虾青素对小鼠早期胚胎发育及相关基因表达的影响

试验旨在研究培养液中添加虾青素（AX）对小鼠胚胎体外发育和相关基因表达的影响。试验选用23~25 g的ICR系雌性小鼠,利用超数排卵,取卵母细胞进行体外受精,受精1 h后将受精卵随机分组、分别移入浓度为0、5、10、25、50 μmol/L的虾青素培养液中进行体外发育培养,在培养24和96 h后分别观察并统计各组的卵裂率和囊胚率;体外培养至96 h后,对囊胚进行细胞计数,统计囊胚细胞数差异;提取各组囊胚总RNA,利用实时荧光定量PCR技术对各组胚胎的TGF-β和Bcl-2基因的相对表达量进行检测。结果显示,添加10 μmol/L虾青素能够改善小鼠胚胎体外发育环境且显著提高胚胎卵裂率和囊胚率（P<0.05）;显著提高囊胚的细胞数（P<0.05）;极显著提高TGF-β基因表达量（P<0.01）。结果表明,添加10 μmol/L虾青素有利于小鼠胚胎体外发育,可用于改善小鼠胚胎体外发育环境;TGF-β和Bcl-2基因很可能参与了胚胎发育过程中的相关调控。     

小鼠胚胎常规冷冻和玻璃化冷冻效果的比较

将小鼠胚胎分别用常规冷冻法和OPS法冷冻，结果用常规冷冻法和OPS法冷冻小鼠桑葚胚，解冻后培养24h胚胎的发育率分别为87．32％、86．67％（P〉0．05）；用两种方法冷冻小鼠囊胚的结果分别为81．43％、83．56％（P〉0．05），结果表明用OPS法冷冻保存小鼠胚胎能达到用常规冷冻法的效果。     

小鼠胚胎常规冷冻和玻璃化冷冻效果的比较

将小鼠胚胎分别用常规冷冻法和OPS法冷冻,结果用常规冷冻法和OPS法冷冻 小鼠桑葚胚,解冻后培养24 h胚胎的发育率分别为87．32％、86．67％(P>0．05);用两种方 法冷冻小鼠囊胚的结果分别为81．43％、83．56％(P>0．05),结果表明用OPS法冷冻保存小 鼠胚胎能达到用常规冷冻法的效果。     

家兔桑椹胚和早期囊胚在饲养层表面的贴壁行为

探讨了不同状态家兔３日龄桑椹胚和４日龄囊胚在饲养层上的贴壁规律。结果表明，去除或保留透明带和胶膜的全胚贴壁最晚，离散胚在培养２４ｈ内即可贴壁，切割胚贴壁大多数发生于体外培养２４～４８ｈ之间。离散胚和切割胚都可能在培养１２ｈ后重新聚集成中空的亚囊胚结构。亚囊胚的贴壁过程是某一部位首先附着于饲养层表面，然后滋胚层铺展形成向下的拉力，使其全部贴壁。液滴培养与四孔板培养法对亚囊胚的贴壁无显著性差异     

不同冷冻和解冻方法对小鼠桑椹胚发育的影响

本试验以2种程序化冷冻液和2种玻璃化冷冻液对昆明白系小鼠的桑椹胚进行细管法冷冻保存,比较程序化冷冻-管外解冻和玻璃化冷冻-管内解冻对胚胎体内、外发育的影响。胚胎体外培养结果表明:玻璃化冷冻组及程序化冷冻组胚胎发育率(95.3%￣95.8%,98.9%)无显著(P>0.05)差异。将程序化冷冻、EFS30玻璃化冷冻以及新鲜的胚胎各168枚移植给假孕受体鼠,妊娠受体产活仔率各组间相比(50.8%,58.3%,54.9%)无显著性(P>0.05)差异。结果证明,玻璃化冷冻保存的胚胎管内解冻效果好,为生产中家畜的胚胎移植提供了理论和技术参考。     

Effects of Different Oocyte Activation Procedures on Development and Gene Expression of Porcine Pre‐Implantation Embryos

Among the factors that affect the efficiency of somatic cell nuclear transfer (SCNT) in pigs, the activation protocol is the most variable among the current SCNT procedures. The aim of this study is focused on defining an efficient activation treatment of porcine oocytes. In Experiment 1, we studied the effects of nine different oocyte activation procedures (including chemical‐ and electrical‐based treatments) on parthenogenetic embryo development. In Experiment 2, we studied the effect of the more efficient activation procedures on the gene expression profile of Oct4 and Igf2r in parthenogenetic blastocysts. In conclusion, ionomycin as a first calcium stimulus is not able to activate porcine oocytes efficiently in comparison with electric procedures. Electrical treatments with 6‐DMAP significantly increased the level of Oct4 expression, whereas the single and double pulse treatments alone maintained the same profile as the IVF group.     

