VvFT和VvTFL1A基因在葡萄花发育中的表达特性研究

为分析''香妃’葡萄花发育中VvFT和VvTFL1A基因的功能,利用RT-PCR、原位杂交以及酵母双杂等方法研究其在葡萄不同器官、花发育中的功能和基因间的互作方式。结果显示:VvFT与VvTFL1A基因在不同器官中的表达不同,VvFT基因不但可以在花序中生成,而且参与了花发育的整个过程;VvTFL1A基因对花器官的发育影响不大。表明这2个基因在花发育中的作用可能相反。同时酵母双杂的试验表明VvFT和VvTFL1A蛋白都与VvFD蛋白产生互作,并且VvFT与VvFD蛋白之间的互作要强于VvTFL1A与VvFD蛋白,说明VvFT与VvTFL1A基因所起的功能可能都与VvFD有关。     

Tbx5基因在牙鲆变态初期的表达

鲽形目鱼类仔鱼经过变态后形成眼睛和偶鳍等器官左右不对称的稚鱼。Tbx家族成员参与脊椎动物心脏、肢体和眼等器官的发育,而Tbx基因与鲽形目鱼类变态的关系目前尚无报道。运用扫描电镜和软硬骨染色等方法对出膜后2 d（变态早期）和26 d（变态前期）的牙鲆仔鱼的形态进行观察,牙鲆出膜后2 d胸鳍原基出现,出膜后26 d胸鳍发育成熟,而在出膜后26 d胸鳍和腹鳍仍左右对称。我们克隆了牙鲆Tbx5基因的CDS序列,该序列编码的多肽具有部分T-box保守结构域,与斑马鱼Tbx5同源性高达93%。系统进化分析显示：这段CDS序列与硬骨鱼的Tbx5基因聚为一支,但与四足动物Tbx5相分离。整体原位杂交显示出膜后26 d的牙鲆仔鱼中,Tbx5基因不仅在胸鳍、眼背侧、脊柱和尿囊表达,且在胸鳍和眼背侧的表达呈现左右不对称,左侧面（有眼侧）的表达量均高于右侧面（无眼侧）的表达量。综上结果显示,牙鲆Tbx5基因可能参与了变态过程中眼睛与胸鳍左右不对称的形成。     

牙鲆ras-2基因cDNA全长的克隆和变态时期的表达分析

Ras主要参与表皮生长因子家族调控细胞分裂的信号通路。采用末端快速扩增法获得了牙鲆(Paralichthys olivaceus)ras-2基因全长2 384 bp cDNA序列,该序列编码187个氨基酸,含有switchⅠ、switchⅡ、P loop、CAAX box等Ras家族的结构特征,与川鲽(Paralichthys olivaceus)ras-2氨基酸序列相似性最高(96.3%)。定量RT PCR检测显示ras-2基因在牙鲆成体的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、鳃、肠、肌肉、鳍条和皮肤组织均有不同程度的表达,其中鳍条表达量最高,肌肉的表达量最低;在牙鲆变态前和变态初相对表达量较高,随着变态进行,表达水平显著降低。牙鲆变态阶段的RNA整体原位杂交结果显示ras-2基因主要在鳍条、眼眶周围、颌、鳃、鼻孔、侧线等部位的表皮组织中表达,变态前在鳍褶和体侧线表达信号最强,变态阶段E期的信号稍微减弱,主要分布在支鳍骨和鳃,变态高峰期（F期和G期）信号主要集中在支鳍骨、鳃和颌,H期表达信号主要集中在鳃和支鳍骨。ras-2基因表达式型表明其可以通过调控细胞分裂的方式,参与牙鲆变态过程中眼睛移动、冠状幼鳍发育、侧线发育等多种器官的发育调控。     

