CELⅠ酶在水稻基因多态性检测中的应用

CELⅠ酶是定向诱导基因组局部突变TILLING(Targeting Induced Local Lesions In Genomes)技术中的关键酶，能够特异识别并切割单碱基错配和扭曲的DNA异源双链。实验从芹菜（Apium graveolens）中提取了CELⅠ酶，采用SDS-PAGE检测在43kD处有主带。以杂合双链作为底物，检测了CELⅠ酶的错配切割活性，结果表明CELⅠ酶可在不同材料的DNA所形成的异源双链的错配处准确切割。通过CELⅠ酶的提取、活性分析以及在水稻基因多态性检测中的应用，为基因多态性检测提供一种简单易行的方法。     

烟草Ⅰ类几丁质酶,β—1,3—葡聚糖酶cDNA的克隆和序列分析

我们以烟草花叶病毒感染７天后的三生烟为材料，对经过修饰的烟草Ⅰ类几丁质酶和Ⅰ类β－１，３－葡聚糖酶ｃＤＮＡ进行了克隆和序列分析。结果表明，Ｃｈｉ－Ｉ，Ｇｌｕ－－Ⅰ的全长ｃＤＮＡ分别为９９０ｂｐ和１０２０ｂｐ。另外，核苷酸及由此推断的氨基酸序列与文献报道的序列相比较，分别具有Ｃｈｉ－Ⅰ：９９．９％ＧＮＧ ９９．７；Ｇｌｕ－Ⅰ：９９．６％与９９．４％的同源性。     

CEL I粗提物用于点突变检测的技术

本文以含有单个错配的DNA异质双链为底物鉴定芹菜CEL I粗提物的错配切割酶学活性,并对影响其切割错配的反应条件进行优化,建立以CEL I粗提物为基础的点突变酶学检测技术.结果表明:自制的CEL I粗提物能有效识别和切割DNA异质双链中碱基错配.当异质双链DNA量恒定时,在一定的范围内CEL I粗提物用量对错配切割效果...     

重组水稻几丁质酶的发酵生产、纯化及酶学性质

用7L发酵罐对毕赤酵母(Pichia pastoris)工程菌株NB01进行了重组几丁质酶的诱导表达,通过提高通气量和调整搅拌转速,使溶氧维持在30%以上,NB01可在发酵84 h内达到产酶高峰,酶活最高可达48.0795 U/mL.利用中空纤维超滤膜对发酵液浓缩、提纯,再经过Sephadex G-100柱层析后得到单一组分的重组几丁质酶,酶纯度提高了7.9961倍.重组几丁质酶在60℃以下具有良好的热稳定性,在pH 2～6范围内有较强的耐受力,在4℃条件下贮藏具有较好的稳定性.     

小麦种子过氧化物酶的纯化及其部分酶学性质研究

小麦全面粉水抽提液经醋酸酸沉淀,上清再经硫酸铵35%-75%分组沉淀,沉淀溶于pH5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液,经FPLC-SOURCE 30S 阳离子交换层析,FPLC-Superdex G-75凝胶过滤层析,纯化了小麦种子过氧化物酶（Wheat Seed Peroxidase）,纯化酶的比活力为3912U／mg。在SDS-PAGE上显示出一条蛋白带,其分子量约为37 KD。光谱分析显示,在399nm处有一典型的Soret带,在495nm和636nm处有特征吸收,酶反应的最适pH在5.0左右,最适双氧水浓度为13mM/L,最适温度在40℃左右,有较好的耐热能力。     

重组水稻几丁质酶的发酵生产、纯化及酶学性质的研究

用7L发酵罐对酵母工程菌株NB01进行了重组几丁质酶的诱导表达,通过提高通气量和调整搅拌转速,使溶氧维持在30％以上,NB01可在发酵84 h内达到产酶高峰,酶活最高可达48.0795 U/mL。利用中空纤维超滤膜对发酵液浓缩、提纯,再经过Sephadex G-100柱层析后得到单一组分的重组几丁质酶,酶纯度提高了 7.9961倍。研究结果还表明,该酶具有良好的热稳定性和耐酸性;在4℃条件下具有较好的贮藏稳定性。     

