木薯蔗糖转运蛋白基因的表达分析

以木薯SC124为材料,分别在植株发育8个时间点取其块根和功能叶,利用实时定量PCR技术（qPCR）对木薯SUT1、SUT2、SUT4三类蔗糖转运蛋白基因表达差异进行研究。结果表明,在木薯块根形成期（90 d）3类SUT表达的日变化中,功能叶和块根中均以中午12 h最高,其余时间较低,叶片中SUT1和SUT2表达水平较高而块根中差异不显著;在整个发育过程中,叶片表达水平高于块根,且二者均为前期表达水平高,后期下降,3个SUT之间的表达量也有着明显的差异,叶片中SUT1的表达量最高,其次是SUT2,SUT4最低,在块根中除60 d时SUT1的表达量较高外,其它SUT表达量均较低,SUT4在叶片和块根中的表达量差异不大。     

木薯MeNAC29、MeNAC30基因的克隆及表达分析

NAC(NAM/ATAF/CUC)基因家族是广泛分布于陆生植物的一类转录因子,在植物生长发育和胁迫应答的调控中发挥重要作用。本文对该基因家族在木薯抗细菌性萎蔫病方面的作用机制进行了初步研究。采用RT-PCR技术从木薯cDNA中克隆了MeNAC29和MeNAC30基因,并采用qRT-PCR技术对抗、感种质受木薯萎蔫病菌(Xanthomonas axonopodispv.manihotis,Xam)侵染后2个基因的表达变化进行了定量分析。结果表明,2个基因均含有3个外显子和2个内含子,且均有保守的NAM结构域。MeNAC29基因的开放阅读框全长888 nt,编码295 aa。MeNAC30基因的开放阅读框全长870 nt,编码289 aa。接种木薯萎蔫病菌后,抗病种质中MeNAC29和MeNAC30基因的表达量显著高于感病品种,表明这2个基因参与了木薯对细菌性萎蔫病菌的抗性反应。     

木薯MeLHCB4基因的克隆及表达分析

本研究采用RT-PCR技术克隆了木薯叶绿素a/b结合蛋白基因MeLHCB4编码区序列。通过生物信息学对其基因结构、基因编码蛋白的理化性质等进行分析,并对不同物种的LHCB4氨基酸序列进行比对和构建进化树。结果表明,木薯MeLHCB4基因的CDs序列全长858 bp,编码285个氨基酸,蛋白理论相对分子质量约为30.9 kDa,理论等电点为5.47,该蛋白属于稳定的亲水性蛋白,预测该蛋白可能定位于细胞核或细胞质中。实时荧光定量PCR检测该基因的表达模式发现,MeLHCB4基因主要在木薯叶片和茎中表达,受到茉莉酸甲酯（JA）、水杨酸（SA）和乙烯前体（ACC）等激素的诱导表达,推测其可能参与了JA、SA、ACC信号途径。细菌性枯萎病病原菌侵染木薯叶片12 h后,MeLHCB4的表达量显著提高,表明MeLHCB4参与了木薯对病原菌的响应过程。     

木薯MeNRT2.1基因的克隆及表达分析

木薯具有产量高、抗贫瘠等特点,为了了解其耐贫瘠的作用机理,提高木薯在贫瘠土壤中对氮素的利用率,以培养20 d的"华南5号"木薯组培苗为实验材料,采用同源克隆和RT-PCR技术,获得一个高亲和硝态氮转运蛋白(NRT2)基因,命名为Me NRT2.1,该基因含有1 593 bp的开放阅读框架,编码530个氨基酸。生物信息学分析结果表明,木薯Me NRT2.1与苜蓿、拟南芥、可可、杨树等物种的NRT2.1同源性高,其中与可可树Tc NRT2.1的亲缘关系最近,氨基酸相似性达到90%。实时荧光定量PCR检测结果表明,Me NRT2.1在木薯组培苗的根中表达,并且在NO_3~-浓度为0.2 mmol/L时,其相对表达量较高,NO_3~-浓度为10 mmol/L时其相对表达量较低,NO_3~-浓度为0时几乎不表达;Me NRT2.1在茎、叶中也几乎不表达,即该基因具有诱导型组织特异性表达模式。原生质体瞬时表达发现Me NRT2.1定位在细胞膜上。此研究为进一步通过NRT2基因提高木薯的抗逆性奠定了基础。     

木薯淀粉分支酶基因克隆及反义表达载体的构建

利用RT-PCR方法,用木薯块根cDNA做模板克隆获得支链淀粉合成的关键酶基因SBEII,经序列分析,同源性为98.07%;以PCAMBIA1301为基础,构建了以块根特异表达启动子Sporamin驱动的SBEII基因反义结构的植物表达载体.     