TRIM8基因在小鼠组织和早期胚胎中的表达及其功能初探

【目的】研究TRIM8基因在小鼠组织和早期胚胎中的表达情况及其沉默后对早期胚胎体外发育的影响。【方法】采用RT-PCR、免疫印迹分别检测TRIM8基因及其编码的蛋白在小鼠不同组织（心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、肌肉、子宫、卵巢和睾丸）中的表达情况,采用免疫组化技术对TRIM8在卵巢中进行定位。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、免疫印迹法检测TRIM8基因及其编码的蛋白在小鼠早期胚胎（1-细胞胚胎、2-细胞胚胎、4-细胞胚胎、8-细胞胚胎、桑葚胚和囊胚）中的表达规律,用免疫荧光结合激光共聚焦显微镜技术对TRIM8在早期胚胎中进行定位。利用RNA干扰技术沉默TRIM8基因,研究该基因沉默对小鼠早期胚胎体外发育的影响。【结果】TRIM8基因及其编码的蛋白在小鼠不同组织中均表达,但在子宫、卵巢和睾丸中表达水平相对较高。在卵巢中,TRIM8蛋白主要定位在不同发育阶段的卵母细胞中。TRIM8基因及其编码的蛋白在早期胚胎中均有表达,但其mRNA表达水平在1-细胞到4-细胞期胚胎中的表达水平显著高于8-细胞到囊胚期胚胎。TRIM8蛋白主要定位在不同时期胚胎的胞质中。TRIM8基因沉默组的囊胚率显著低于对照组(P<0.05)。【结论】TRIM8基因及其编码的蛋白在小鼠各组织及早期胚胎中均有表达,主要定位在早期胚胎的胞质中;沉默TRIM8基因会显著降低囊胚发育率。TRIM8可能参与调控小鼠早期胚胎的发育进程。     

鸡胚NANOG、POUV和TWIST2基因不同发育阶段表达谱分析

为了解析鸡胚发育过程中NANOG、POUV和TWIST2基因的调控作用,利用荧光定量RT-PCR方法,研究NANOG、POUV和TWIST2基因在孵化1~6d(E1~E6)的整体胚胎和孵化15和18d(E15、E18)鸡胚的大脑、心脏、肝脏和左侧大腿肌肉组织中的表达谱。结果表明,1)NANOG基因的表达水平在E2~E6整胚和E15、E18胚期的大脑、心脏、肝脏和腿肌中的表达水平均极显著低于E1时期(P0.01)。2)在鸡胚发育的整胚E1~E6和E15、E18时期的大脑、肝脏、心脏和腿肌中,POUV基因的表达水平基本呈现逐渐降低趋势,且从E3时期后均显著低于E1时期(P0.05或P0.01)。3)TWIST2基因在E1~E6整胚中的表达水平呈现逐渐增高趋势,到E6达到最高水平(P0.05或P0.01);在E15和E18时期的上述4种组织中又呈现降低趋势,但均高于E1时期。NANOG、POUV和TWIST2基因在鸡胚发育过程的调控水平存在差异,研究结果可望为鸡的育种和临床研究提供资料。     

基于mtCOII基因对山东省越冬代亚洲玉米螟不同种群的遗传结构分析

亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)是我国重要农业害虫。为了全面揭示亚洲玉米螟遗传分化以及山东省亚洲玉米螟不同种群的遗传结构,对山东省越冬代亚洲玉米螟不同种群mtCOII基因序列与来自GenBank的相关序列进行了遗传结构分析,并建立了鉴别不同遗传支系的PCR-RFLP方法。基于对340条mtCOII序列的分析结果表明:所有样本共获得62个单倍型,其中单倍型17(H17)广泛分布于各种群之间,有6个单倍体型为山东种群所特有;亚洲玉米螟分化为2个遗传支系(支系Ⅰ与支系Ⅱ);2个遗传支系均在山东省发现,但以支系I为主;亚洲玉米螟各单倍体型散布于山东省各地理种群中,缺乏明显的地理分布格局。山东亚洲玉米螟总体的单倍体型多样性指数Hd为0.695,种群内单倍型多样性指数在0.333-0.889之间;总体的核酸多样性指数π为0.00424,种群内核酸多样性指数在0.00061-0.00809之间。总群体的固定系数 Fst 为0.79421。AMOVA分析结果表明山东亚洲玉米螟的遗传分化主要来自于2个支系之间(79.42%)。构建的亚洲玉米螟2个支系鉴别方法为其生物学与生态学的进一步研究奠定了基础。     

