棉花转录因子基因GhMYB的克隆及特征分析

从棉花中克隆了1个MYB基因,命名为GhMYB(Gen Bank No.HQ234875)。该基因c DNA全长1264bp,具有1个774 bp的开放阅读框,5'非编码区为250 bp,3'非编码区为240 bp,编码256个氨基酸,预测分子量约为28.867 k Da,等电点为8.56,推测的氨基酸序列中含有2个高度保守的SANT结构域。GhMYB基因组序列长度为1355 bp,包含2个外显子和1个内含子。氨基酸同源分析发现,GhMYB与来自可可、陆地棉和巴旦木的MYB同源性较高。亚细胞定位结果表明,GhMYB:GFP融合蛋白定位于细胞核中。SDS-PAGE电泳分析表明,p ET-28a-GhMYB最佳诱导表达条件为1.0 mmol·L-1 IPTG在37℃下诱导4 h。电子表达谱分析表明,GhMYB基因在棉铃中特异表达,在根和叶中受水涝胁迫的诱导表达。     

棉花纤维特异转录因子GhMADS9的克隆及功能初步分析

从快速伸长的纤维细胞中克隆到了一个转录因子,通过序列比对发现其具有典型的MADS-box结构域,命名为GhMADS9。进化树分析表明GhMADS9属于典型的MIKC类MADS转录因子,与在拟南芥胚中高表达的转录因子AGL15亲缘关系最近。RT-PCR和原位杂交试验表明GhMADS9在纤维细胞中特异表达。酵母单杂交试验证明GhMADS9具有转录因子激活活性。继续研究GhMADS9对下游基因的调节机制有利于更加深入地了解棉纤维发育机制。     

棉花磷胁迫响应基因GhWRKY6克隆及功能分析

【目的】提高棉花在低磷胁迫下的抗性,挖掘棉花磷胁迫相关功能基因。【方法】用生物信息学方法分析Gh WRKY6基因的结构特征和进化关系;构建基因超表达载体转化拟南芥,分析转基因拟南芥在低磷胁迫下的抗性;利用荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)分析拟南芥中磷信号途径Marker基因表达量的变化。【结果】以陆地棉cDNA为模板克隆得到Gh WRKY6基因,生物信息学分析表明该基因序列含有一个WRKY保守结构域,是WRKY家族转录因子。在低磷胁迫下,转基因拟南芥与野生型相比,种子萌发速度、主根长度、侧根数目、生物量均低于野生型,而在正常生长条件下两者并无差别。qRT-PCR分析表明GhWRKY6能够影响关键的磷转运蛋白基因的表达。【结论】GhWRKY6作为一个负调控因子参与到植物低磷胁迫响应信号途径中。     

优化TAIL-PCR方法克隆棉花抗逆相关转录因子编码基因

ABF/AREB/ABI5/DPBF类转录因子属于碱性亮氨酸类蛋白,在依赖ABA的逆境信号传导途径中起重要的作用。本研究结合该类转录因子的结构特点,利用3′RACE技术和优化的TAIL-PCR技术成功获得棉花中三个该家族成员编码基因。进一步验证结果表明两步PCR成功获得基因完整的ORF、3′UTR以及部分5′UTR序列。本研究所获基因为棉花抗逆基因工程提供了候选基因源,优化后的TAIL-PCR技术为克隆棉花中目的基因提供了一种简便高效的方法。     

棉花转录因子GhGT30基因的克隆及转录功能分析

Trihelix转录因子广泛参与植物生长发育、非生物胁迫应答等一系列生理活动。本研究根据表达序列标签(EST)电子拼接,结合cDNA末端快速扩增技术(RACE)和RT-PCR技术,从棉花中克隆了一个cDNA全长为2 210 bp的新基因,其开放读码框为2 025 bp,编码一个675氨基酸的蛋白,分子量约76.26 kD,等电点为6.21。SMART蛋白结构预测发现,该基因在N端和C端各有一个trihelix结构域,属于GT-2型trihelix转录因子,被命名为GhGT30 (GenBank登录号为JQ013098)。氨基酸序列比对显示,该蛋白和其他高等植物的GT蛋白有较高的同源性。进化树分析表明,GhGT30基因和大豆GmGT-2B基因处在同一进化树分支。拟南芥原生质体中瞬时表达分析表明,GhGT30主要定位于细胞核中。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在棉花的花、纤维(12 DPA)中的表达量明显高于根、茎、叶及胚珠(0 DPA),同时,该基因对干旱、高盐、低温及脱落酸(ABA)等处理都有一定程度的响应,推测该基因对棉花非生物胁迫的调控起重要作用。     

