两个海区栉孔扇贝感染AVNV的比较分析

急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)是一种能导致栉孔扇贝大规模死亡的DNA病毒,研究通过检测不同养殖模式和不同苗种来源的栉孔扇贝样本携带AVNV的情况,以寻找合理的养殖模式和苗种,降低疾病的发生。以扇贝单一养殖的青岛流清河海区和贝藻间养的荣成桑沟湾海区为采样点,每月(2010年3月—2011年4月)定期采集2个海区野生苗养殖和人工苗养殖的栉孔扇贝样品各10只,共得到扇贝样本480只。取扇贝外套膜组织,提取DNA,采用巢式PCR检测扇贝感染AVNV的情况,并对2个海区2类栉孔扇贝AVNV感染率进行比较。结果显示,在2个海区的2类栉孔扇贝体内均检测到AVNV,流清河海区野生苗和人工苗养殖栉孔扇贝AVNV感染率分别为21.1%和18.9%,桑沟湾海区2类扇贝AVNV感染率分别为11.1%和5.6%;2个海区AVNV感染扇贝均集中在7、8月份,其中,流清河海区最高可达80%,桑沟湾海区最高仅40%。研究表明,贝藻间养和选用人工苗能有效减少AVNV对养殖扇贝的感染,是控制养殖扇贝发病死亡的有效措施。     

栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒荧光定量PCR检测方法的建立和应用

根据栉孔扇贝(Chlamys farreri)急性病毒性坏死病毒(Acute viral necmbiotic virus,AVNV)的基因序列,选择保守区段,应用Beacon Designer 7.0软件设计了一对能特异性扩增90 bp片段的引物和Taq Man探针,建立并完善了AVNV荧光定量聚合酶链式反应(Huorescent quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)诊断方法.该方法在108～102病毒拷贝范围内有较好的线性关系,AVNV拷贝数(X)和循环数(G1)的相关关系为:IgX=-0.29C1+13.28(相关系数R2=0.998);检测AVNV的灵敏度为102拷贝;特异性实验表明只对AVNV基因组呈阳性反应.应用FQ-PCR对76份采自夏季发病期前后的栉孔扇贝样品进行检测,结果发现68份样品检测结果为阳性,阳性检出率为89.47%,高于普通PCR的阳性检出率(80.26%).研究结果表明,该方法快速、灵敏,特异、重复性良好且能实现AVNV的定量检测,对AVNV的快速诊断和分子流行病学的调查以及AVNV疫情监测具有重要意义.     

栉孔扇贝急性病毒性坏死症病毒cDNA文库的构建及部分序列分析

急性病毒性坏死症病毒（Acute Virus Necrobiotic Virus,AVNV）已被证实是一种对养殖栉孔扇贝（Chlamys farreri）危害极大的致病病原.本研究应用基因克隆技术对AVNV基因组进行cDNA合成、克隆,并对部分克隆进行序列分析.采用差速和蔗糖密度梯度离心法,分离纯化AVNV.用Trizol试剂抽提病毒RNA,采用随机引物和Oligo（dT）双引物法,SuperScriptⅡ反转录酶合成cDNA,并克隆于pUC118质粒上,利用蓝白斑筛选阳性克隆子,PCR法快速鉴定重组质粒.经筛选得到2个阳性克隆23^#、52^#,插入片段大小约为1200 bp和800 bp.测序结果与GenBank的比对分析显示,尚未有类似的序列报道,提示该病毒可能为一种新发现的病毒.[中国水产科学,2006,13（3）：421-425]     

栉孔扇贝急性病毒性坏死症病原人工感染研究

从发病疫区栉孔扇贝（Chlamys farreri)组织中分离出病毒和立克次体(Rickettsia organism，RO)，对健康栉孔扇贝进行人工感染。结果显示，病毒注射组死亡率为75％，病毒浸浴组死亡率为68．7％；RO注射组死亡率仅为18．7％；灭活RO注射组死亡率为31％；灭活病毒注射和空白对照组死亡率皆为12．5％；病毒注射、浸浴组与灭活病毒注射组、空白对照组死亡率有显著差异。而RO注射组与灭活RO注射组、空白对照组死亡率没有显著差异。电镜复检结果显示，发病扇贝的外套膜、鳃、消化腺组织中分布有大量病毒粒子，该病毒粒子的形态特征、病理学特征与自然海区发病扇贝中的病毒粒子特征完全一致。人工感染实验结果证明，栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(A—cute Virus Necrobiotic Virus，AVNV)是栉孔扇贝大规模死亡的直接病原。     