团头鲂形态发育相关基因HoxB1b的克隆及功能研究

脊椎动物Hox族基因是一类重要的生长和发育调控基因,它编码具有螺旋—转角—螺旋结构的转录因子,能与下游靶基因特定区域结合并激活表达,从而调节脊椎动物胚胎发育过程中前后轴的形态建成。利用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了团头鲂(Megalobrama amblycephala) HoxB1b基因的全长cDNA序列,并研究了该基因的表达模式。结果表明：（1）团头鲂HoxB1b基因cDNA全长为1 479 bp,其中包括一个编码306个氨基酸残基的921 bp阅读框,聚类分析结果表明,该基因与斑马鱼、红鳍东方鲀、青鳉的相似度分别为89%、45%、40%,在脊椎动物中具有一定的保守性;（2）RT-PCR分析结果显示,HoxB1b在团头鲂胚胎发育过程的各时期均有稳定表达,但在成熟卵中未检测到该基因的表达,表明该基因属非母源表达类型。进一步的整胚原位杂交结果显示,HoxB1b在团头鲂不同时期胚胎存在明显的空间表达差异,受精后20 h（20 hours post fertilization, 20hpf)胚胎主要在后脑表达,受精后40 h（40hpf)胚胎除了在后脑表达外,在胸鳍也检测到表达;（3）HoxB1b基因在团头鲂成鱼部分组织或器官中有表达,且在雌雄鱼中基因表达量有一定差别。综上所述,团头鲂HoxB1b基因的功能与胚胎前后轴上的后脑和胸鳍发育密切相关,并在团头鲂成鱼相关组织中具有重要生理功能。     

降雨对草地土壤呼吸季节变异性的影响

利用土壤碳通量自动观测系统(LI-8150)对呼伦贝尔草原在自然降雨条件下的土壤呼吸作用进行了野外定位连续观测,研究结果表明:降雨对土壤呼吸作用存在激发效应和抑制效应,降雨发生后1-2 h内土壤呼吸速率可增加约1倍,当单次或者连续降雨累积量大于7-8 mm,或土壤含水量大于29%-30%时,降雨对土壤呼吸会产生明显的抑制作用。土壤呼吸的激发效应往往体现在次日,表现为次日平均土壤呼吸速率的显著升高;而抑制效应则在当日即可体现出来,表现为观测当日平均土壤呼吸速率的明显下降。土壤呼吸季节变异性与降雨频率和降雨强度密切相关,在降雨量一定的情况下,较低的降雨频率和较高的降雨强度会增加土壤呼吸的变异性。呼伦贝尔草甸草原而言,在生长季土壤平均含水量为16.5%时,土壤呼吸的温度敏感性值(Q₁₀)为2.12;而平均土壤含水量为26%时,Q₁₀值为2.82,明显高于前者,土壤含水量与Q₁₀之间存在正相关关系。降雨导致土壤呼吸的激发效应和抑制效应交替发生,使草地土壤呼吸的季节变异性增加,降雨格局变化必然会对草地碳循环和碳通量特征产生深刻影响。     

牛LATS1基因启动子转录调控分析

【目的】探究牛大肿瘤抑制基因1（Large tumor suppressor gene1,LATS1）的组织表达规律,并初步鉴定其启动子区关键转录因子,以期阐明其转录调控机制。【方法】利用荧光定量PCR检测LATS1基因在牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮下脂肪、背最长肌、大肠、小肠、大脑、皱胃及睾丸组织中的相对表达量。克隆牛LATS1基因启动子的全长序列,通过逐段缺失PCR技术扩增7个缺失不同片段的启动子序列,并构建其双荧光素酶报告载体,分别转染小鼠C2C12和3T3-L1细胞系,通过检测不同缺失片段荧光素酶报告载体的活性,确定LATS1启动子核心区域。使用在线软件预测牛LATS1基因启动子核心区域的关键转录因子。【结果】LATS1基因在大脑、背最长肌、大肠、皱胃、肾脏中高表达。克隆了1 950 bp的LATS1基因启动子序列及其7个逐段缺失片段序列,并成功构建了pLATS1-1783/+167、pLATS1-1449/+167、pLATS1-1149/+167、pLATS1-837/+167、pLATS1-555/+167、pLATS1-298/+167和pLATS1-123/+167双荧光素报告载体。检测到牛LATS1基因启动子核心区域位于-298/-123区域。在线软件预测到牛LATS1基因启动子核心区存在肌细胞增强因子2（MEF2A）、转录激活因子5（STAT5）、同源异型盒基因5（HOXA5）、肌细胞决定基因1（Myod1）和靶向叉头框转录因子1（FoxO1）结合位点。【结论】克隆了牛LATS1基因启动子,明确了其核心区位于-298/-123区域;MEF2A、STAT5、HOXA5、Myod1和FoxO1可能对牛LATS1基因转录活性具有重要的调控作用。     

