鸡胚破骨细胞的分离培养与鉴定

从18日龄鸡胚长骨（股骨和胫骨）中机械分离破骨细胞于盖玻片和骨片上培养,以建立鸡胚破骨细胞体外培养方法。结合倒置相差显微镜、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色、甲苯胺蓝染色及透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）对其形态和功能进行观察鉴定。结果表明,直接分离的细胞具有典型的破骨细胞的形态特点：属多核大细胞,TRAP染色阳性,能在骨片表面形成吸收陷窝。结论：鸡胚长骨机械分离法可获得一定数量并具有骨吸收活性的破骨细胞。     

鸡胚破骨细胞的分离培养与鉴定

从18日龄鸡胚长骨(股骨和胫骨)中机械分离破骨细胞于盖玻片和骨片上培养,以建立鸡胚破骨细胞体外培养方法.结合倒置相差显微镜、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、甲苯胺蓝染色及透射电镜(TEM)和扫描电镜(sEM)对其形态和功能进行观察鉴定.结果表明,直接分离的细胞具有典型的破骨细胞的形态特点:属多核大细胞,TRAP染色阳性,能在骨片表面形成吸收陷窝.结论:鸡胚长骨机械分离法可获得一定数量并具有骨吸收活性的破骨细胞.     

小鼠破骨细胞分离培养及鉴定

选择小鼠为试验对象,观察体外培养破骨细胞的形态学和生物学特征。采用小鼠共培养试验,结合倒置相差显微镜、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色和扫描电镜(SEM)对其形态和功能进行观察鉴定。结果表明:利用小鼠共培养试验方法得到的破骨细胞具有典型的破骨细胞的形态特点:属多核大细胞,TRAP染色阳性,能在骨片表面形成吸收陷窝。提示小鼠共培养试验能够得到一定数量具有骨吸收活性的破骨细胞。     

两种方法诱导形成的破骨细胞骨架F-actin比较

采用Wistar大鼠骨髓单核细胞及RAW264.7细胞在体外诱导分化为破骨细胞(OC),通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鉴定破骨细胞,荧光显微镜观察破骨细胞骨架F-actin,扫描电子显微镜检测骨吸收陷窝,比较两种方法诱导形成的破骨细胞细胞骨架F-actin的差异。结果表明:大鼠骨髓单核细胞诱导形成的破骨细胞数量及骨吸收活性均极显著高于RAW264.7细胞(P0.01);两种方法诱导形成的破骨细胞骨架均具有典型的F-actin环结构。证明大鼠骨髓单核细胞及RAW264.7细胞均可诱导形成破骨细胞,两者破骨细胞骨架F-actin环结构无显著差异,但大鼠骨髓单核细胞诱导形成的破骨细胞数量更多,骨吸收活性更强。     

鸡骨保护素在毕赤酵母中的分泌表达及生物学活性测定

为了在毕赤酵母中表达鸡骨保护素(chOPG),采用DNA重组技术将鸡OPG成熟肽cDNA片段插入毕赤酵母表达载体pPICZ帷糃D·2 A中,以电穿孔法转化酵母X-33,用Zeocin平板筛选阳性重组子,经甲醇诱导,实现了OPG在毕赤酵母中的分泌表达.SDS-PAGE电泳分析结果显示,表达产物存在两种形式,其相对分子质量分别为43 000和53 000,表达量约为200 mg·L-1,经免疫印迹验证,有较好的抗原性.表达产物经处理后加入到体外培养的鸡胚破骨细胞上,能显著抑制成熟破骨细胞的骨吸收活性,减少骨吸收陷窝的个数与面积.     