间接免疫荧光法检测栉孔扇贝急性病毒性坏死症病毒

用纯化栉孔扇贝(Chlamys farrei)急性病毒性坏死症病毒(AVNV)免疫兔子,以兔抗血清为一抗,荧光标记的羊抗兔抗体为二抗,采用冰冻切片技术,建立了栉孔扇贝AVNV的间接免疫荧光检测方法。用该方法分析栉孔扇贝和海湾扇贝(Argopecten irradians)体内AVNV感染强度,并对感染率进行统计。结果表明,栉孔扇贝的肾脏、肝胰腺中,AVNV阳性信号最强,呈现中度到重度感染,其AVNV感染率100％。鳃丝、性腺及闭壳肌中未检测到阳性信号。在海湾扇贝的肝胰腺及肾中AVNV的感染率也较高。提示AVNV感染扇贝的靶器官主要是肾脏、肝胰腺。对与栉孔扇贝同一海区养殖的海湾扇贝在栉孔扇贝发病期间存活率较高的原因进行了讨论。     

栉孔扇贝急性病毒性坏死症(AVND)病理学观察与分析

2000~2002年,应用光镜和电子显微技术对AVND发生期间栉孔扇贝(Chlamys farreri)各主要组织器官病理变化进行了连续观察。光镜观察显示,除生殖腺、闭壳肌外,濒死栉孔扇贝的外套膜、鳃、肾、消化腺和肠组织都有不同程度的组织病理变化。病灶主要出现在上述各器官的结缔组织以及上皮组织,病理变化表现为细胞核肿大、固缩、破裂,核染色质边缘化或空泡化,受感染细胞崩解、脱落,留下大片均质无结构的空白区域,形成凝固性坏死,结缔组织细胞质中有嗜碱性包涵体样颗粒存在。电镜观察显示,在病灶出现的组织细胞内,细胞核染色质异常凝集和边缘化、核膜周隙扩张或溶解。细胞器病理变化明显,内质网扩张,核糖体脱落,有髓鞘样小体出现;线粒体肿大、嵴融解,整个细胞出现解体现象。病变的结缔组织细胞与间质细胞细胞质中有大量直径为130~170nm、具有囊膜的球形病毒粒子存在,负染电镜观察表明,病毒囊膜表面覆有长20nm放射状纤突。病毒的发生基质在细胞质内,并被一膜性结构所包围。病毒在宿主细胞中的繁殖分为3个阶段,即病毒发生期、病毒装配期和病毒释放期。病理学观察证明,病毒感染与病理变化具有明显的相关性。     

急性病毒性坏死病毒IAP-86基因的克隆、表达及抗凋亡研究

在已经完成的栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)全基因组序列测序与分析的基础上,设计特异性引物,克隆得到了ORF86编码的杆状病毒凋亡抑制蛋白基因(IAP-86)。IAP-86基因与pET32a(+)质粒连接构建得到重组质粒pET32a-IAP86,将重组质粒转化到E.coil BL21(DE3)中,使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,SDS-PAGE检测显示表达蛋白分子量约为40 ku,经Western-blotting和质谱分析证明,该蛋白即为IAP-86融合蛋白,Co2+柱纯化后得到了纯化的IAP-86融合蛋白。将重组的IAP-86蛋白用FITC标记,荧光显微镜下观察,发现重组的IAP-86蛋白最终能够与栉孔扇贝血淋巴细胞的细胞核和细胞质结合。细胞凋亡检测实验发现,重组的IAP-86蛋白能够在一定程度上抑制栉孔扇贝血淋巴细胞凋亡,凋亡抑制率为7%。本实验应用原核表达成功得到了IAP-86蛋白,并证明IAP-86对栉孔扇贝细胞的凋亡有一定抑制作用,这为进一步研究AVNV的侵染机制提供依据。     

栉孔扇贝三倍体研究进展和展望

扇贝养殖具有食物链短、定居性强、育苗和养殖基础好、成本相对较低等特点,已成为我国沿海地区海水养殖的重要支柱产业之一。近十几年来,我国的扇贝养殖业发展迅速。１９８５年全国扇贝养殖产量只有０．６万ｔ,至１９９６年已达上百万ｔ,在养殖规模和产量上均居世界第一位。随着社会经济的迅速发展,人们对扇贝产品的需求量也越来越大。而国内外市场的不断扩大,又为扇贝养殖业的发展创造了十分有利的条件。但从整体上讲,我国扇贝养殖产量的提高主要依靠养殖规模的扩大和人力、物力的大量投入。随着养殖面积和养殖密度的不断增大以及生…     