水稻几丁质酶的原核表达、复性及体外抑菌活性的研究

利用RT-PCR反应,从纹枯菌诱导的水稻叶片cDNA中克隆了1个水稻几丁质酶基因RC7的全长编码序列（ORF）。通过亚克隆方法,RC7与原核表达载体pGEX-4T-1上的GST融合,构建成GST-RC7重组蛋白的原核表达载体pGST-RC7,然后,将其转化到大肠杆菌细胞中。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导,获得了以包涵体形式高效表达的GST-RC7。经过洗涤、溶解（变性）、复性及纯化等处理,包涵体中GST-RC7得到溶解、复性和纯化。纯化的复性GST-RC7蛋白具有几丁质酶活性。对6种重要作物病原真菌进行体外抑菌活性分析的结果表明, RC7可显著抑制水稻纹枯病菌、小麦纹枯菌、小麦赤霉菌、棉花黄萎菌、烟草赤星菌的菌丝生长,说明RC7可作为上述植物病害抗性基因育种的重要基因。     

甘薯茎叶多酚分离纯化及降血糖活性研究进展

甘薯茎叶为甘薯地上蔓生部分,一年能多次采收,与甘薯块茎产量相当.甘薯茎叶中的多酚类物质含量丰富,主要为酚酸类和黄酮类物质,具有抗氧化、降血糖、抗菌消炎、抗肿瘤、保护肝脏和免疫调节等作用,且甘薯茎叶多酚类物质的降血糖作用已成为天然产物活性研究领域的热点之一.本文综述了甘薯茎叶多酚类物质的提取和分离纯化方法、酚酸类和黄酮类...     

几种农药对棉花过氧化氢酶过氧化物酶活性的影响

通过在棉花生育期喷施不同种类农药，试验测定棉叶内过氧化氢酶、过氧化物酶活性的变化趋势。结果发现，喷施农药后，棉叶的过氧化氢酶、过氧化物酶均一定程度表现出“涨落现象”，表明了在本地区特有的农业环境条件下，农药可能会影响植物的正常生理代谢过程。     

欧文氏杆菌木聚糖酶的纯化与酶学性质研究

从实验室现有菌种资源中筛选出木聚糖酶高产菌株,发酵液酶活达到408 U;仅采用超滤和凝胶层析2个步骤即从发酵液中提取到电泳纯木聚糖酶,回收率高达69.17 %,比活达到28453.6 U/mg;用ESI-MS/MS法测得该酶氨基酸序列,与该研究室登陆GenBank的木聚糖酶基因表达的氨基酸序列一致;其酶学性质为：采用SDS-PAGE和凝胶层析测得分子量为22.54 kD、21.89 kD;IEF-PAGE测得等电点为9.63;以桦木木聚糖为底物时,Km值和Vmax分别为1.0mg/ml和33.3μmol/（min.ml）,燕麦木聚糖的Km值和Vmax分别为0.5mg/ml和33.3μmol/（min.ml）;最适作用温度60℃,稳定温度0℃~60℃;最适pH5.8,稳定pH3.4~6.4;Fe2+、Co2+有激活作用,Cu2+有强烈抑制作用。     

鳖甲胶原蛋白酶解物的分离纯化及体外抗氧化性研究

为建立中华鳖背甲中胶原蛋白酶解物(CH)的制备条件,并明确其体外抗氧化活性,本研究采用单因素试验探讨鳖甲胶原蛋白酶解物的分离条件。结果表明,其最佳提取工艺参数:胃蛋白酶添加量4 000 U·g^-1、pH值2.5、酶解温度35℃。通过透析纯化后获得体外抗氧化活性最好的组分为分子量<50 kDa的样品。该样品经Sephadex G-75凝胶色谱分离纯化得到2个组分,其中GP-2组分对O₂^-·、OH·和DPPH·3种自由基清除能力最强;之后对GP-2组分进行离子交换层析分离同样获得2个组分,其中P1组分体外抗氧化活性高于GP-2,其对DPPH·、OH·、O₂^-·清除率分别为81.67%、65.45%和6.78%。经SDS-PAGE电泳确定P1组分的分子量约40 kDa。本研究结果为鳖甲的开发利用及鳖源新型抗氧化物质的研发提供了一定的理论基础。     