骨保护素对体外培养大鼠破骨细胞的影响

 【目的】探讨不同浓度骨保护素（osteoprotegerin,OPG）对破骨细胞（osteoclasts,OC）生成和活化的影响。【方法】通过成骨细胞（osteoblasts,OB）与脾细胞共培养的方法在体外诱导脾细胞转化为OC。采用形态学观察、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色计数、扫描电镜观察象牙片吸收陷窝方法检测OC的生成和活化。【结果】 随着OPG浓度（5、10、25、50、75 ng•ml-1）的增加,TRAP阳性OC数逐渐减少,各试验组与对照组比较差异均极显著（P＜0.01）;象牙片吸收陷窝的数目和面积也逐渐减少,OPG浓度为50 ng•ml-1、75 ng•ml-1时观测不到吸收陷窝。【结论】OPG通过抑制OC生成和活化,从而抑制OC的骨吸收,OPG浓度达50 ng•ml-1以上可完全阻断OC的活化。     

复方巴戟天合剂对大鼠激素性股骨头 缺血性坏死的组织学研究

目的 探讨复方巴戟天合剂对激素性股骨头缺血性坏死大鼠股骨头的组织学影响、方法SD大白鼠72 只,随机分成正常组、模型组、对照组、治疗组,每组18只〔建立大鼠激素性股骨头缺血性坏死模型,对照组、治疗组 每口给药1次,于实验后第4,8,12周分3批处死动物,取股骨头空骨陷窝、成骨细胞、破骨细胞及胶原面积进行统 计学分析〔结果空骨陷窝率模型组与正常组差异有统计学意义(P<0.01) ,治疗组与对照组较模型组差异有统计学意 义}P<0.01);治疗组与对照组成骨细胞计数较模型组差异有统计学意义}P<0.01),破骨细胞计数较模型组差异有统计 学意义(P<0.01);治疗组与对照组胶原面积百分比与模型组比较差异有统计学意义}P<0.01)〔结论复方巴戟天合剂 对激素性股骨头缺血性坏死有明显的预防和治疗作用、     

钙磷对RANKL诱导番鸭破骨细胞生成及活性的影响

分离了1~7日龄番鸭长骨骨髓细胞,与不同因子(Ⅰ组,对照;Ⅱ组,30 ng/ml sRANKL;Ⅲ组,30ng/ml sRANKL 6 mmol/L Ca 3 mmol/L P)共培养。倒置显微镜观察细胞形态,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)试剂盒进行组织化学染色,培养7 d后取象牙片用1%甲苯胺蓝染色,光镜及扫描电镜观察吸收陷窝,形态分析系统计算吸收陷窝面积。结果表明,第一次更换培养液后7 d,Ⅱ组多核OC数极显著低于对照组(P<0.01),Ⅲ组多核OC数极显著低于对照组和Ⅱ组(P<0.01)。Ⅱ组和Ⅲ组吸收陷窝数量明显多于对照组,陷窝深度明显深于对照组,陷窝面积极显著大于对照组(P<0.01),但Ⅱ、Ⅲ组陷窝面积大小差异不显著。故认为,钙磷(6 mmol/LCa 3 mmol/L P)对sRANKL诱导番鸭OC骨吸收活性无显著抑制效应,但能极显著抑制番鸭OC的生成,减少多核OC数量。     

开发一种预防和治疗骨质疏松症的功能性生菜

骨质疏松症严重威胁着人类的健康,鲑鱼降钙素是一种治疗骨质疏松的有效药,但是昂贵的价格限制了它的使用。本研究以生菜作为生物反应器来表达降钙素中生物活性较高的鲑鱼降钙素,以期通过鲜食表达降钙素的生菜达到防止或治疗骨质疏松目的,同时可大大降低生产成本。首先按植物偏爱密码子设计合成了编码鲑鱼降钙素的msCT基因,其次考虑到转基因产品安全性问题,构建植物双元表达载体p35S-2300-twinT—DNA：：pil—msCT：：noster,利用农杆菌介导进行生菜转化。经PCR和Southem blot确认得到了12株独立的转基因植株。同时RT-PCR分析表明鲑鱼降钙素在To代转基因植株中成功表达,而且表达量存在显著差异,为利用植物生物反应器生产治疗用降钙素奠定了基础。     