栉孔扇贝养殖

“干贝”味道鲜美，营养丰富，是珍贵海产品，它出自栉孔扇贝，这种扇贝的养殖方法有两种：     

急性病毒性坏死病毒dUTPase基因的克隆、表达及其产物的酶学活性分析

根据已测定完成的栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)基因组序列,设计特异性引物,以提取的发病扇贝组织总DNA为模板,PCR扩增得到编码AVNV dUTPase的开放阅读框ORF074,将产物克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建表达质粒pET32a-dut。然后,将其转化至E.coli BL21(DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE检测显示,诱导表达蛋白分子量约为46 ku,与预期表达蛋白大小一致。经Western-blotting及质谱分析鉴定,所表达蛋白即为重组dUTPase。表达产物经Co²⁺柱纯化后进行酶学活性测定。结果显示,重组dUTPase能特异性催化dUTP,EDTA可以抑制dUTPase的活性,而Mg²⁺可以增强其活性。     

扇贝养殖海区浮游生物携带AVNV的荧光定量分析

为了探明养殖海区浮游生物与AVNV流行传播的关系,实验自2009年5月至11月,分别从青岛沙子口和荣成桑沟湾两个扇贝养殖海区定期采取50和300 cm两个水层水样,经25、3和0.22 μm 3个孔径的滤膜分级过滤收集3个粒径的浮游生物组分,利用荧光定量PCR技术对浮游生物携带AVNV的情况进行了定量检测。结果表明两个海区浮游生物样品均检测到AVNV,检测的AVNV数量也均在8月份达到峰值,沙子口海区每升海水中浮游生物携带4.11×10⁶拷贝的AVNV,桑沟湾海区浮游生物携带1.49×10⁵拷贝的AVNV。两个海区3个粒径浮游生物组分携带AVNV的数量从高到低依次为0.22~3 μm组分、3~ 25 μm组分和大于25 μm组分,但两个水层(50和300 cm)浮游生物携带AVNV的数量则没有显著差异。结合养殖期间扇贝摄食浮游生物的特点,研究认为,扇贝在养殖期间可能会通过滤食携带病毒的浮游饵料而感染AVNV,海区浮游生物可能是导致AVNV流行的重要传播媒介。     

应用DGGE技术研究扇贝养殖海域微型真核浮游生物多样性

为了研究扇贝养殖海区微型真核浮游生物群落多样性,明确养殖扇贝发病时期高丰度微型真核浮游生物种类,探讨微型真核浮游生物与栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)水平传播的可能关系。于2009年和2010年从青岛流清河湾扇贝养殖海区采集了9个月份的海水样品,经25和3 μm的滤膜过滤收集海水中3~25 μm的浮游生物,扩增18S rDNA可变区序列,并利用变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gelelectrophoresis,DGGE)技术对扩增序列进行分离以分析微型真核浮游生物多样性。结果表明,该养殖海区微型真核生物包括甲藻、纤毛虫、眼虫、定鞭藻、硅藻、盘蜷虫、隐藻、领鞭毛虫、变形虫和Cercozoan,其中甲藻类和纤毛类生物的最高相对丰度分别达41.0%和38.2%,是海区的优势种类。各月份DGGE谱带聚类分析结果表明,2009年6、7、8、9月份浮游生物群落组成较为相似。中肋骨条藻在扇贝发病前后均有分布。结合相关扇贝AVNV已有的研究结果,研究认为中肋骨条藻是AVNV水平传播的参与者之一,但海区中广泛分布的甲藻和纤毛虫与AVNV传播的关系还有必要进一步研究。     

不同贝龄栉孔扇贝数量性状的相关性和通径分析

为深入了解栉孔扇贝形态性状与湿重之间的关系,为栉孔扇贝选育工作中亲贝的挑选提供策略,本研究使用来自同一家系的栉孔扇贝子代324只一龄个体以及生长到二龄的230只个体的性状数据进行通径分析。性状数据包括壳长(x_1/cm),壳高(x_2/cm),壳宽(x_3/cm),湿重(y/g)。结果显示,所有形态性状和湿重之间的相关系数均达到极显著水平。其中与一龄贝湿重相关系数最大的是壳长,为0.939,与二龄贝湿重相关系数最大的是壳高,为0.808。通径分析结果显示,壳长对一龄贝湿重的直接影响最大(0.532),壳高对一龄贝湿重的直接影响最小(0.163)。壳高对二龄贝湿重的直接影响最大(0.451),壳长对二龄贝湿重的直接影响最小(0.191),决定系数与以上通径分析结果的变化趋势一致。利用多元回归的方法构建了一龄贝和二龄贝形态性状与湿重间的回归方程,一龄贝:y=–10.527+0.287x_1+0.087x_2+0.409x_3,R~2=0.926;二龄贝:y=–68.609+0.254x_1+0.719x_2+2.008x_3,R~2=0.830。本研究结果为栉孔扇贝种贝的挑选提供了理论依据。     

