山羊血清中CD58间接竞争ELISA检测方法的建立

【目的】制备抗CD58单克隆抗体,在此基础上建立可用于定量检测山羊血清中CD58含量的间接竞争ELISA方法。【方法】以纯化的CD58蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞融合技术制备抗CD58单抗,并对其特异性进行鉴定;在此基础上,建立CD58间接竞争ELISA检测方法,对不同生理时期山羊血清中CD58的含量进行检测。【结果】筛选出1株稳定分泌抗CD58单克隆抗体的杂交瘤细胞株G6;玫瑰花环抑制试验和Western-blotting试验表明,制备的细胞株能分泌针对CD58的特异性单克隆抗体;对间接竞争ELISA方法的反应条件进行优化后,建立了检测CD58的间接竞争ELISA方法,该方法最适可测范围为10~1000000 ng/mL,理论最低检测限为3.087 ng/mL,批内和批间平均变异系数分别为3.50%和5.22%;用建立的方法检测未发情和发情山羊血清中CD58含量分别为(32.160±3.69)和(35.929±3.08)μg/mL,怀孕山羊血清中CD58含量为(61.564±5.10)μg/mL。【结论】建立了山羊血清中CD58间接竞争ELISA检测方法,该方法敏感、特异,具有良好的重复性;对不同生理时期山羊血清中CD58含量的检测表明,怀孕山羊血清中CD58含量显著高于未发情和发情山羊。     

猪血清中游离CD2对红细胞的溶解作用

猪血清中加入红细胞(RBC)后观察溶血的结果表明,正常猪血清对绵羊、山羊、牛、马、家兔、豚鼠及鸡RBC的溶血指数分别为72.10±22.84％,84.87±22.26％,7.66±4.77％,66.60±19.56％,16.40±7.40％,86.59±15.29％,88.45±26.76％;对同种RBC无溶解作用或具微弱的溶解作用。根据猪血清对RBC的溶解作用,经绵羊红细胞(SRBC)吸收或加入SRBC CD_(58)(淋巴细胞功能相关抗原-3,LFA-3)竞争结合后即显著降低或消失,提出了猪血清溶解RBC的作用与血清中游离CD_2的存在有关的论断。     

CD58、雌酮及孕酮对附植早期山羊EML的体外活化

研究了CD58，雌酮及孕酮对附植早期山羊子宫内膜淋巴细胞（EML）体外活化作用的影响，结果表明，山羊红细胞源性CD58（总玫瑰花结形成抑制率为58．89％）能以剂量依赖方式促进妊娠16，17及20d山羊EML的体外活化，极低浓度的雌酮（40pg/mL)对妊娠16d山羊EML表现极显著的活化作用，对妊娠17d 山羊EML只表现微弱的激活作用，对妊娠20d山羊EML的激活作用不明显，生理水平的孕酮（2．5－10ng/mL)单独作用时，能以剂量依赖方式显著促进妊娠20d山羊EML的体外活化。     

CD58抗体的制备及其检测方法的建立

【目的】建立CD58特异性抗体的制备方法,及检测CD58抗体的间接ELISA方法。【方法】用CD58混合弗氏佐剂和兔淋巴细胞吸附CD58的方法免疫家兔获取CD58的抗体,双向免疫扩散试验检测抗体特异性,间接ELISA检测抗体水平。【结果】两种方法都能够使动物机体产生免疫应答;双向免疫扩散试验证实,弗氏佐剂法获得2种抗体,淋巴细胞吸附法制备抗原可获得1种抗体;间接ELISA检测法CD58的最适包被浓度为10.0μg/mL,最佳封闭液为10 g/L明胶,辣根酶标记的羊抗兔IgG工作浓度为1∶2 000。【结论】兔淋巴细胞吸附法可制备针对CD58的单一抗体,间接ELISA检测方法可以用于CD58抗体水平的检测。     

山羊C D 4基因的克隆及组织表达分析

CD4基因是质膜上的转运系统之一,为动物辅助性T细胞(TH)和部分胸腺细胞的共受体与信号传导分子,参与TCR介导的TH细胞活化和胸腺细胞分化过程.该研究首次克隆了山羊CD4基因(GenBank登录号:EU913093),并分析了该基因的组织表达情况.结果表明:所克隆的山羊CD4全长cDNA序列为1 555bp,开放阅读框(ORF)为1 368bp,编码455个氨基酸的蛋白,相对分子质量为5.05×104,等电点为9.52.山羊CD4蛋白前体由信号肽、胞外区、跨膜区和胞浆区4个部分构成.胞外区含有4个Ig样结构域,2个二硫键(C41—C109和C143—C180)及3个N糖基化位点(N231,N263和N343).氨基酸序列比对表明山羊CD4与绵羊CD4的氨基酸相似性为98%,与猪、人、兔、狗、猫、蝙蝠以及小鼠的氨基酸相似性分别为81%,74%,73%,72%,70%,70%和66%.系统发育树表明山羊CD4与绵羊和猪的CD4蛋白聚成一支,表明它们有较近的亲缘关系,其中山羊与绵羊的亲缘关系最近,而与狗、蝙蝠、兔、人和小鼠的亲缘关系相对较远.实时荧光定量PCR分析发现,CD4在山羊淋巴中的表达量最高,在睾丸中表达量较低,表明山羊CD4是一种免疫分子.     

