CELⅠ酶在水稻基因多态性检测中的应用

CELⅠ酶是定向诱导基因组局部突变TILLING(Targeting Induced Local Lesions In Genomes)技术中的关键酶，能够特异识别并切割单碱基错配和扭曲的DNA异源双链。实验从芹菜（Apium graveolens）中提取了CELⅠ酶，采用SDS-PAGE检测在43kD处有主带。以杂合双链作为底物，检测了CELⅠ酶的错配切割活性，结果表明CELⅠ酶可在不同材料的DNA所形成的异源双链的错配处准确切割。通过CELⅠ酶的提取、活性分析以及在水稻基因多态性检测中的应用，为基因多态性检测提供一种简单易行的方法。     

CEL I粗提物用于点突变检测的技术

本文以含有单个错配的DNA异质双链为底物鉴定芹菜CEL I粗提物的错配切割酶学活性,并对影响其切割错配的反应条件进行优化,建立以CEL I粗提物为基础的点突变酶学检测技术.结果表明:自制的CEL I粗提物能有效识别和切割DNA异质双链中碱基错配.当异质双链DNA量恒定时,在一定的范围内CEL I粗提物用量对错配切割效果...     

利用EcoTILLING简化技术进行水稻基因型鉴定及单核苷酸多态性(SNP)检测

EcoTILLING(ecotype targeting induced local lesions in genomes)是一种高通量检测和分析自然群体中单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)变异的研究方法。由于该技术需要高级、精密的仪器设备和昂贵的荧光标记引物来检测CEL(celery)Ⅰ的酶切产物,极大地限制了该技术的应用。本研究对传统EcoTILLING技术做了适当改进,简化了CELⅠ酶的抽提步骤,采用自然冷却方法制备异源双链产物,普通银染检测CELⅠ酶切产物,酶活检测结果显示CELⅠ粗提液对错配产物切割效果良好。利用EcoTILLING简化技术对18份水稻(Oryza sativa L.)品系Wx基因第1内含子5’端的G/T基因型进行了成功鉴定。此外,对18份水稻材料中一417bp长的Wx基因片段实现了CELⅠ酶切条带分型,经测序验证,酶切带型差异能够准确反映材料间SNP的变异。本研究结果表明,应用EcoTILLING简化技术可有效进行水稻基因型鉴定及SNP检测,是开展水稻功能基因组研究的有力工具。     

镰刀菌rDNA ITS区 RFLPs分析

本实验采用PCR-RFLP技术分析了镰刀菌菌种间的多态性。运用SDS碱裂解法抽提了采自于山西省不同地区的11株镰刀菌（Fusarium）基因组DNA，并用一对特异性引物对其rDNA ITS区段进行扩增，选用4种限制性内切酶（TaqⅠ AluⅠ HaeⅢ EcoRⅠ）酶切PCR扩增产物，共得到16条多态性片段，其中特异性条带8条，分子量大约在70-900bp之间。利用NTSYS-PC(2.1)软件包分析各菌株间的DNA限制性片段多态性，总共可以分为５大组，与传统分类一致，说明该方法可以用于镰刀菌菌株间的多态性分析。     

不同因素对羔羊皱胃酶凝乳活性的影响

研究结果表明，羔羊皱胃酶最适凝乳温度为45℃；35℃以上热处理对酶凝乳活性有不同程度的损失，60℃热处理10 min活性完全丧失；pH值为5～8时凝乳活性随乳pH值的降低而增强，酶在pH2.5～7.5之间处理20h凝乳活性稳定；Ca²⁺具有明显的促凝作用；底物浓度对酶活性的影响符合米氏规律。     

超高压处理对砀山梨汁中过氧化物酶活性的影响

该文研究了超高压处理对砀山梨汁中过氧化物酶活性的影响。试验压力为0.1～500 MPa，温度为20～60℃。此外，考察了不同pH值(3～7)和保压时间(2～34 min)超高压处理对酶活性的影响。试验结果表明：在处理温度为50℃、保压时间为10 min和梨汁pH 5的条件下，300 MPa以下压力范围内高压处理酶被激活，其活性增加；大于300 MPa时酶的活性随压力增大而下降。高压处理时，温度低于40℃对酶的活性影响不大；有效影响高压处理的最小温度为40℃。保压时间超过10 min后时间延长对酶的活性影响     