玻璃化冷冻对小鼠GV期卵母细胞发育能力的影响

试验首次采用OPS法玻璃化冷冻小鼠GV期卵母细胞(不带卵丘细胞,下同),同时尝试用EDFS30对小鼠卵巢进行细管法玻璃化冷冻,以研究GV期卵母细胞冷冻后的发育潜力。首先,利用MEM培养和MEM-腔前卵泡培养新鲜GV期卵母细胞,并把较好的培养方式用于冷冻后培养试验。2种培养方式培养24h后新鲜GV期卵母细胞成熟率无显著性差异;OPS法冷冻的GV期卵母细胞解冻后成熟率及体外受精后卵裂率与对照组差异不显著(P>0.05)。细管法冷冻卵巢组织的GV期卵母细胞成熟率极显著低于对照组(P<0.01),其受精后未获得受精卵。结果表明:OPS法可有效地冷冻保存小鼠GV期卵母细胞,而细管法冷冻小鼠卵巢对GV期卵母细胞损伤较大。     

生长抑素与乙肝表面抗原真核表达载体构建及其对Vc獭兔生长的影响

人工合成生长抑素（Somatostatin，SS）基因。与乙肝表面抗原基因融合，插入pMD-18T克隆载体。经序列分析证明，所得目的基因743bp，与设计一致。提取质粒后用Sma I和Nhe I双酶切。克隆入pIRESlneo-CMV表达载体。构建pIRES-HBsAg／SS质粒。用乳酸乙醇酸共聚物包裹后。在Vc獭兔后肢进行肌肉注射。比较与注射生理盐水的对照组的增重差异，结果发现60d后。试验组家兔累积增重比盐水组高61．02％（P〈0．01）。     

兔NLRC3基因克隆及其表达特性研究

本研究旨在探究兔NOD样受体家族蛋白3（NOD-like receptor family CARD domain containing 3,NLRC3）基因序列、分子结构和体内外表达特性。根据GenBank中公布的预测序列（登录号：XM_017338739.1）设计引物,PCR扩增并克隆兔NLRC3基因,利用生物信息学方法对其分子结构进行预测分析。构建真核表达载体pcDNA3.1-rNLRC3-HA,通过间接免疫荧光试验探究兔NLRC3的亚细胞定位。通过实时荧光定量PCR检测NLRC3基因在兔各组织中的分布情况及肠出血性大肠杆菌感染后表达水平的变化。结果表明,兔NLRC3基因编码区长3 192 bp,相似性比对及系统进化树显示,兔NLRC3与其他哺乳动物相似性较高,并在进化树中处于同一分支。兔NLRC3由N-端、NACHT及LRR结构域组成,三级结构模型呈单曲率马蹄形,凸面由α-螺旋组成,凹面由β-折叠组成。间接免疫荧光试验结果显示,兔NLRC3位于细胞浆中,且不与线粒体共定位。兔NLRC3基因在所有被检组织中均有表达,且在脾脏中的表达量最高,其次是肠系膜淋巴结、淋巴滤泡。肠出血性大肠杆菌感染机体后,在脾脏、肝脏、肾脏中兔NLRC3基因mRNA表达量均上调,表明兔NLRC3基因参与了肠出血性大肠杆菌感染后的免疫应答。综上,本研究成功克隆了兔NLRC3基因并进行了生物信息学分析,明确其为胞内受体,在各组织中广泛分布,并参与了细菌感染后的免疫应答,为进一步探究兔NLRC3在炎症反应中的调控机制提供了基础材料。     