亚东鲑基因组中Tc1-like转座子的序列歧化特征分析

根据鱼类Tc1-like超家族转座子的末端反向重复序列设计单引物,对西藏亚东鲑基因组进行PCR扩增、回收、克隆和测序,鉴定出亚东鲑两条长度为1 607 bp和1 473 bp的Tc1-like超家族转座子序列,命名为Tbt1和Tbt2。序列分析表明,亚东鲑Tbt1转座子左右两端分别存在一个196 nt和225 nt的末端反向重复序列(Inverted terminal repeats,ITR),在左右ITR中分别包含2个12 nt的亚末端反向重复序列(Subterminal inverted repeats,SIR);亚东鲑Tbt2转座子分别存在一个32 nt和31 nt短的ITR,其左右ITR中各仅包含1个12 nt的SIR。亚东鲑Tbt1、Tbt2转座子的转座酶编码区在进化过程中各已积累了4个和9个终止突变,两者均不能表达完整的转座酶。亚东鲑Tbt2与其它鲑科鱼类Tc1-like转座子的相似度低于30%,而与金鱼Tca2转座子的序列相似度高达98%,显示该转座子的获得可能起源于基因水平转移(horizontal gene transfer,HGT)方式。     

燕麦EST数据库中Ty1-copia和Ty3-gypsy型反转录转座子的频数分析

为研究转座元件(Transposable elements,TES)在燕麦中的表达模式,以14个Ty1-copia型反转录转座子和3个Ty3-gypsy型反转录转座子序列为种子序列对燕麦属(Avena)表达序列标签(EST)数据库中的Ty1-copia和Ty3-gypsy型反转录转座子进行检索和分析。结果表明:燕麦根中反转录转座子的频率显著高于叶(P0.05);强降雨模式的胁迫环境下叶组织中反转录转座子的EST频率显著高于大气降雨下的(P0.05),约为正常条件下的(Ee-10,0.12%)2倍;Ty1-copia和Ty3-gypsy型反转录转座子在根的分蘖期频率差异极显著(P0.01)。这些结果揭示了燕麦属Ty1-copia和Ty3-gypsy型反转录转座子的转录存在组织和发育的时空特异性及环境应答现象,为预测重复元件的表达模式提供了依据。同时,检索到的反转录转座子也有助于对燕麦基因组序列的注释。     

不同鳊鲂属鱼类群体的形态差异分析

运用3种多元统计方法对我国鳊属长春鳊(Parabramis.pekinensis)、鲂属团头鲂(Megalobrama.amblycephala)、东江三角鲂(Megalobrama.terminalis)、钱塘江三角鲂(Megalobrama.terminalis)、厚颌鲂(Megalobrama.pellegrini)和广东鲂(Megalobrama.hoffmanni)6个群体的可数性状、可量性状和框架性状的形态学差异进行了分析。结果显示,鳊鲂属鱼类6群体在侧线鳞数、侧线上鳞数、侧线下鳞数、背鳍条数、胸鳍条数、腹鳍条数、臀鳍条数等7项形态可数性状上的差异不显著(P0.05)。对9项可量比例参数和20项框架比例参数的聚类分析结果表明,团头鲂与同属的厚颌鲂、三角鲂亲缘关系较近,这3个鲂属种群与鳊属长春鳊形态差异较大,与同为鲂属的广东鲂形态差别最大;另外,聚类分析表明三角鲂的2个地理群体(东江三角鲂、钱塘江三角鲂)也存在一定的形态差异。判别分析构建了鳊鲂属鱼类6群体的判别函数,其综合判别率为93.7%。主成分分析提取的前2个主成分的累积贡献率为77.9%,其中主成分1的贡献率为70.9%,对鳊鲂属鱼类群体间形态学差异起决定性作用的特征集中在背腹轴方向。     

