利用siRNA高通量测序技术检测烟草病毒

<正>烟草是我国的主要经济作物之一,病毒病是烟草生产上的重要病害。常见的烟草病毒主要有马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein banding mosaic virus,TVMBV)等[1]。此外,近年来在烟草上还发生一些新的病毒病害,如南美红辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)[2]、番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus,ZTSV)[3]和番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)[4]。这些病毒     

利用小RNA测序技术鉴定吉林省甘薯病毒

在吉林省7个主要甘薯种植区共采集85份甘薯叶片样品,利用小RNA深度测序技术对混合样品进行检测,经RT-PCR和测序验证,鉴定出样品中存在10种病毒,包括6种RNA病毒和4种DNA病毒.分别是马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属的甘薯羽状斑驳病毒Sweet potato feathery mottle virus (SPFMV...     

利用小RNA深度测序技术鉴定上海地区‘红美人’柑橘病毒种类

为明确上海地区‘红美人’柑橘的病毒种类, 2020年4月在崇明、金山、奉贤、嘉定、闵行和浦东采集疑似病毒感染的叶片样品11份, 采用小RNA深度测序技术结合RT-PCR对不同来源的混合样品进行病毒种类鉴定。结果表明, 样品中含有柑橘衰退病毒Citrus tristeza virus (CTV)、柑橘黄化脉明病毒Citrus yellow vein clearing virus(CYVCV)、柑橘树皮裂纹类病毒Citrus bark cracking viroid(CBCVd)和柑橘类病毒Ⅴ Citrus viroid V(CVd-Ⅴ)。同时发现, 上海地区‘红美人’柑橘病毒复合侵染现象普遍。基于CTV和CYVCV的CP全长基因及CBCVd和CVd-Ⅴ全基因组序列系统进化分析结果表明:除了CYVCV的分离物与地理来源具有明显的相关性外, 其余病毒及类病毒均没有严格的地域相关性。研究结果为开展‘红美人’柑橘种苗病毒检测及病毒病的防治奠定基础。     

华南三省(自治区)部分西番莲种植区花叶病病原检测及EAPV多聚蛋白基因序列分析

<正>西番莲(Passiflora edulis Sims.)是热带亚热带地区重要经济作物,我国福建、广东、广西、海南等地广泛种植[1]。调查发现,我国南方多地西番莲花叶病为害严重,症状表现为叶片花叶、黄化、斑驳、畸形,甚至整株褪绿,严重影响西番莲的产量和品质。已报道能引起西番莲花叶症状的病毒有：黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)的黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus, CMV),     

基于小RNA深度测序技术鉴定侵染我国部分省市草莓种苗的病毒种类

随着草莓保护地栽培面积的增加和无性繁殖种苗的繁殖与调运,草莓病毒病的发生与流行日益严重。为明确侵染我国部分省市草莓种苗的病毒种类,应用小RNA深度测序技术进行检测,并利用RT-PCR技术对结果进行验证及序列分析。结果表明,从来自我国7省市的41株具有典型病毒病症状的草莓种苗样品中检测到草莓斑驳病毒strawberry mottle virus (SMoV)、草莓镶脉病毒strawberry vein banding virus(SVBV)和草莓轻型黄边病毒strawberry mild yellow edge virus (SMYEV)3种。SMoV、SVBV和SMYEV的检出率分别为34.1%、24.4%和2.4%。选取不同产地草莓种苗上检出的不同病毒进行部分序列测定和分析,获得了3个SMoV分离物(四川分离物schhy13、辽宁分离物lnhy23和河北分离物hbhy28)的部分RNA1 3′端非编码区606 bp核苷酸序列,其一致性为98.12%～99.34%。测定并获得了5个SVBV分离物(辽宁分离物lnhy15、lnhy17、lnhy24、河北分离物hbhy28和陕西分离物sh...     

小RNA深度测序鉴定昭通市烟草脉斑病病毒

烟草脉斑病在云南昭通市的烟草上发生危害严重,为明确昭通市烟草脉斑病的病毒种类,本研究采集昭通市的4个烟草种植区症状表现为疑似烟草脉斑病的烟草样品,采用小RNA深度测序技术对不同来源的混合样品进行小RNA测序分析。结果显示混合样品中的病毒分别属于烟草花叶病毒属Tobamovirus、马铃薯Y病毒属Potyvirus和马铃薯卷叶病毒属Polerovirus。根据不同病毒属设计通用引物,分别对不同地区的烟草样品进行RT-PCR验证,结果表明,烟草样品中病毒种类有烟草花叶病毒、烟草脉带花叶病毒、烟草脉扭病毒和马铃薯Y病毒的PVYN、PVYN-Wi和PVYNTN株系。     

基于小RNA深度测序和RT-PCR检测侵染广东省冬种马铃薯的病毒

为明确侵染广东省冬种马铃薯的病毒种类及优势病毒,结合小RNA深度测序技术及RTPCR检测方法,对采集于广东省冬种马铃薯7个主产区的189份疑似病样进行检测分析。结果表明,经小RNA深度测序技术检测马铃薯病毒病混合样,发现存在马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、马铃薯S病毒(Potato virus S,PVS)和马铃薯卷叶病毒(Potato leaf-roll virus,PLRV)3种病毒。进一步设计3种病毒的特异性引物并利用国内已报道的其它5种马铃薯病毒的特异性引物进行RT-PCR检测,发现189份马铃薯病毒病疑似病样中仅检测到PVY、PVS和PLRV这3种病毒,检出率依次为75.13%、10.05%和4.76%,且3种病毒在马铃薯上还存在复合侵染,复合侵染率为14.19%,其中PVY在各马铃薯产区均可检测到。表明侵染广东省冬种马铃薯的病毒为PVY、PVS和PLRV,其中PVY是优势病毒。     