木薯低温诱导基因MeLTI6A的启动子的克隆与序列分析

MeLTI6A（Manihot esculenta low temperature inducible 6A）是木薯低温干旱诱导基因,本研究从MeLTI6A 的序列出发,利用电子克隆设计引物进行PCR扩增的方法获得该基因的启动子,其序列共1 304 bp。生物信息学分析发现该启动子中具有真核生物典型的核心启动子区（TATA-box和CAAT-box）,并利用α-互补,蓝白斑筛选原理验证了该启动子核心序列具有活性;该启动子具有与干旱胁迫相关的激素类（如脱落酸、乙烯）的响应元件和逆境胁迫（如低温、干旱胁迫）的响应元件;还具有与木薯组织特异表达相关的调控元件和其它光响应元件;并通过Real time PCR检测了低温胁迫（4 ℃）下的木薯组培苗中MeLTI6A的表达变化,说明了该启动子区的低温胁迫顺式作用响应元件可能调节MeLIT6A在低温胁迫下的表达。这些说明木薯的MeLIT6A基因可能是通过对干旱胁迫激素信号响应以及逆境胁迫响应起作用,使木薯获得一定的抗胁迫的能力,同时还可能参与了木薯相关组织发育过程的调控。本研究有利于对MeLTI6A基因抗逆境胁迫功能的理解,为探索木薯高效抗逆的分子机制作初步研究。     

木薯耐寒相关microRNA的差异表达分析

采用荧光实时定量PCR(quantitative Real Time-PCR,qRT-PCR)技术对低温胁迫处理及对照的两个木薯品种C4和KU50材料进行差异表达分析。结果表明,该6个miRNA在胁迫材料与对照中的表达不同,不同品种及器官中也存在差异表达,且6个miRNA属于受低温诱导与上游调节基因相关的miRNA,这将成为今后研究的主要对象。     

木薯查尔酮合酶MeCHS基因家族特征与表达分析

查尔酮合酶（chalconesynthase,CHS）是类黄酮合成途径的第一个限速酶,在植物花色形成、生长发育以及非生物胁迫中发挥着重要作用。为明确木薯MeCHS基因家族的特性及在木薯块根采后腐烂（PPD）中的表达,本研究利用生物信息学方法对木薯MeCHS基因家族成员进行理化性质、蛋白质结构等分析。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测MeCHS基因在不同品种、不同组织及块根PPD过程中的表达情况,同时克隆并构建3个高表达的MeCHS基因的亚细胞定位载体并进行烟草瞬时转化以确定其定位。在木薯基因组中共鉴定出5个MeCHS基因家族成员,蛋白质二级结构以α-螺旋和不规则卷曲为主。qRT-PCR分析发现：MeCHS基因表达具有明显的组织特异性,在茎中表达水平最高;在木薯中主要表达的MeCHS基因为MeCHS1、MeCHS2和MeCHS3,且3个基因随着SC8块根贮藏时间的延长表达量逐步升高。将成功克隆得到的MeCHS1、MeCHS2和MeCHS3基因经农杆菌介导瞬时转化烟草下表皮细胞,显微观察表明3个基因均定位于细胞质,与预测结果相符。该研究结果可为进一步揭示木薯MeCHS基因家族的功...     

木薯转化酶抑制子MeINH3基因的克隆及生物信息学分析

转化酶抑制子调控转化酶的活性,在植物的糖代谢过程中具有重要作用。为了研究木薯的转化酶抑制子,本实验利用木薯基因组数据库分析及RT-PCR方法,从木薯中分离了1个木薯转化酶抑制子MeINH3的cDNA序列。MeINH3序列长度为564 bp,包含528 bp的完整开放阅读框,编码127个氨基酸,N端有16个氨基酸残基的信号肽,4个保守的半胱氨酸残基可形成两个二硫桥。亚细胞定位预测表明,MeINH3蛋白定位于胞外。根据生物信息学分析结果,推测其可能抑制木薯细胞壁转化酶活性。     