野鸢尾和射干种间杂交F_2代主要性状变异分析

通过观测野鸢尾(Iris dichotoma)×射干(I.domestica)杂交F2代群体(n=61)中每一个体的株高、花径、花数、花色和彩斑等14个表型性状,对F2代与双亲性状差异、群体性状变异、主要性状间遗传相关性及花色遗传变异等方面进行分析,以明确F2群体性状变异特点,指导夏季开花鸢尾育种实践。结果表明:F2代12个性状中,8个性状的观测值居于双亲之间;除花朵直径和花朵数量外,花葶长等10个性状基本均呈正态分布,属多基因控制的数量性状;性状之间存在一定相关性,外花被长与内花被长和外花被宽与内花被宽的相关度最高,相关系数分别为0.821和0.734,趋于连锁遗传;对颜色性状的分析结果表明花色和花瓣彩斑的遗传由不同基因调控,但都是由多个基因共同控制。野鸢尾×射干F2代群体的花朵直径、花朵数量、花葶长及花色变异丰富,利于大花、多花、花葶矮生和奇异花色的优良单株的选择。     

植物生长调节物质对梭梭和肉苁蓉生长的调节作用

以梭梭、肉苁蓉为材料,研究了植物生长促进剂赤霉素和抑制剂矮壮素对梭梭和肉苁蓉生长的调节作用。结果表明:1)赤霉素促进梭梭地上部生长,单株梭梭生物量和非结构性碳水化合物总量分别提高30.8%和69.3%,却使肉苁蓉生物量降低10.7%;2)矮壮素抑制梭梭地上部生长,单株梭梭生物量和非结构性碳水化合物总量分别降低19.7%和18.7%,但能提高肉苁蓉生物量86.6%。结果显示矮壮素对提高肉苁蓉生物量具有调节作用。     

利用CRISPR/Cas9构建斑马鱼tbx20基因突变体及其功能分析

转录因子TBX20在脊椎动物心脏的腔室发育和维护中起至关重要的作用。利用CRISPR/Cas9系统成功制备了斑马鱼tbx20突变鱼系,T7E1检测结果显示F_0敲除效率平均为42. 1%,测序分析F_1中突变种质遗传效率为36. 7%。F_2突变体中观察到心脏突变表型:48 hpf,心包腔肿大,静脉窦瘀血,环化异常,心脏结构变形; 3 dpf,心脏畸形拉伸成线状结构。原位杂交和qRT-PCR结果显示,突变体中vmhc表达上调,amhc和myl7表达下调。成功制备了斑马鱼tbx20突变体,结果表明tbx20纯合突变体心脏畸形,环化受到影响,为深入探究tbx20在早期心脏腔室分化过程中的作用奠定了基础。     

鼠伤寒沙门氏菌感染诱导鸡盲肠及脾脏TLR基因差异表达

为研究鼠伤寒沙门氏菌感染后不同时间鸡盲肠和脾脏组织TLR4、TLR5、TLR15和TLR21 mRNA的表达规律,选用沙门氏菌阴性济宁百日鸡36只,随机分为2组,饲喂于隔离器中,2日龄分别接种1.23×108cfu鼠伤寒沙门氏菌和PBS溶液,接种后第1、3和7天采集盲肠和脾脏组织样品,应用荧光定量PCR检测感染后各时间、各组织中TLR4、TLR5、TLR15和TLR21的表达量。结果显示,1)济宁百日鸡感染鼠伤寒沙门氏菌后盲肠中TLR4、TLR5、TLR15和TLR21表达量均发生显著变化(P0.05);2)脾脏中TLR21和TLR4的表达量分别在接种后第1天和第3天显著上调(P0.05),而TLR5和TLR15的表达量差异不显著;3)感染后各时间点脾脏中TLR5的表达量显著低于盲肠(P0.01),而TLR4、TLR15和TLR21表达量均显著高于盲肠(P0.05)。鼠伤寒沙门氏菌感染后,鸡TLRs在盲肠和脾脏中发挥着不同的调控作用,而且这种表达调控表现出一定的时序性。     

