常培养的奶山羊乳腺上皮细胞系。利用胶原酶和透明质酸消化法从奶山羊乳腺组织中分离并获得了纯化的乳腺上皮细胞,利用细胞角蛋白18的免疫荧光染色对乳腺上皮细胞进行了鉴定。通过细胞生长曲线、群体倍增时间、细胞接种存活率、细胞活力检测等生物学性状的检测建立并鉴定了奶山羊乳腺上皮细胞系。结果表明,奶山羊乳腺上皮细胞在添加表皮生长因子、胰岛素样生长因子-1、转铁蛋白-硒钠、10%胎牛血清的DF12培养液中生长状态良好,细胞传至30代时仍保持旺盛的增殖活力。通过细胞传代及反复冻存和复苏实现了细胞系的长期保存,建立了乳腺上皮细胞系,获得了大量的乳腺上皮细胞。从而为开展奶山羊、奶牛等产奶动物乳腺生物反应器及泌乳机制的研究提供了便利条件。     

牛乳腺上皮细胞体外分离、培养和鉴定的研究

建立可用于基因打靶的乳腺上皮细胞系是乳腺生物反应器研制的重要环节,分别采用胰蛋白酶、胶原酶及其两者的混合消化液分离获得了包括少量成纤维细胞在内的原代牛乳腺上皮细胞,比较了不同消化方法的优缺点。利用Trypsin-EDTA阶段消化法在体外培养牛乳腺上皮细胞,观察了此细胞培养到第5代、10代、15代和20代时的细胞形态特征和生长特性,比较了该细胞在胶原基质和混合型基质包被培养皿中的培养效果。以乳腺腺泡上皮细胞中的细胞特征蛋白角蛋白18为标志,利用角蛋白18单克隆抗体进行了细胞免疫组化鉴定,证明分离培养细胞的上皮特性。     

小鼠乳腺上皮细胞体外原代培养方法研究进展

综述了有关于小鼠乳腺上皮细胞体外原代培养方法的研究进展,阐述了乳腺细胞培养的意义,介绍了乳腺组织原代培养的过程,并分析了所取得的研究成果。     

山羊乳腺特异性表达慢病毒载体的构建与验证

[目的]构建山羊乳腺特异性表达尿激酶原突变体的重组慢病毒载体,证明其表达的有效性。[方法]将劳氏肉瘤病毒增强子／启动子、复制缺陷型艾滋病病毒（HIV-1）的5’端长重复序列（LTR）、HIV-1ψ卫包装信号、HIVRev反应元件、山羊B-casein调控序列、pro—UKM13、△U3／3’LTR依次连接,构建乳腺特异性表达的慢病毒载体;通过体外转染人乳腺癌细胞系（MCF-7）、仓鼠卵巢细胞（CHO）和泌乳山羊乳腺注射证明其表达有效性。[结果]构建的山羊乳腺特异性表达载体酶切鉴定是正确的;利用该载体转染细胞,采用溶圈法和Westernblot检测证实了其表达的有效性;慢病毒载体注射到泌乳山羊的乳腺,在乳汁中也检测到了尿激酶原的表达。[结论]为在转基因动物的乳腺中表达尿激酶原突变体奠定了基础。     

生长抑素对大鼠乳腺斯钙素基因表达的影响

将泌乳期大鼠分为对照组、CS组和SS组,利用RT-PCR法对大鼠乳腺组织斯钙素基因进行检测,分析生长抑素对大鼠乳腺斯钙素基因表达的影响。结果表明:乳腺中有STC1表达,无STC2表达。生长抑素对泌乳期大鼠乳腺斯钙素基因表达起下调作用,半胱胺作用相反。以上结果提示生长抑素和半胱胺可能参与乳腺钙代谢的调节,且通过STC1发挥作用。     

Regulation of leptin in involution of mammary gland

Leptin,a protein hormone produced and secreted predominantly by white adipose tissue,has a critical role in the regulation and coordination of energy metabolism.Leptin is produced in the mammary gland by the fat tissue or by the mammary epithelium.In vitro study has shown that leptin triggers apoptosis in mammary epithelial cells.Mammary gland involution is characterized by extensive apoptosis of the epithelial cells.At the onset of involution,STAT3 is specifically activated.Various studies show that leptin act as a paracrine and autocrin factor to influence mammary epithelial cell proliferation and differentiation.This paper reviewed the function of leptin to the involution of mammary gland.     

microRNA在调节乳腺发育和乳腺免疫功能中的作用

miRNAs分子是除了激素之外对乳腺发育以及乳腺免疫功能进行调控的重要分子,综述了miRNAs在乳腺发育以及乳腺免疫中的最新研究进展。