天然LFA-3对于猪血清溶血作用和猪PBMC Et花环的影响

根据解离、吸收猪血清能够阻止正常猪血清对SRBC的破坏作用和猪PBMCE_1花环的形成,推断正常猪血清中存在天然的LFA—3,并从天然LFA—3与游离CD_2和膜CD_2的可能关系中提出了T淋巴细胞激活中游离CD_2调控途径的设想。     

兔病毒性出血症、巴氏杆菌病二联蜂胶灭活苗的研制

应用兔出血症病毒(RHDV)和巴氏杆菌(Pm)联合研制而成的蜂胶佐剂灭活苗,用 1 mL 免疫试验兔,免疫后第 5d,对 RHDV 保护率达 100%(5/5);免疫后第 14d,对巴氏杆菌的保护率达 100%(4/4),第 7d 即产生较强的免疫力。T 细胞总玫瑰花环形成率(Et率)、活性玫瑰花环形成率(Ea率)的测定结果表明:蜂胶具有提高机体细胞免疫功能的作用;通过 HI 法监测兔病毒性出血症抗体水平,结果表明:蜂胶苗产生抗体时间较早,第 7d 抗体效价可达到较高水平(26.8),第 21 d 达到高峰(28.8)。     

绵羊CD58基因的克隆与原核表达

通过对猪、绵羊CD58mRNA序列比对,设计出绵羊CD58的特异性引物,应用反转录PCR技术从绵羊淋巴细胞mRNA中扩增出绵羊CD58基因,将该基因克隆到原核表达载体pGEX4-1中进行原核表达.结果表明:克隆出的绵羊CD58cDNA长807bp,其中包含了开放式阅读框;该基因在大肠杆菌中进行表达,SDS-PAGE电泳在53ku处能观察到特异表达的融合蛋白,产物通过Western-blot检测证实,可以被CD58单克隆抗体识别.     

猪CD86 mRNA定量检测方法的建立

用RT-PCR技术从猪肺泡巨噬细胞中扩增和克隆了猪CD86基因部分片段,经测序鉴定后,用反向PCR技术构建了CD86的缺失竞争cDNA分子。通过竞争PCR方法,建立了CD86标准竞争曲线,并得到其直线回归方程。本方法操作简单,特异性和敏感性高,可用于猪CD86 mRNA水平的定量检测。     

硒对山羊细胞免疫功能的影响

【目的】探讨硒对山羊细胞免疫功能的影响。【方法】12只试验羊随机分为4组,分别灌服0.3,0.5和0.7 mg/kg的硒以及1 mL/kg的蒸馏水,每周1次,连续3周,检测硒对山羊外周血单个核细胞(Peripheral bloodmononuclear cell,PBMC)的活化作用。无菌分离未服硒山羊PBMC,分别加入4,8,12和16μg/mL亚硒酸钠进行体外培养,检测硒在体外对PBMC的活化作用及其分泌IL-2的影响。【结果】山羊灌服0.7 mg/kg硒2周后及灌服0.5mg/kg硒3周后,其PBMC对PHA刺激的反应性显著提高。8~16μg/mL亚硒酸钠在体外培养中可显著促进山羊PBMC的活化,且呈剂量依赖关系,4μg/mL亚硒酸钠对PBMC的活化作用较弱,与对照组间差异不显著;山羊PB-MC体外培养时,加入8~12μg/mL亚硒酸钠可显著促进山羊PBMC的IL-2分泌,4和16μg/mL亚硒酸钠虽能诱导PBMC分泌IL-2,但与对照组差异不显著。【结论】山羊灌服一定量的硒,可显著提高其免疫细胞对抗原刺激的反应性。亚硒酸钠在一定质量浓度范围内可显著促进山羊PBMC的活化,且能促进其IL-2分泌。     

CD58对猪PBMC转化的作用

应用ＭＴＴ比色法,测定了由ＳＲＢＣ膜及ＰＲＢＣ膜提取的ＣＤ５８对猪ＰＢＭＣ转化的影响。结果证明,两种ＣＤ５８成分均能显著提高ＰＨＡ－Ｐ对ＰＢＭＣ的激活作用（Ｐ＜０．０１或Ｐ＜０．０５）,单独应用也表现出对ＰＢＭＣ的活化效应,且上述作用具有剂量依赖性。ＣＤ５８浓度达２．５ｇ·Ｌ－１时作用最强（Ｐ＜０．０５）,超过该浓度则活化作用减弱,其作用的规律与ＲＢＣ一致。比较分析表明,猪源ＣＤ５８在最佳剂量时,单独刺激作用或对ＰＨＡ－Ｐ诱导的ＰＢＭＣ转化的协同作用均显著大于绵羊源ＣＤ５８（Ｐ＜０．０５）,ＰＲＢＣ的协同刺激作用也大于ＳＲＢＣ．     