费氏弧菌β-内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学分析

以费氏弧菌（Vibrio fischeri）EM17基因组DNA为模板，通过PCR方法克隆了该菌的β-内切葡聚糖酶基因（GenBank Accession Number : EF533943）。将其插入到表达载体pGEX-6p-1中，转化大肠杆菌BL21（DE3），诱导表达。测序结果经DNAMAN软件分析，该基因与GeneBank中费氏弧菌 ES114基因组预测的β-内切葡聚糖酶基因同源性达到97.1％，但与GeneBank中其他β-内切葡聚糖酶基因同源性较低。酶学性质研究表明，该酶的最适反应温度为60℃，最适反应pH值为9.0。同时研究了6种金属离子对该酶活性的影响，结果显示该酶活性依赖金属离子的存在 Mg2+，Ca2+对酶有激活作用，Mn2+, Pb2+则严重抑制该酶的活性。     

栽培种花生AFLP标记体系的优化及多态性引物筛选

为建立并优化适合花生的EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ内切酶组合的AFLP标记技术体系,本试验对花生基因组DNA大样提取方法、双酶切反应、连接体系、预扩增和选择性扩增等影响因素进行反复调试与优化,并对适合花生AFLP分析的引物组合(E/M)进行多态性筛选。结果表明,高质量的模板DNA提取采用改进的SDS-CTAB法,DNA样品的浓度在150~200 ng·μL~(-1),37℃双酶切3.0 h,接头浓度为50pmol·μL~(-1),T4-DNA连接酶浓度为10 U·μL~(-1),16℃连接10 h。以2×Es Taq MasterMix(含有Es Taq DNA Polymerase,3 mmol·L~(-1)MgCl_2和400μmol·L~(-1)d NTP)作为PCR反应原料,其中,预扩增反应体系为50μL,预扩增引物(E00和M00)的浓度为50 ng·μL~(-1),预扩增产物最适稀释倍数为20倍;选择性扩增反应体系为20μL,扩增产物中加入10μL Loading Buffer,经95℃变性10 min后,立刻转移到冰浴中冷却备用。最终,从225对AFLP引物组合中,筛选出稳定且多态性丰富的42对引物组合,可用于后期作图群体基因型检测和种质资源遗传多样性分析。本研究结果为下一步构建花生高密度遗传连锁图谱和开展分子标记辅助育种奠定了基础。     

家蝇乙酰胆碱酯酶的纯化、生化性质及其对杀虫剂敏感性的研究

采用CEA亲和层析法对家蝇AChE进行纯化,测定了不同温度、pH值、ATChI浓度、DTNB浓度对AChE活性的影响,并测定了不同杀虫剂对纯酶和粗酶的抑制作用。结果表明,CEA纯化倍数为672．36,产率为34．68％;当温度为35℃时,粗酶和纯酶的AChE活性最高;当pH=7．2时,纯化后AChE的活性最高,随后随着pH的升高AChE的活性反呈下降趋势;当pH=7．8时,粗酶AChE活性最高;当底物浓度的2500umol·L^-1时,纯化AChE活性达到最大值,当底物浓度为1500umol·L^-1时,粗酶活性达到最大值;粗酶和纯化的AChE活性的两个波峰出现在DTNB浓度为0．2mol·L^-1和0．4mol·L^-1时;仲丁威、乙酰甲胺磷、速灭威、甲胺磷、毒死蜱、克百威、抗蚜威、灭多威和辛硫磷等9种杀虫剂对粗酶和纯酶AChE的I岛比值都大于6,甲萘威对纯酶和粗酶AChE的lC50比值为4．826,二嗪磷的为1．184,三唑磷的为0．099。     