人MxA基因的原核表达及其抗血清的制备

本试验旨在利用大肠杆菌BL21(DE3)表达MxA融合蛋白pET32a(+)-MxA,制备兔抗人MxA抗血清。采用PCR技术获得MxA基因,然后将MxA基因重组到pET32a(+)载体中,筛选阳性克隆,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,用超声波裂解重组菌BL21(DE3)培养物,纯化蛋白质后免疫新西兰兔制备抗血清。SDS-PAGE分析结果显示,pET32a(+)-MxA融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中以包涵体形式高效表达;获得的抗血清经间接ELISA法检测效价为1∶6400;Western blotting检测结果显示,抗血清可与真核表达的MxA蛋白进行特异性结合。试验结果表明,在大肠杆菌中成功表达了pET32a(+)-MxA融合蛋白,制备了具有高度特异性的兔抗人MxA抗血清,这样为采用酶标法测定病毒患者全血细胞或由干扰素诱导的细胞产生的MxA蛋白质含量及临床诊断试剂盒的开发和应用打下了基础。     

中国株兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因在大肠杆菌中的表达及其免疫原性鉴定

应用RT—PCR技术扩增编码兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)WX84株衣壳蛋白VP60基因，将PCR产物按相应的阅读框架克隆到表达性载体pGEX-6P-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游。将重组质粒转化入大肠杆菌BL21株，在1．0mmol／L 1PTG和37C的条件下诱导，VP60—GST基因融合蛋白获了高效表达。经聚丙烯酰胺凝胶电泳和western-blotting试验证实所表达的融合蛋白产物相对分子质量与预期的87000相符。将表达产物经电泳切胶回收目的条带后免疫小鼠，所得抗血清应用间接ELISA检测，与RHDV病毒粒子呈阳性反应。试验结果表明，大肠杆菌中表达的RHDVVP60融合蛋白在抗原性上与天然衣壳蛋白具有一定的相似性。     

饲粮能量对家畜卵泡发育及其相关基因表达的影响

卵泡发育是家畜繁殖的基础,饲粮能量通过调控体内营养物质浓度、相关激素水平及mRNA表达等多方面影响家畜的卵泡发育。本文从饲粮能量水平、能源结构等方面综述能量对家畜卵泡发育的影响,并从能量对生殖激素、细胞增殖相关调控因子及营养物质转运蛋白等基因的调控方面简述其分子调控机制,为进一步研究能量对家畜繁殖性能的影响及其机理提供参考。     

皮下埋植褪黑激素对獭兔免疫器官、性腺发育和生长性能的影响

选用60只110日龄的獭兔分成3组,分别给予皮下不埋植和埋植8、16mg组褪黑激素,测定110日龄獭兔免疫器官发育、性腺发育、生长性能和被毛密度的指标。结果表明:皮下埋植褪黑激素对獭兔免疫器官、性腺发育和生长性能的影响均不显著(P>0.05),但能显著增加(P<0.05)獭兔的被毛密度。     

兔出血症病毒主要结构蛋白基因的克隆、原核表达及其免疫原性鉴定

本试验采用RT-PCR方法扩增了兔出血症病毒(rabbit haemorrhagic disease virus,RHDV)衣壳蛋白VP60基因。PCR产物纯化后连接T载体,提取质粒后,进行序列测定,将测序正确的纯化产物双酶切,克隆入原核表达载体pET28b(+)中,构建原核表达载体。将鉴定正确的重组质粒转化表达宿主菌E.coli Rosetta^TM,用IPTG诱导培养重组表达菌。经SDS-PAGE分析,在分子质量62.0 ku处可见明显的表达带,经Western blotting检测,约在62.0 ku处出现特异性的反应带。结果表明,表达蛋白具有良好的抗原性。     

Influence of Seasons, Extenders, Slow and Rapid Freezing on Seminal Characters in Korean Native Bucks

The success of AI technology is based on both semen quality and freezing process. In order to establish the semen freezing techniques in Korean native bucks, factors affecting the success were evaluated in the present study. Semen collected by electro-ejaculation from bucks during four distinct seasons was evaluated for semen volume and pH, sperm motility and survivability. The semen volume, concentration and total cell were higher in spring, summer and less in winter. Yet, there were no seasonal differences in the proportional data of live sperm, motility score and pH of semen among seasons. The percentage of live sperm after thawing was found to increase with increased concentration of lactose in Tris-Egg yolk-glycerol (TY-G), being highest in TY-G supplemented with 180 mm lactose (TYL180-G), but did not differ between TY-G and TYL120-G. Sperm motility was enhanced by employing 2.0 h equilibration time with rapid freezing method. In conclusion, semen could be frozen with high success rates for further use of AI in breeding techniques and to preserve the Korean native bucks.     