棉花转录因子基因GhMYBPA1的克隆及表达分析

MYB转录因子蛋白普遍存在于植物中,在生物和非生物胁迫中发挥着重要作用。为了探讨棉花MYB转录因子的功能,采用同源克隆技术,在棉花叶片组织中克隆GhMYBPA1基因,并对其进行生物信息学和不同逆境胁迫下的表达分析。结果表明,从中棉35中成功克隆得到1个新的MYB转录因子基因GhMYBPA1(基因登录位点为XM₀16869420),cDNA全长为825 bp,开放阅读框630 bp,编码210个氨基酸;生物信息学分析结果表明,GhMYBPA1蛋白分子质量为20.183 ku,N端含有2个MYB的DNA保守结合域,属于R2R3-MYB型转录因子;氨基酸同源分析发现,GhMYBPA1蛋白与来自亚洲棉GaMYB12-like同源性较高;qRT-PCR分析结果表明,GhMYBPA1在棉花根、茎、叶、花中均有表达,花中相对表达量最高,其次是叶;逆境胁迫分析表明,在受到高盐、低温和干旱处理诱导时,GhMYBPA1基因的表达量均发生了变化,推测GhMYBPA1可能在棉花非生物胁迫过程中起重要的调控作用。研究结果可为进一步开展GhMYBPA1基因功能研究奠定理论基础。     

转GHABF4转录因子棉花植株的耐盐性研究

AREB/ABFs转录因子家族基因主要参与干旱、高盐、低温等胁迫应答反应。为了获得具有较高耐盐水平的棉花新种质材料,通过农杆菌介导法将耐盐转录因子基因(GHABF4)导入陆地棉中棉35中,通过对转化植株的卡那霉素初步筛选及T1、T2、T3目的基因PCR的分子检测,获得T3转基因棉花纯合系。通过盐胁迫试验对5个T3转基因棉花株系和非转基因棉花对照进行耐盐性分析。结果表明,在200 mmol/L Na Cl胁迫下,与非转基因对照相比,5个转基因棉花株系株高提高2.5~4.4 cm,地上部分的鲜质量增加3.6%~11.8%;且抗氧化物酶SOD、POD、CAT活性以及叶绿素含量提高。在盐胁迫条件下,转GHABF4基因棉花表现出优良的生长和生理优势,转GHABF4基因能够提高棉花的抗盐能力。     

棉花GhCO基因的克隆与表达分析

以中棉所36均一化全长cDNA文库为基础,利用RT-PCR技术从棉花中克隆了一个新的CO蛋白基因,命名为GhCO(GenBank:HM006910)。GhCO cDNA的ORF全长为1017 bp,编码338个氨基酸,含有一个CCT域和两个BBOX域。序列比较分析结果表明,GhCO蛋白与蓖麻RcCO、芒果MiCO具有较高的同源性,是棉花CO蛋白家族中的新成员。QRT-PCR结果表明,GhCO在棉花的花、蕾、胚珠等均有表达,而且在蕾和花中优势表达。GhCO在花芽分化形态出现以前就已经高调表达,推测可能与棉花的花芽分化有关。AtCO已经证明在花发育过程中对开花时间起正向调节因子的作用,推测GhCO蛋白在花发育过程中可能起重要作用。因此,构建了pBIGhCO过量表达载体,为进一步研究GhCO的功能奠定了重要的基础。     

野生大豆转录因子GsNAC20基因的分离及胁迫耐性分析

NAC (NAM, ATAF1/2, CUC2)转录因子作为一类新型转录因子已成为非生物胁迫基因工程领域的研究热点。本研究以野生大豆(Glycine soja)为材料,利用酵母单杂交的方法筛选到一个能够与MYB1AT元件(核心序列为AAACCA)结合的转录因子基因,该基因与大豆NAC20 (EU440353.1)基因具有99%的相似性,命名为GsNAC20。GsNAC20蛋白含有典型的NAC结构域和转录激活区。酵母试验表明,GsNAC20转录因子能够与耐逆相关顺式元件MYB1AT特异结合,但不具有自激活功能。细胞定位分析证明该基因位于细胞核中,符合转录因子的特征。GsNAC20能够响应高盐、干旱和低温胁迫,并且在根和叶中具有不同的表达模式。超量表达GsNAC20基因的拟南芥对盐胁迫的敏感性提高。以上结果表明GsNAC20参与植物非生物胁迫反应过程,该基因在非生物胁迫基因工程研究领域具有良好的理论研究和实际应用价值。     

棉纤维发育相关转录因子的研究进展

 转录因子在棉纤维细胞分化发育过程中起重要的调节作用。近年来已经有多个与棉纤维发育相关的转录因子被研究报道,主要包括MYB、HD-ZIP、MADS、TCP等家族成员,其中研究最为广泛的为MYB类转录因子。GL1类的MYB转录因子和MIXTA类的MYB转录因子通过不同的调控方式参与对棉纤维细胞发育的调控。对这些转录因子的深入研究,对于揭示棉纤维细胞分化发育的分子机理具有重要的意义。本文就这方面的研究进展作一简要概述。     