木薯蔗糖合酶(SuSy)基因的表达分析及SuSy1和SuSy4编码序列的克隆

依据拟南芥6个蔗糖合酶基因序列搜索木薯基因组数据库,获得了6个木薯蔗糖合酶基因亚型。将6个木薯蔗糖合酶基因亚型的外显子-内含子结构进行分析,结合其它物种蔗糖合酶基因的氨基酸序列构建进化树,将木薯蔗糖合酶基因可分为三类,分别为Su Sy1/Su Sy4,Su Sy2/Su Sy3和Su Sy5/Su Sy6。以木薯KU50的功能叶和5个不同时期块根的RNA为模板,利用RT-PCR的方法对蔗糖合酶基因家族进行表达分析,确定了Su Sy1和Su Sy4高表达的亚型,克隆并获得了Su Sy1和Su Sy4基因的编码区序列,对获得的序列进行同源性和功能结构域分析表明,2条序列的氨基酸同源性为97%,并且有相同的功能结构域。     

二穗短柄草2C型蛋白磷酸基因BdPP2C1的克隆及表达分析

从二穗短柄草中扩增得到一个2C型蛋白磷酸酶基因,命名为BdPP2C1。BdPP2C1与拟南芥中PP2C家族进行系统进化分析,结果表明,BdPP2C1与拟南芥A类PP2C家族成员的亲缘关系较近。利用实时荧光定量PCR表达分析系统,分析在非生物逆境胁迫及相关信号分子处理下BdPP2C1基因的表达情况。结果表明:该基因的表达受脱落酸(ABA)和双氧水抑制,并且受渗透和低温胁迫诱导。因此,BdPP2C1是非生物逆境胁迫中的一个应答因子,并且可能受相关信号分子调控。     

巴西橡胶树HbHMAD1的克隆及表达

根据已获得的在橡胶树自根幼态无性系与老态无性系胶乳中一个差异表达的片段序列设计引物,通过RACE法获得了橡胶树编码含有重金属相关结构域蛋白的cDNA,命名为HbHMADl.序列分析结果表明,HbHMA D1长为814bp,含有453 bp的阅读框,78bp的5’-UTR和283 bp的Y-UTR,编码150个氨基酸,分子量为16.9 ku,等电点为10.4.HbHMAD1含有重金属相关结构域,与蓖麻(Ricinus communis)、拟南芥(Arabodopsis thesis)(3个)和玉米(Zea mays)中的含有重金属相关结构域蛋白的同源性分别为85％、64％、63％、60％和55％.半定量RT-PCR分析表明HbHMA D1基因在胶乳和树皮中表达,在叶中微量表达,在花中基本不表达.     

小麦TaPP2C59基因的克隆及表达分析

2C型蛋白磷酸酶(PP2C)是ABA信号途径的关键组分,在ABA信号转导及植物对非生物逆境胁迫的应答过程中发挥着重要作用。为给TaPP2C59基因功能的研究奠定基础,同时为小麦对非生物胁迫应答的信号转导机理研究提供参考,本研究从小麦中克隆了第一个PP2C基因TaPP2C59,并对其在逆境胁迫以及多种信号分子处理下的表达模式进行研究。序列分析表明,该基因开放阅读框(ORF)为855bp,编码284个氨基酸。进化树分析表明,该基因编码的蛋白与水稻OsPP2C45蛋白和拟南芥AtPP2C59蛋白的亲缘关系最近。多序列比对分析表明,TaPP2C59具有PP2C家族蛋白的保守结构特征。实时荧光定量PCR分析表明,该基因的表达显著受ABA、低温和高盐胁迫抑制。因此,可以推测TaPP2C59可能作为负调控因子参与ABA信号及非生物逆境胁迫应答。     

小麦 TaSABP2基因的克隆及表达分析

为挖掘小麦抗逆基因,进一步解析小麦抗逆机制,采用电子克隆结合RT-PCR的方法,从小麦叶片中分离出 TaSABP2基因;利用生物信息学手段分析其序列特征;运用实时荧光定量反转录PCR(qRT-PCR)技术检测其在不同条件下的表达情况。结果表明,小麦 TaSABP2基因的cDNA全长为878 bp,包含一个长度为807 bp的开放阅读框,编码268个氨基酸。 TaSABP2基因的编码蛋白包含Abhydrolase及PLN02211两个结构域及一个酶活性中心(VVLVGHSLGG),属于Abhydrolase超家族的成员。其蛋白二级结构由四种形式构成,包括40.3%的α-螺旋、16.42%的延伸链、4.48%的β转角、38.81%的无规则卷曲。通过与其他植物的氨基酸序列进行多重序列比对,发现功能区域的氨基酸序列较为保守。qRT-PCR结果表明, TaSABP2基因的表达具有较强的组织特异性,植物激素ABA和BR处理及干旱和盐胁迫处理,均能诱导该基因的表达量迅速增加。以上结果表明, TaSABP2基因在小麦抵抗逆境胁迫过程中起到一定作用。     