发酵床垫料中微生物16S rDNA PCR反应条件的建立与优化

为探讨发酵床垫料中微生物16S rDNA基因扩增实验中诸多因素对实验结果的影响,采用单因素法对16S rDNA基因扩增时PCR反应体系中的5个潜在因素(Mg2+、dNTP、引物、Taq酶、模板DNA)5水平上进行优化实验,并进一步优化了反应程序中的退火温度、循环次数。结果表明:25μL的最佳反应体系为:10×PCR buffer 2.5μL、MgCl22.0 mmol·L-1、dNTP 0.2 mmol·L-1、引物0.2μmol·L-1、Taq DNA聚合酶0.5 U、模板DNA 50 ng;最佳反应程序为:在94℃下进行4 min预变性;随后循环扩增25个循环(包括94℃变性45 s,53.7℃退火30 s,72℃延伸90 s);最后在72℃下延伸10 min。     

甘蔗基因组DNA简单和快速提取方法

目前国内外关于提取DNA的方法很多(Honeycutt et al．，1992；顾红雅和瞿礼嘉，1998)，但因研究的对象和目的不同而有所差异。甘蔗含有大量的酚和多糖等有机物质，由于这些物质的干扰，按照常规提取植物组织总DNA的方法提取甘蔗基因组DNA，常常因产量小和纯度低而不能满足实验要求。本实验在前人研究的基础上(Honeycutt et al．，1992；顾红雅和瞿礼嘉，1998)，对所用药品及技术进行改进，摸索出一套快速、简便且可获得高质量基因组DNA的改良方法。用此方法提取的DNA进行酶切、RAPD和Southem杂交分析，都取得了良好的效果。     

毛薯ISSR-PCR反应体系的建立

本研究主要建立毛薯ISSR-PCR的最佳反应体系。研究采用改良CTAB法提取毛薯总基因组DNA,应用单因子实验法设定模板DNA,Mg2＋浓度,dNTP浓度,Tap酶浓度以及退火温度的5个不同梯度,探讨单因素变化对毛薯ISSR-PCR扩增的影响。实验结果表明,毛薯ISSR-PCR最佳反应体系为：总体积20μL,模板DNA为50ng、Taq酶为0.8U、Mg2＋浓度为2.0mmol/L、引物浓度为0.5μmol/L、dNTPs浓度为0.5mmol/L。     

绿色木霉葡聚糖内切酶Ⅰ基因的定点突变及酶学性质的研究

将绿色木霉葡聚糖内切酶EGⅠ基因eg1亚克隆到表达载体pSE380,构建出重组质粒pSE380-eg1,转化到大肠杆菌JM109中表达,利用金属亲和层析对EGI进行纯化,纯化后的酶比活力达到3.8U/mg,其最适反应温度为48℃,最适pH为5.2。同时对EGⅠ的氨基酸残基G291位进行随机定点突变,筛选到一株突变酶G291S,其比活力为野生酶的2.2倍,Km值为野生酶的0.66倍,最适反应温度和最适反应pH值未发生改变。     

有机无机肥料及抽穗期气温升高对水稻籽粒淀粉合成相关酶活性及淀粉品质形成的影响

为探讨不同肥料处理下抽穗期高温胁迫对水稻籽粒淀粉酶活性及淀粉品质形成的影响,本试验以优质食味水稻南粳9108为材料,设置施用有机肥(OF)和常规化肥(CF)处理,于抽穗期进行常温(NT)、+2℃(较常温增加2℃,MT)和+5℃(较常温增加5℃,HT)处理,对籽粒淀粉合成特性进行研究。结果表明,抽穗期温度升高降低了蔗糖合成酶(SS)、淀粉合成酶(SSS)和淀粉分支酶(SBE)的活性,提高了蔗糖磷酸合成酶(SPS)和焦磷酸化酶(AGP)的活性。蔗糖含量、淀粉平均粒径、热焓值与峰值温度均表现为HT>MT>NT;淀粉含量、直链淀粉含量与黏度值则随着温度升高而下降。在肥料处理方面,各淀粉相关酶活性均表现为OF>CF,且在OF处理下有较好的淀粉品质。综上所述,温度升高通过抑制淀粉合成,加速了形成淀粉原料的积累,进而导致籽粒中蔗糖含量升高;有机肥处理能促进蔗糖合成并提高淀粉合成相关酶活性。从气候变暖应对措施方面,可选择有机肥替代化肥调控淀粉相关酶活性,进一步改善淀粉品质。本研究结果为减少高温对水稻的危害与提高淀粉品质提供了技术参考。     