欧文氏杆菌变异菌株木聚糖酶纯化及其酶学性质

从现有309份菌种资源中筛选出木聚糖酶高产菌株(Erwinia),发酵液酶活达到408 U.采用超滤和凝胶层析法从发酵液中分离纯化出电泳纯木聚糖酶,回收率高达69.17%,比活达到28453.6U/mg.酶学性质研究结果显示,采用SDS-PAGE和凝胶层析测得分子量分别为22.54和21.89 kD;IEF-PAGE测得等电点为9.63;以燕麦木聚精为底物时,K_m和V_(max)分别为0.5mg/mL和533 U;最适作用pH 5.8,稳定pH 3.4～6.4;最适作用温度60℃,在pH 5.8条件下稳定温度0～65℃;Fe~(2+)和Co~(2+)有激活作用,Cu~(2+)有强烈抑制作用.用ESI-MS/MS法分析,该菌株分泌的木聚糖酶氨基酸序列与GenBank上登录的木聚糖酶基因表达的氨基酸序列一致.     

绿色木霉葡聚糖内切酶Ⅰ基因的定点突变及酶学性质的研究

将绿色木霉葡聚糖内切酶EGⅠ基因eg1亚克隆到表达载体pSE380,构建出重组质粒pSE380-eg1,转化到大肠杆菌JM109中表达,利用金属亲和层析对EGI进行纯化,纯化后的酶比活力达到3.8U/mg,其最适反应温度为48℃,最适pH为5.2。同时对EGⅠ的氨基酸残基G291位进行随机定点突变,筛选到一株突变酶G291S,其比活力为野生酶的2.2倍,Km值为野生酶的0.66倍,最适反应温度和最适反应pH值未发生改变。     

中国传统细菌型豆豉溶栓酶的提取纯化技术研究(简报)

为深入开发利用中国传统发酵细菌型豆豉溶栓酶,对豆豉溶栓酶分离纯化工艺进行了研究探讨,确认了最佳的纯化条件:首先用饱和度75%的硫酸铵沉淀豆豉溶栓酶;然后利用DEAE-Sepharose FF (Diethylaminoethyl Sepharose Fast Flow,二乙基氨基琼脂糖快速凝胶)阴离子交换柱进行层析,优化的层析条件为用10 mmol/L Tris(Trishydroxymethylaminomen,三羟甲基氨基甲烷)-HCI (pH 8.7)作为上样缓冲液,采用线性梯度洗脱,洗脱液为10mmol/L Tris-HCI(pH 8.7)和0.6mol/LNaCl,洗脱流速为1 mL/min;最后经过Sephadex G-75(葡聚糖凝胶G-75)凝胶过滤,得到纯化倍数为11.29倍的豆豉溶栓酶.利用SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulphate-polylamide gel electroresis,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳) 显示经纯化后的酶无杂蛋白,初步鉴定其分子量接近31 ku.     

荔枝低分子量多糖的分离纯化及抗氧化吸湿保湿性能分析

为进一步开发和利用荔枝中的多糖成分,该文对荔枝低分子量多糖组分进行分离纯化,并对其理化性质、抗氧化和吸湿保湿性进行研究。采用超声波辅助提取、分级醇沉、DEAE-cellulose 52和Sephadex G-100柱分离纯化荔枝多糖;紫外-可见光谱扫描法、比旋光度法、渗透凝胶色谱法3种方法验证纯度;高效凝胶渗透色谱法测定相对分子量,高效阴离子交换色谱测定单糖组成;清除DPPH自由基和羟基自由基评价体外抗氧化活性;体外法测定吸湿保湿性。结果表明:荔枝多糖经分离纯化后获得组分荔枝多糖PLC-1,经3种方法验证PLC-1为精多糖,相对分子量为2.35×104 Da,是由半乳糖、鼠李糖、葡萄糖组成,摩尔比为:1.00∶3.52∶5.89。抗氧化活性研究结果表明PLC-1对DPPH和羟基自由基呈良好的量效关系,半数清除浓度IC50分别为0.41和0.31 mg/m L。吸湿保湿性的结果表明,PLC-1具有良好的吸湿和保湿性,在32 h时的吸湿率为58.3%,32 h时的失水率为45.3%,荔枝多糖PLC-1为具抗氧化和吸湿保湿活性的多糖,研究结果可为荔枝的深加工和进一步研究开发提供一定的理论基础。     