饲粮能量水平对后备母猪卵巢发育及相关基因表达的影响

本试验旨在研究饲粮能量水平对后备母猪卵巢发育及卵巢促卵泡素受体(FSHR)和促黄体素受体(LH/CGR)mRNA表达的影响。选择27头体重(61.0±3.1)kg的长×大二元母猪,随机分成3组(每组3个重复,每个重复3头猪),分别饲喂低、中、高3个能量水平[分别为NRC(1998)推荐消化能需要的90%、100%和110%]的饲粮。试验期内各组平均日采食量相同,但摄入的消化能水平不同。试验母猪在第2个发情期的第19天屠宰。结果表明:高能组卵巢重及大卵泡数显著高于低能组(P0.05);各组间小卵泡数量差异不显著(P0.05)。高能组卵巢FSHR和LH/CGR mRNA表达量最高,显著高于低能组(P0.05)。由此得出,高能量水平饲粮可促进后备母猪卵巢发育,有利于促进卵巢FSHR和LH/CGR mRNA的表达。     

Comparison of the Effects of Four Freezing Methods on Motility Characteristics,Morphology, and Viability of Postthaw Stallion Epididymal Sperm

Semen cryopreservation is of growing interest in the horse breeding industry, and collecting epididymal sperm might provide the chance to preserve genetic material from valuable stallions after severe injury or death. In case of an unexpected emergency, there may not always be an adequate laboratory nearby. Therefore, we compared fast and slow freezing methods using either a programmable freezer or a styrofoam box filled with liquid nitrogen. Epididymides of 10 stallions were collected immediately after routine castration under general anesthesia. Epididymal spermatozoa were evaluated before and after the freeze-thaw process for motility, viability, morphological, and kinematic parameters. Neither postthaw motility nor kinematic values differed among the four freezing protocols. Morphological abnormalities after freezing and thawing differed among epididymal segments. However, there were significantly more nonviable spermatozoa after the freeze-thaw process using the fast freezing process in the styrofoam box filled with liquid nitrogen compared with all other freezing processes. According to the results of this study, freezing in nitrogen vapor should be considered as an alternative to the programmable freezer only in combination with a prolonged cooling period.     

RNAi表达载体对avUCP基因表达的抑制作用

研究RNA干扰（RNA interference,RNAi）表达载体对UCP基因的抑制作用。针对鸡解耦联蛋白（avianuncoupling protein,av UCP）基因,构建4种RNAi质粒表达载体（分别称为A、B、C和D号载体）。再经过脂质体法转染成肌纤维细胞,应用荧光定量PCR及流式细胞术检测其对av UCP mRNA及蛋白表达的影响。构建的4种表达载体均抑制了av UCP的mRNA及蛋白的表达,其中转染C号载体的成肌纤维细胞av UCPmRNA表达相当于空白对照组的14.6%,蛋白抑制率达93.7%。RNAi表达载体可以有效的抑制avUCP基因的表达。     

豫丰黄兔与新西兰兔、哈白兔增重对比试验研究

豫丰黄兔与新西兰兔、哈白兔进行增重对比试验表明,豫丰黄兔在增重、饲料转换率方面都略高于新西兰兔,而稍低于哈白兔,经t检验差异不显著（P＞0.05）,说明豫丰黄兔作为一个新的培育品种,具有良好的生产能力和饲料转换能力。     

兔出血症病毒ZB分离株VP60基因克隆、截短表达与活性鉴定

为分析兔出血症病毒地方分离株的变异情况,并获得活性良好的兔出血症病毒基因工程抗原,对兔出血症病毒ZB分离株的VP60基因进行了克隆、序列分析与原核表达.ZB株分离病毒与GenBank中的6株RHDV VP60基因的核苷酸序列同源性在92.5％～97.9％之间,参照ZB株分离病毒VP60基因序列,设计合成一对特异性引物,PCR扩增了876 bp的VP60基因片段.将目的片段定向克隆至pET30a表达载体中,经鉴定正确后,重组质粒转化BL21表达菌,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组蛋白,重组蛋白纯化后,Western blot检测表明具有良好的抗原性与特异性.