牙鲆胚后发育过程中Ⅰ型脱碘酶基因的原位表达谱

甲状腺激素T3在鱼类胚后发育与变态发育过程中发挥着重要作用,甲状腺激素T4通过Ⅰ型甲状腺氨酸脱碘酶(Dio1)生成T3,因此,调查Dio1基因在胚后发育包括变态发育过程中原位表达谱,有助于理解T3在胚后发育中的具体作用。利用RNA整体原位杂交技术,发现Dio1主要在牙鲆肠道、鳃、肝、肌肉、鳍、眼睛周围等器官和组织表达,鳃、肠道、奇鳍中的Dio1原位表达谱有一定的规律性,尤其在生骨肌细胞向鳍褶中迁移、臀鳍和背鳍(包括冠状幼鳍)的鳍条和支鳍骨的发生过程中,Dio1可能通过影响这些组织器官的T3水平而发挥重要作用。     

高榕榕果内Eupristina属两种榕小蜂的遗传进化关系

对生长在福州地区的高榕进行长期追踪观察,发现高榕榕果内仅生活着Eupristina altissima和Eupristina sp.榕小蜂,前者为高榕的传粉小蜂,后者无传粉行为,两者雌蜂之间在体色、触角、花粉袋和花粉刷等部位存在细微的差异,而两者雄蜂之间无形态差异。通过克隆福建地区5个样地的高榕榕果内收集到的E. altissima和Eupristina sp.榕小蜂,以及细叶榕的传粉小蜂Eupristina verticillata(外群)的Cytb及COI基因,并进行碱基组成及遗传距离分析,用邻接法构建系统发育树,分析两榕小蜂群体之间的遗传进化关系,结果显示:(1)榕小蜂COI及Cytb序列碱基组成中A+T的含量(Cytb序列中A+T=75.3%,COI序列中A+T=75.5%)显著高于G+C,符合膜翅目昆虫线粒体基因碱基组成特征。(2)对两群体小蜂进行遗传距离分析显示,Cytb序列中E. altissima和Eupristina sp. 群体内各样本之间的平均遗传距离分别为0.0092和0.0030,而E. altissima与Eupristina sp. 群体间的平均距离为0.1588;COI序列中E. altissima 与Eupristina sp. 群体内各样本之间的平均遗传距离分别为0.0065和0.0205,而二者群体间的平均遗传距离为0.1043,表明两者群体间的遗传距离明显大于各自群体内各样本间的遗传距离。统计GenBank中下载的6个属34种榕小蜂Cytb序列的种间遗传距离为0.0811-0.1723,6个属28种榕小蜂COI序列的种间遗传距离为0.0939-0.1986。由此认为E. altissima和Eupristina sp.之间的遗传距离差异已经达到了种间水平,即E. altissima与Eupristina sp.为两个不同的种。(3)在形态上,两种小蜂的雌蜂之间有微小差异,而二者雄蜂之间无差异,但Cytb与COI序列分析结果一致表明:E. altissima与Eupristina sp.雄蜂之间,以及二者雌蜂之间的遗传距离均差异显著,表明形态变异滞后于基因变异。雌蜂在表型上进化快于雄蜂,可能是由于雌蜂羽化后从榕果出飞,受到外界环境因素的影响较大,且两种雌蜂在传粉功能上存在差异,故二者之间的形态差异较大,而雄蜂寿命短,又终生生活在黑暗封闭、环境变化相对恒定的榕果内,两种雄蜂在行为上不存在差异,故二者表型变异较为缓慢。E. altissima和Eupristina sp.小蜂对宿主的专一性不强,在榕-蜂协同进化过程中,可能发生过宿主转移事件。