低钙对蛋鸭血清钙、磷及破骨细胞活性的影响

将120只600日龄产蛋山麻鸭随机分为正常日粮组、1/2石粉组和1/4石粉组,自动生化分析仪测定更换饲料前1 d及更换饲料后1、3、5周血清钙、磷水平,观察缺钙日粮对蛋鸭血清钙、磷的影响.分离山麻鸭破骨细胞(OC),在此基础上添加不同浓度钙离子(2、3、5、7 mmol·L~(-1)),倒置显微镜观察体外培养OC形态,培养1、3、5、7 d进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP),7 d后扫描电镜观察象牙片吸收陷窝.结果表明:钙缺乏可导致蛋鸭血清钙、磷水平升高,降低钙磷比例.高浓度钙和较低浓度钙显著抑制OC生成及骨吸收活性.结果说明缺钙可诱导OC生成并发挥骨吸收功能,最终导致骨代谢性疾病.     

酵母α-半乳糖苷酶组成型表达基因的重组构建及转化

用PCR方法从酿酒酵母AH109中扩增出α-半乳糖苷酶MEL1基因片段，与乙醇脱氢酶组成型启动子重组后构建成表达重组质粒pGAD-GAL,将重组质粒pGAD-GAL转化不带α-半乳糖苷酶基因的酿酒酵母后，在预先涂布有X-α-Gal的亮氨酸缺陷培养基(SD／-Leu)平板上选择到蓝色菌落，实现了α-半乳糖苷酶在酵母内的组成型表达。     

Calcitonin receptors of kidney and bone

Receptors for calcitonin, determined by activation of adenylate cyclase, were found in a distribution among zones of the kidney distinct from that of receptors for parathyroid hormone or vasopressin. Competitive binding studies showed that the receptors for calcitonin are similar in kidney and bone and that their high apparent affinity for salmon calcitonin accounts in part for the high biological potency in vivo of salmon calcitonin.     

拟南芥木糖异构酶在酿酒酵母的成功表达

酿酒酵母是工业上乙醇发酵的首选目标微生物,但是不能代谢木糖等五碳糖.通过导入外源木糖异构酶基因,可以赋予酵母利用木糖的能力.但是长期的研究发现很难将细菌木糖异构酶转入酿酒酵母得到活性表达.研究成功的在酿酒酵母里表达了拟南芥木糖异构酶,其活性可达到0.51 U/(mg·protein).拟南芥木糖异构酶与成功在酵母里表达的真菌木糖异构酶相比更加耐受木糖醇抑制(Ki=13.21 mM).本研究为改善酵母利用木糖提供了新的可用的木糖异构酶.     

毕赤酵母分泌表达SAMS及表达产物活性分析

[目的]利用毕赤酵母分泌表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）。[方法]以酿酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）基因组DNA为模板,通过PCR扩增出S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因2（sam2）,构建重组毕赤酵母（Pichia pastoris）表达载体pPIC9Ks-am2,转化毕赤酵母GS115,以甲醇诱导表达分泌蛋白SAM合成酶,并用HPLC测定重组蛋白的酶活力。[结果]经SDS-PAGE鉴定重组蛋白分子量约50kD,比理论值42.5 kD稍大,可能是分泌过程中糖基化等加工造成。体外酶促反应结果显示,伴随甲醇诱导及初步纯化过程的进行,蛋白活力逐步提高,纯化后比活力为61.48 U/mg。[结论]该研究首次实现了SAM合成酶的胞外表达,为开发和建立体外酶促法生产SAM工艺奠定了基础。     

Expression, Glycosylation, and Secretion of an Aspergillus Glucoamylase by Saccharomyces cerevisiae

A strain of Saccharomyces cerevisiae capable of simultaneous hydrolysis and fermentation of highly polymerized starch oligosaccharides was constructed. The Aspergillus awamori glucoamylase enzyme, form GAI, was expressed in Saccharomyces cerevisiae by means of the promoter and termination regions from a yeast enolase gene. Yeast transformed with plasmids containing an intron-free recombinant glucoamylase gene efficiently secreted glucoamylase into the medium, permitting growth of the transformants on starch as the sole carbon source. The natural leader sequence of the precursor of glucoamylase (preglucoamylase) was processed correctly by yeast, and the secreted enzyme was glycosylated through both N- and O-linkages at levels comparable to the native Aspergillus enzyme. The data provide evidence for the utility of yeast as an organism for the production, glycosylation, and secretion of heterologous proteins.     