异源精子诱导栉孔扇贝雌核发育后代的微卫星分析

采用紫外线遗传灭活的长牡蛎精子激活栉孔扇贝卵子,6-DMAP诱导染色体加倍的方法,获得第二极体抑制型雌核发育二倍体早期胚胎。通过优化PCR反应条件,在11对栉孔扇贝和10对长牡蛎微卫星引物中共筛选出3对引物,可以同时在长牡蛎和栉孔扇贝基因组中获得稳定性,多态性较好的特异性扩增条带,其中2对引物为栉孔扇贝引物。利用筛选出的3对通用微卫星引物对雌核发育后代进行检验及遗传分析。结果表明,雌核发育个体基因完全来自于母本,后代中没有父本基因的表达;部分雌核发育后代在3个座位上发生了纯合,部分个体发生了不同程度的基因重组,3个座位上的重组率分别为40%、55%和35%。研究结果从分子水平上证实,利用遗传失活的长牡蛎精子诱导栉孔扇贝雌核发育是可行的,只进行一次第二极体抑制型雌核发育二倍体的诱导只能获得部分后代个体的基因纯合,但后代与母本具有较高的遗传同质性。     

栉孔扇贝对重金属的富集效应研究

2009年6-12月在烟台四十里湾某栉孔扇贝养殖区进行现场监测,研究结果表明,栉孔扇贝对重金属的富集有明显的选择性,对Cd的富集系数高达25 495,对铜富集系数为1 453,对铅的富集系数为258。对镉的富集与其生长周期呈显著正相关,而Cu、Pb随其生长时间的增加在体内的增加趋势并不明显。栉孔扇贝各组织中重金属Cd的含量具有明显差异,闭壳肌中Cd含量仅为内脏团中的1/5。研究发现,栉孔扇贝的主要饵料浮游植物对重金属Cd的富集效率远大于Pb、Cu,滤食浮游植物是栉孔扇贝富集重金属的主要途径。文中还对栉孔扇贝的人体消费标准进行了初步研究,给出了人体消费参考量。     

SCP3作为栉孔扇贝初级精母细胞标记分子的研究

为检验SCP3在无脊椎动物中是否可以标记特定的生殖细胞,实验利用RACE技术克隆了栉孔扇贝SCP3(Cf-SCP3)的全长cDNA序列,结果显示,其长度为1 033 bp,开放阅读框为726 bp,编码241个氨基酸。推导的氨基酸序列中包含SCP3保守的Cor1结构域和卷曲螺旋结构域。制备了Cf-SCP3地高辛标记的RNA探针和Cf-SCP3重组蛋白的多克隆抗体,采用原位杂交和免疫组织化学技术检测其细胞学定位,结果显示Cf-SCP3转录本和Cf-SCP3蛋白均特异性地定位在栉孔扇贝的初级精母细胞和未受精卵中,在精巢的其他类型细胞和卵巢中均未见表达信号。研究表明,Cf-SCP3蛋白可能与脊椎动物的SCP3蛋白一样,作为联会复合体的组成成分参与栉孔扇贝的配子发生,同时可以作为一个栉孔扇贝初级精母细胞的分子标记应用到体外诱导生殖细胞分化的研究。     

栉孔扇贝夏季大规模死亡的神经网络预测模型

根据2002年和2003年对山东荣成桑沟湾栉孔扇贝养殖海区的水温、盐度、pH、氨氮浓度、亚硝氮浓度等环境因子和扇贝血清中的蛋白浓度、酸性磷酸酶活力、碱性磷酸酶活力、超氧化物歧化酶活力和过氧化氢酶活力等免疫学指标及栉孔扇贝养殖密度和死亡率的监测数据,运用人工神经网络(artificial neurd network,ANN)的原理和误差反相传播(back propagefion,BP)网络的方法,利用MATLAB软件初步建立养殖栉孔扇贝夏季大规模死亡的BP人工神经网络预测模型.预测模型经过300次的学习训练,误差平方和由67.46下降至0.009 1.该预测模型对未参与模型构建的样本预测的结果与实际监测结果的符合率达到87.5%.首次将人工神经网络与水产动物病害死亡的预测相结合,建立的预测模型具有对数据适应能力强,可适时学习,预测结果准确等突出优点,为水产养殖动物病害死亡程度的预测提供了一个新的研究方法.