一个新的内切葡聚糖酶基因umcel5K的克隆、表达及其表达产物的酶学特性

从水牛瘤胃内容物的添加滤纸为碳源的富集培养物中提取未培养微生物的总DNA,以柯斯质粒为载体构建了1个含约8000个克隆的宏基因组文库,对文库进行活性筛选获得1个既表达CMCase活性又表达4-MUCase酶活性的克隆。亚克隆及测序分析发现1个潜在的可编码333个氨基酸的ORF(Open Reading Frame),其蛋白质产物与1个来源于未培养细菌的糖苷水解酶家族5的纤维素酶Cel A的同源性最高,两者的一致性为53%,相似性为68%。将PCR扩增的该基因完整的ORF克隆入表达载体pET30a(+),在大肠杆菌中得到其过量表达产物。经过Ni-NTA纯化后,该表达产物(Umcel5K)具有CMCase活性和4-MUCase酶活性,其最适pH是4.5~5.0,最适温度是50°C。pH耐受性检测表明,该酶在pH4~4.5比较稳定。温度耐受性实验表明该酶不耐高温,在55°C以下比较稳定。经过镍柱纯化的酶液比活为26.15 U/mg。部分金属离子如Fe3+、Cr2+或Cu2+会抑制该酶的酶活,而另外一些金属离子如K+、Li+等对Umcel5K的活性影响不大。     

粪肠球菌来源内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的重组表达及催化特性

内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(endo-β-N-acetylglucosaminidase,Endo/ENGase,EC3.2.1.96)是一类特异性识别并切割N-连接聚糖核心结构中两个N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine,Glc NAc)之间的β-1.4-糖苷键的糖苷酶,广泛应用于蛋白质N-糖基化分析。为表征粪肠球菌(Enterococcus faecalis)来源的内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的酶学特性,本研究通过PCR扩增粪肠球菌内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因endoEf,并通过无缝克隆的方式构建原核表达载体pET-28a-endoEf,在实现重组表达和纯化的基础上对EndoEf蛋白的催化特性及关键催化残基进行分析。结果表明,EndoEf可在大肠杆菌中以可溶形式高效表达,经钴离子亲和层析可获得高纯度的目标蛋白,每升菌液可纯化202.1 mg目标蛋白;以RNase B为底物,其比活力为1.0×10~4U/mg。EndoEf包含保守基序DXDXE,属于糖苷水解酶18(glycoside hydrolases 18,GH18)家族,可以酶切天然及变性状态下的核糖核酸酶B(ribonuclease B,RNase B)和鸡卵清蛋白(ovalbumin,Ova);基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)进一步证明了EndoEf对RNase B上N-连接糖链的水解。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)显示,EndoEf表观分子量为30.2 kD。酶学性质分析表明,EndoEf最适温度为40℃,最适pH范围为5.0~7.0;在温度为40~50℃、pH 7.0~9.0之间具有较好的稳定性,可耐受1 mol/L NaCl、100 mmol/L DTT、2%SDS和2%Triton X-100。定点突变技术构建EndoEf的3个突变体D125N、D127N和E129Q,并对突变体酶活性进行分析表明,E129Q活性几乎完全丧失,D127N丧失大部分水解活性,而D125N没有明显活性改变,说明EndoEf的129位谷氨酸是催化必须氨基酸。EndoEf重组表达体系的建立和酶学性质的分析为其在糖蛋白研究中的实践应用提供了科学依据。     