棉花微管结合蛋白基因GhMAP1-LC3的克隆与表达分析

应用RT-PCR从陆地棉(Gossypium hirsutum L.)石远321开花当天胚珠中分离到一个553 bp的片段,含有一个360 bp的开放读码框,推导的氨基酸序列（119个氨基酸）与水稻、拟南芥的MAP1-LC3 (Microtubule-associated Protein 1-Light Chain3)分别具有94%与90%的同源性,由此推测该基因为编码棉花微管结合蛋白基因家族的一     

陆地棉GhERF8基因的克隆与表达分析

 乙烯响应元件结合因子（Ethylene-responsive element-binding factor,ERF）是植物中最大的转录因子家族之一。本研究以棉花叶片cDNA文库为基础,从陆地棉中棉所10号中克隆得到一个新的ERF基因,命名为GhERF8（GenBank：JN656957）。该基因编码265个氨基酸,蛋白序列中包含一个AP2保守结构域。采用荧光定量PCR（RT-PCR）的方法,对GhERF8基因在棉株不同生育时期叶片和不同组织中的表达水平进行了定量分析。结果表明,GhERF8基因在各组织中均有表达,但在成熟后期的叶片中表达量最高。GhERF8表达量与叶片衰老过程中叶绿素含量出现相反的变化趋势,推测GhERF8可能与叶片衰老有一定关系。在乙烯利和茉莉酸处理下GhERF8基因在叶片中上调表达,而在脱落酸处理下GhERF8表达量无显著变化,推测GhERF8可能处于乙烯和茉莉酸信号转导网络中,且表达途径为非ABA依赖途径。     

一个陆地棉类烯醇酶基因的克隆及其表达分析

 采用改良的CTAB法提取陆地棉总RNA,运用RT-PCR技术首次克隆了陆地棉类烯醇酶基因的CDS序列,该基因已经在GenBank上登录,登录号为 EU169604,其开放阅读框为1338 bp,编码445个氨基酸残基。对其序列和进化分析表明,陆地棉烯醇酶基因与其它植物中的烯醇酶基因有较高的相似性,该基因在进化过程中是相当保守的。半定量RT-PCR表达分析结果显示该基因在陆地棉的叶、根、茎中均有表达,但在根中的表达量高于叶和茎。     

棉花抗坏血酸过氧化物酶基因GhAPX的克隆及耐冷性初步鉴定

抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)是活性氧H2O2的清除剂,对抵抗植物逆境发挥着重要的作用。为了探究棉花APX基因的耐冷功能,本实验应用RT-PCR和RACE技术从苗期耐冷型棉花品种‘新陆早25号’叶片中克隆得到一个APX基因GhAPX,并对转基因烟草的主要抗氧化酶活性和快速荧光参数进行了分析。结果表明,该基因c DNA全长1763 bp,开放阅读框1137 bp,编码379个氨基酸。Blastx比对表明该基因与已克隆的棉花气孔APX相似性最高,达99%。进化分析表明该基因与刚毛怪柳关系较近,与拟南芥(AtAPX)和小麦(TaAPX)关系较远。蛋白质结构分析显示该基因属于植物过氧化物酶基因家族,亚细胞定位结果显示该蛋白位于叶绿体中。实验成功构建了植物表达载体PZP35S-GhAPX。转基因研究发现,转GhAPX基因会提高烟草的POD和CAT活性。在4℃冷害条件下,转基因烟草的POD和CAT活性及Fv/Fm和pI均大于野生(对照)株,且下降幅度和速度均小于野生植株,而SOD活性在转基因和野生植株间差异不大,初步推测GhAPX基因可以提高棉花幼苗的低温冷害抵抗力。本研究为揭示GhAPX基因的功能及其与棉花耐冷性的关系提供了理论参考。     

陆地棉转录因子GhNAC78基因的特征及功能分析

本实验室从陆地棉中克隆得到GhNAC78,分析了其基因特征及功能。该基因cDNA全长为937 bp,开放阅读框为876bp,编码291个氨基酸,隶属于NAM转录因子亚家族。体外转录激活实验表明,GhNAC78具有转录激活活性。上游启动子区1537 bp序列的生物信息学分析可知其包含多种激素、胁迫和光响应元件,表明GhNAC78广泛地参与植物生长发育和胁迫响应的调控。荧光定量结果显示,GhNAC78在棉花叶片衰老过程中高调表达,推测其参与叶片衰老的调控。     

南疆海岛棉和陆地棉棉铃发育过程中的生理生化特征

在大田条件下,以南疆主栽海岛棉和陆地棉为材料,研究棉铃发育过程中棉铃各部位的生理生化特征。结果表明,海岛棉铃壳叶绿素a、叶绿素b含量极显著高于陆地棉,类胡萝卜素含量极显著低于陆地棉。海岛棉铃壳、种子、纤维中可溶性蛋白质含量、过氧化氢酶活性和抗坏血酸含量明显高于陆地棉,且纤维中过氧化物酶活性也高于陆地棉,铃壳中丙二醛含量低于陆地棉。海岛棉与陆地棉发育棉铃各部位生理生化的异质性是棉铃铃期、铃重、衣分和纤维长度、伸长率、比强度等种间差异的内在表现。