大孔树脂纯化黄精多酚及其抗氧化性与组成分析

考察4种树脂对黄精多酚粗提物的吸附-解吸特性,筛选出最佳的纯化树脂,并研究其纯化工艺,分析黄精多酚的体外抗氧化活性、红外光谱特性和单酚组成。结果表明,AB-8型大孔树脂最适合于对黄精多酚粗提液的纯化,静态吸附5 h达到饱和,静态解吸3 h达到平衡;在室温下,用质量浓度为0.80 mg/mL的黄精多酚粗提液以0.8 mL/min的流速上样;吸附平衡后以70%的乙醇为洗脱剂,在洗脱流速为1 mL/min时,大孔树脂纯化效果最好,经纯化后黄精多酚的纯度提高了3.37倍。黄精多酚具有较好的抗氧化能力,且具有良好的量效关系,纯化前后黄精多酚总还原能力的IC50值分别为(27.48±1.93)、(19.01±1.48)μg/mL,清除DPPH·的IC50值依次为(5.21±0.48)、(4.00±0.26)μg/mL,清除ABTS+·的IC50值依次为(4.89±0.82)、(4.21±0.53)μg/mL,经纯化后黄精多酚的抗氧化活性明显增强。红外光谱分析表明其具有多酚和黄酮的特征峰;HPLC-DAD分析表明,黄精多酚主要含绿源酸,阿魏酸,芦丁和熊果酸。     

不同因素对羔羊皱胃酶凝乳活性的影响

研究结果表明,羔羊皱胃酶最适凝乳温度为45℃;35℃以上热处理对酶凝乳活性有不同程度的损失,60℃热处理10 min活性完全丧失;pH值为5～8时凝乳活性随乳pH值的降低而增强,酶在pH2.5～7.5之间处理20h凝乳活性稳定;Ca²⁺具有明显的促凝作用;底物浓度对酶活性的影响符合米氏规律。     

一株曲霉的一种中温糖化酶的纯化及其部分酶学特性

本研究从广西花坪自然保护区采集的土壤中筛选获得了一株产糖化酶丝状真菌菌株57-45,通过形态学观察和真菌内转录间隔区（internal transcribed spacer,ITS）序列比对分析,将其初步鉴定为曲霉属（Aspergillus sp.）的一个种。纯化真菌57-45所产的一种胞外糖化酶经过硫酸铵分级沉淀、疏水层析和阴离子交换层析三步蛋白质纯化步骤,得到在SDS-PAGE上约60kD的单一蛋白质条带,薄层层析分析表明该纯化的蛋白质水解可溶性淀粉的产物只有葡萄糖,证明该纯化的蛋白质为糖化酶。纯化的糖化酶Km值为1.9mg/mL,Vmax为4148μmol/（min·mg）,最适作用pH5.5,最适作用温度50℃,在同步糖化发酵中有应用的潜力。金属离子Fe3＋、Zn2＋、Cu2＋对酶活有较强的抑制作用,EDTA对酶活有较强的促进作用。本文结果将为进一步研究曲霉糖化酶的酶学特性提供新的材料。     

哈茨木霉和黑曲霉粗酶液预处理改善秸秆产甲烷性能

为提高玉米秸秆甲烷产率,该文研究了酶对玉米秸秆预处理后厌氧发酵的指标性质和对微生物的冲击。研究发现,哈茨木霉粗酶液(酶T)和黑曲霉粗酶液(酶A)预处理后,发酵体系中初始挥发性脂肪酸(volatile fatty acid,VFA)显著增加,主要体现在乙酸的积累。发酵1 d后,酶T处理组和酶A处理组的碱度/VFA比值及可溶性化学需氧量/VFA(s COD/VFA)比值较CK组显著增加,该变化主要体现在VFA的大量减少。发酵20 d,酶T处理组和酶A处理组的累积产甲烷量分别比CK组提高了7.79%和10.06%。厌氧发酵24 h,酶T处理组中9个属的细菌丰度显著高于CK组,其中Clostridium,vadin BC27,Ruminofilibacter与纤维素的降解有关。发酵系统中古菌主要为Methanosaeta,Bathyarchaeota,Methanosarcina,Methanobacterium等。预处理影响了发酵系统中微生物的菌群结构,对改善发酵条件具有重要的调节作用。该研究为木质纤维素的沼气转化提供参考。