温度对麦秸混合物料厌氧干发酵中糖类水解酶活性的影响

水解酶活性直接影响到秸秆厌氧干发酵的沼气产量。本文以麦秸为主要原料, 配制干物质含量(TS)35%的混合发酵物料, 设置20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃ 5种不同温度条件, 发酵周期为35 d, 测定发酵过程中料液的纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶和蔗糖酶的活性变化。结果表明, 沼气产气高峰在35 ℃左右, 20~40 ℃时, 随着温度的升高, 发酵后料液的料液干物质含量(TS)、可挥发固体含量(VS)、C/N均明显下降, 发酵产沼气后, 各处理发酵液 pH都降到7.0以下, 其中40 ℃的pH降低幅度最大。纤维素酶活性在发酵初期较低, 峰值出现也较晚, 温度升高明显有利于提高纤维素酶活性。木聚糖酶的起始活性较高, 整个发酵过程中呈先升高后降低并渐趋于平缓的变化趋势, 20~25 ℃处理的木聚糖酶活性在整个发酵过程中没有明显峰值。淀粉酶的起始活性较低, 但随后迅速升高, 30~40 ℃处理在10 d左右达到峰值后开始下降, 此后酶活力的变化幅度较前期平稳。蔗糖酶的起始酶活力较低, 随后升高迅速, 温度在30 ℃以上时酶活性增加更快, 35 ℃时15 d达到峰值后迅速下降, 下降速度明显大于30 ℃和40 ℃处理。由此可见, 温度对秸秆厌氧干发酵过程中不同水解酶活性的影响还是有所差异的。     

铁皮石斛SCoT-PCR反应体系构建及优化

采用正交设计和单因素试验相结合的方法,对铁皮石斛的SCoT-PCR反应中5个因素(DNA 模板、Mg2+、dNTPs、Taq 酶和引物)进行优化试验。建立了适合铁皮石斛既稳定且多态性高的SCoT-PCR的最佳反应体:20μl PCR反应体系中含有1×Buffer、30ng DNA 模板、2.5mmol·L-1Mg2+、0.15mmol·L-1 dNTPs、1.5U Taq DNA聚合酶和0.4μmol·L-1引物。对铁皮石斛的SCoT-PCR最佳反应体系的退火温度进行梯度试验,发现本试验引物S6的退火温度为54.5℃,且最适退火温度因引物而异。这一优化的SCoT-PCR反应体系在32份铁皮石斛材料的验证中表现出良好的稳定性和重复性。该优化的SCoT-PCR反应体系为进一步进行铁皮石斛种质鉴定、遗传图谱构建、基因定位和遗传多样性的分析奠定了技术基础。     

柿属植物ISSR分析技术的建立

以部分柿属(Diospyros)植物为材料,对ISSR-PCR反应体系腗g2+、dNTPs、引物、模板DNA和Taq DNA聚合酶浓度,退火温度及扩增循环次数进行了探讨,确立了适合柿属植物ISSR分析技术体系在25 μL反应体系中,含1× Buffer,Mg2+2.0或2.5 mmol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,引物0.6 μmol/L,Taq DNA聚合酶1U,甲酰胺2%,模板DNA 2.4 ng/μL;PCR扩增程序94℃变性3 min;94℃ 30 s,(Tm+2)℃(根据引物不同设定)45 s,72℃1.5 min,35个循环;72℃延伸7 min;2%琼脂糖电泳分离PCR产物.结果为柿属植物遗传多样性和分子系统学研究提供技术支持.     

超声波辅助酶解法提取罗非鱼眼透明质酸工艺条件

本文研究超声波辅助酶解法提取罗非鱼眼玻璃体中透明质酸,通过单因素实验、正交实验分析了超声波功率、超声处理时间及蛋白酶种类、酶解时间、酶解pH、酶量、酶解温度对透明质酸提取的影响,确定了最佳提取工艺条件:超声波功率200W、超声处理时间15min、酶作用时间3 h、酶解温度40℃、酶解pH值9.0、酶用量6000U·g-1,利用最优条件透明质酸的平均得率为11.44%。采用季铵盐络合法、离子交换层析法对透明质酸粗品进行纯化得到高纯度的透明质酸,其纯度达到97.47%,利用粘度法测量透明质酸相对分子量为100 KDa。紫外图谱中无蛋白及核酸的吸收峰,红外光谱图显示其特征吸收峰和标准品相同。本研究为罗非鱼眼的高值化利用提供了技术支撑。