CD58对猪PBMC分泌IL-2的作用

应用ＭＴＴ比色法,以Ｃ５７ＢＬ／６系小鼠脾细胞作为测定细胞,检测了ＳＲＢＣ和ＰＲＢＣ及自其表面提取的ＣＤ５８对猪ＰＢＭＣ分泌ＩＬ－２的作用,结果表明,上述ＲＢＣ和ＣＤ５８对ＰＨＡ－Ｐ诱导的猪ＰＢＭＣ分泌ＩＬ－２具有显著或极显著的协同作用（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１）,单独作用也可引起猪ＲＢＭＣ分泌ＩＬ－２,其协同或单独诱导作用均具有剂量依赖性。同时证明来自猪和绵羊的ＲＢＣ及ＣＤ５８的上述作用间无显著差异（Ｐ＞０．０５）。提出ＣＤ５８对猪ＰＢＭＣ的活化与特异性活化机制相似,依赖于ＩＬ－２基因点的激活。     

血小板对体外培养的猪PBMC增殖反应和IL－2分泌的影响

本实验通过采取１０头猪的血液，经３０次实验探讨了自体和异体血小板（ＰＬ）对体外培养的猪外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）增殖反应和ＩＬ一２分泌的影响。证明了ＰＬ对猪ＰＢＭＣ的增殖反应和ＩＬ一２分泌均有增强作用。同时也比较了ＰＬ和红细胞（ＲＢＣ）对淋巴细胞的活化作用。并初步探讨了ＰＬ对淋巴细胞激活作用的机制。     

血小板对体外培养的猪PBMC增殖反应和IL—2分泌的影响

本实验通过采取１０头猪的血液，经３０次实验探讨了自体和异体血小板（ＰＬ）对体外培养的猪外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）增殖反应和ＩＬ－２分泌的影响。证明了ＰＬ对猪ＰＢＭＣ的增殖的反应和ＩＬ－２分泌均有增强作用。同时也比较了ＰＬ和红细胞（ＲＢＣ）对淋巴细胞的活化作用。并初步探讨了ＰＬ对淋巴细胞激活作用的机制。     

猪CD151重组抗原表达及其免疫血清的PRRSV感染抑制作用

用RT-PCR从猪巨噬细胞中扩增CD151胞外区编码序列,将其插入含细胞毒性T细胞相关抗原4胞外区序列的表达载体,重组载体转化大肠杆菌,SDS-PAGE检测重组蛋白表达;用包涵体纯化和尿素变性与复性法获得可溶性蛋白,纯化蛋白免疫小鼠,ELISA测定免疫血清抗体效价,Western-blot验证免疫血清特异性;以处理细胞或处理病毒方式,用免疫血清进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染抑制试验。结果表明:重组菌表达预期的32ku重组蛋白,获得的可溶性重组蛋白纯度较高;免疫血清抗体效价达1∶170 000,在猪巨噬细胞中能检测到预期的29ku蛋白,能抑制PRRSV感染MARC-145细胞,但有毒株差异性,处理病毒的感染抑制作用较强。结果提示猪CD151免疫血清能以结合细胞和结合病毒方式抑制PRRSV感染。     

CD58及雌酮对妊娠早期山羊EML分泌IL—2及IL—4的影响

将妊娠17d山羊子宫内膜淋巴细胞(EML)放入含不同剂量PHA-P,CD58和雌酮的介质中进行体外培养,并分别用生物学方法和双抗体夹心ELISA法测定培养上清液中IL-2和IL-4的水平。结果表明,CD58和雌酮处理组EML分泌的IL-2水平低,与细胞对照组差异不显著,并显著低于PHA-P处理组。3个浓度CD58处理组IL-4分泌水平高达5.40～6.36ng/mL,高浓度雌酮处理组IL-4分泌量也达到4.77ng/mL,与细胞对照组差异均极显著,而且CD58能以剂量依赖方式促进EML对IL-4的分泌。     

福建大洋人工草地放牧羊补饲矿物质添加剂效果观察

根据大洋人工草地牧草的矿物质元素的含量和放牧羊矿物质元素需要量配制含有8种元素的矿物质添加剂,对放牧的罗姆尼羊和四川麻羊进行补饲试验,结果表明,2种羊的平均日增重、Hb、TSP和血清中Co、P元素的含量试验组都显著高于对照组(P<0.05),四川麻羊全血GSH-PX试验组显著高于对照组,罗姆尼羊血清中Mn、K元素的含量试验组显著高于对照组(p<0.05),2种羊的RBC、PCV、血糖、CP、GSH-PX(罗姆尼羊),以及血液中Sc、Ca、Na、Mg,Mn(四川麻羊)试验组均高于对照组,但差异都不显著,(p>0.05)。