酿酒酵母和异常汉逊酵母在酿酒过程中的相互作用

[目的]探究酿酒酵母与异常汉逊酵母在半固态白酒酿造过程中的相互作用。[方法]在白酒酿造过程中,通过对微生物纯培养和混合培养过程中微生物数目变化、理化指标变化来探究酿酒酵母与异常汉逊酵母间的相互作用。[结果]在酿酒酵母、异常汉逊酵母共培养过程中,异常汉逊酵母经过24 h短暂生长后迅速衰亡;对可能引起异常汉逊酵母衰亡的因子包括碳源、酒精度、p H、酵母无细胞滤液的初步研究,发现在酿酒酵母无细胞滤液和混合酵母无细胞滤液中,异常汉逊酵母生长受到明显抑制而酿酒酵母生长正常。[结论]异常汉逊酵母和酿酒酵母共培养时,异常汉逊酵母的生长受到明显抑制,酿酒酵母的代谢产物是抑制其生长的主要原因。     

耐盐基因Hal1的克隆及表达载体的构建

以酵母菌株BWG1-7A基因组DNA为模板,利用PCR方法,扩增出耐盐基因Hal1,测序表明该基因全长为885个核苷酸,与已发表的序列NC_001148比较,同源性99．3％。将该基因插入表达载体pYES2的BamHI和EcoRI酶切位点之间。构建表达载体pYES2-Hal1,序列测定完全正确,为植物表达载体的构建打下基础。     

Yeast RNA polymerase II genes: isolation with antibody probes

Genes encoding yeast RNA polymerase II subunits were cloned. Efficient isolation of these genes was accomplished by probing a phage lambda gt11 recombinant DNA expression library with polyvalent antibodies directed against purified yeast RNA polymerase II. The identity of genes that specify the largest RNA polymerase II subunits, the 220,000- and 150,000-dalton polypeptides, was confirmed by competitive radioimmune assay. Both of these genes exist in single copy in the yeast Saccharomyces cerevisiae.     

植物乳杆菌Saccharomyces cerevisiae P13对大黄鱼的促生长作用研究

[目的]研究植物乳杆菌Saccharomyces cerevisiae P13对大黄鱼生长和抗病能力的影响.[方法]用合0、104、106、108、1010cfu/kg植物乳杆菌Saccharomyces cerevisiae P13含量的饲料喂养大黄鱼4周后,测定大黄鱼的体重增长率、饲料转化率和感染病菌后的存活率.[结果]大黄鱼后肠中的Saccharomyces cerevisiae P13菌数量在喂食过程中显著增加,含106～1010 cfu/kg Saccharomyces cerevisiae P13的配方饲料明显促进了大黄鱼的体重增长率和摄食率.喂食含106～ 1010cfu/kg Saccharomyces cerevisiae P13的配方饲料后大黄鱼对Streptococcus sp.的抵抗力明显增强.[结论]植物乳杆菌Saccharomyces cerevisiae P13能促进大黄鱼生长,并增强大黄鱼的抗病力.     

原生质体融合法选育酵母菌株酿造低甲醇高总酯蒸馏酒

[目的]选育酿造低甲醇高总酯蒸馏酒的酿酒酵母菌株.[方法]利用原生质体融合技术,对低甲醇酿酒酵母与高总酯酿酒酵母进行融合.[结果]选育出的酵母菌种酿造蒸馏酒中的相对甲醇含量为145.31 mg/L,比初始低甲醇菌株降低了22.8％,总酯含量为0.79g／L,增加了83.7％.[结论]原生质体融合法成功选育出低甲醇高总酯的酿酒酵母菌株.