木薯干旱胁迫响应基因MeGSTU7自然变异分析

在2个木薯品种中检测MeGSTU7基因在不同干旱胁迫阶段的表达量变化,并克隆测序了60个木薯品种的基因区DNA序列,分析基因核苷酸多态性及其自然变异,并将核苷酸多态性与干旱胁迫表型关联分析,挖掘优等位变异。结果表明,干旱胁迫条件下,2个品种的MeGSTU7的表达量均上调。MeGSTU7基因区核苷酸变异丰富,共有23个SNP位点,A/G突变为主;外显子区总计10个同义突变,12个非同义突变;外显子区在品种资源群体中有4种主要单倍型,所有的单倍型分为两大类,分子进化分析表明,MeGSTU7的外显子区的两端受到很强的正选择作用;Q+K+MLM混合线性模型关联分析结果表明,1个Indel和2个SNP与干旱胁迫下地上部鲜重耐旱系数显著关联,并筛选得到了优等位变异。     

橡胶树类萌发素蛋白基因HbGLP01的克隆及其表达分析

类萌发素蛋白(GLPs)是一类重要的胁迫响应蛋白,参与植物的多种生理调控过程。试验前期通过cDNA-AFLP技术,从橡胶树转录组中筛选到一个与麻风树JcGLP(XM_012225699.1)高度同源的差异表达片段。在此基础上,通过基因预测和PCR扩增克隆到一个GLPs类基因HbGLP01。该基因包含2个外显子和1个内含子,cDNA全长696nt,编码231个氨基酸,预测蛋白分子量和等电点分别为24.8ku和5.54。同源比对表明,该蛋白与麻风树JcGLP1-13蛋白的同源性最高,达到81%。聚类分析研究表明,该蛋白与JcGLP1-13、胡杨PeGLP1-13及三角叶杨PtGLP等聚为一个分支。qRT-PCR分析发现,多主棒孢病菌侵染能诱导橡胶树HbGLP01基因的上调表达,其中高抗棒孢霉落叶病品种IAN873在侵染后24h时表达量达到峰值,高感品种PR107在48h后达到峰值,而且在IAN873中的表达峰值显著高于PR107。     

芒果核苷二磷酸激酶(NDPK)基因克隆及表达分析

采用3′RACE和RT-PCR技术克隆芒果核苷二磷酸激酶基因全长c DNA序列,并用实时荧光定量PCR分析该基因的表达模式。结果表明:Mi NDPK1基因c DNA全长1 019 bp,开放阅读框为447 bp,编码148个氨基酸。Mi NDPK1蛋白定位于细胞质,无信号肽和跨膜区域,具有典型的核苷二磷酸激酶活性结构域和其他磷酸化活性位点;与麻疯树、橡胶树同源性最高为89%,与菠菜同源性最低为82%。Mi NDPK1在芒果各组织中均有表达,以叶片中表达最高,其次是花和果皮;在芒果进入生殖时期的花芽分化期表达量最高,此后在芒果果实发育进程中逐渐降低并趋于平稳。结合病害处理转录组样本中的差异性表达结果,推测芒果Mi NDPK1基因在花芽分化进程、抗病性诱导及免疫应答通路上发挥重要作用。     

巴西橡胶树HbMET的克隆与表达分析

通过同源克隆和RACE方法获得了巴西橡胶树DNA甲基转移酶(DNA Methyltransferase,MET)基因(Hb MET)。Hb MET长4 896 bp,含有4 635 bp的阅读框架,编码1 545个氨基酸。蛋白分子量174.36 ku,等电点为6.36。氨基酸序列与可可、毛果杨、黄瓜、拟南芥、碧桃、葡萄和烟草等物种的MET家族成员的同源性分别为73%、77%、74%、56%、72%和68%。进化树分析表明,Hb MET氨基酸序列与毛果杨的MET亲缘关系最近。Hb MET在巴西橡胶树的根、树皮、叶、胶乳中均有表达,其中在胶乳中表达量最低;Hb MET在橡胶树自根幼态无性系的胶乳中表达比老态无性系胶乳中的表达低。