利用小RNA深度测序技术从新疆葡萄上检出8种病毒

正Kreuze et al(.2009)发现病毒特异的小RNA(small RNA,sRNA)为多拷贝的重叠序列,推测可通过深度测序技术获得病毒的大量sRNA序列,经拼接和比对分析后能高效鉴定病毒种类。目前,利用sRNA深度测序技术已在作物和昆虫上发现多种病毒(Liu et al.,2011;He et al.,2015)。2013年本课题组在葡萄病害调查过程中发现,伊犁州部分地区的葡萄在种植4~5年后,叶片黄化、变小,整个植株矮化,座果     

‘阳光玫瑰’葡萄病毒小RNA测序鉴定及RT-PCR检测

 ‘阳光玫瑰’是我国从日本引进的葡萄优良品种。为了明确我国‘阳光玫瑰’葡萄病毒病的病原,本研究采用小RNA测序技术对2株显症和无症状的‘阳光玫瑰’葡萄样品进行病毒鉴定结果显示:显症样品中测定到8种病毒,其中包含葡萄蚕豆萎蔫病毒(Grapevine fabavirus, GFabV)和灰比诺葡萄病毒(Grapevine Pinot gris virus, GPGV);无症状样品中测定到3种葡萄病毒。对46个‘阳光玫瑰’样品进行14种葡萄病毒的RT-PCR检测,结果表明:‘阳光玫瑰’葡萄带毒率较高,病毒复合侵染情况普遍;显症样品中,GFabV检出率为88.2%,GPGV和葡萄浆果内坏死病毒(Grapevine berry inner necrosis virus,GINV)检出率为64.7%和29.4%,均明显高于无症状样品(13.8%和10.3%)。本研究旨在探明‘阳光玫瑰’葡萄携带病毒的种类和侵染状况,为其病毒病防控及病毒脱除奠定基础。     

小RNA生物合成途径主要元件调控稻瘟病菌生长发育和致病性

为探究小RNA生物合成途径主要蛋白在稻瘟病菌Magnaporthe oryzae生长发育、胁迫响应和致病过程中的作用,在野生型菌株Guy11背景下,分别构建其单基因敲除突变体ΔMoago3、ΔModcl2、ΔMordrp2和双基因敲除突变体ΔMoago3ΔModcl2、ΔMoago3ΔMordrp2、ΔModcl2ΔMordrp2,并测定不同突变体的营养生长、产孢过程、对不同胁迫的响应、致病性及侵染菌丝类型。结果显示,仅双基因敲除突变体ΔMoago3ΔModcl2和ΔMoago3ΔMordrp2的菌落直径较野生型菌株Guy11显著减少;突变体ΔModcl2和ΔModcl2ΔMordrp2的产孢量分别显著下降至野生型菌株Guy11和突变体ΔMordrp2的66.67%;十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate,SDS）、NaCl、山梨醇和H2O2胁迫对各突变体的抑制率影响不显著,但在刚果红胁迫下,突变体ΔMoago3、ΔMordrp2和ΔMoago3ΔModcl2的抑制率均显著高于野生型菌株Guy11的抑制率;与野生型菌株Guy11相比,突变体ΔMoago3、ΔModc...     

海南甘蔗病毒病的调查及其病原分子鉴定

 海南是我国重要的甘蔗生产省份之一,但其甘蔗主要种植区感染病毒的种类和数量尚不十分清楚,且海南甘蔗花叶病病原病毒缺乏分子水平的系统鉴定。为明确海南甘蔗病毒病的种类、数量、分布及危害情况,本研究拟建立较为完整的甘蔗病毒病检测技术体系,对海南甘蔗病毒病展开调查,为甘蔗抗病毒基因工程及健康种苗发展提供参考。     

引起甘蔗花叶病的病原分子生物学进展

花叶病是最主要的甘蔗病毒病害之一,在全球种植甘蔗的国家或地区普遍发生,可导致甘蔗产量下降,糖分减少,给甘蔗生产带来严重的经济损失。引起甘蔗花叶病的病毒主要有甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)、高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,Sr MV)和甘蔗条纹花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)。本文综述了这3种病毒的生物学特性、鉴定与检测、基因组结构与基因功能、遗传变异与分子进化等方面的研究进展,并讨论了对甘蔗花叶病的生态防控措施。     

水稻黑条矮缩病毒在灰飞虱消化系统的侵染和扩散过程

 水稻黑条矮缩病毒 (Rice black streaked dwarf virus, RBSDV) 由介体灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallén)以持久增殖型方式传播, 其编码的P9 1蛋白是形成病毒复制和子代病毒粒体装配的场所—病毒原质(viroplasm)的组分之一。为了明确RBSDV在介体昆虫体内的侵染循回过程, 本研究通过原核表达的P9 1蛋白免疫注射兔子制备P9 1抗体, 应用免疫荧光标记技术研究P9 1在饲毒后不同时期的介体灰飞虱体内的定位。共聚焦显微镜观察到饲毒后3 d, P9 1出现在介体中肠的少数上皮细胞内;饲毒后6 d, 在中肠外表的肌肉细胞分布有P9 1;饲毒后10 d, P9 1分布于中肠和后肠表面的肌肉, 同时在唾液腺也能观察到P9 1的存在。结果表明RBSDV在介体灰飞虱体内首先侵染中肠上皮细胞并复制, 随后扩散到中肠表面的肌肉细胞, 并通过环肌和纵肌扩散到中肠和后肠, 最后扩散到唾液腺。本研究首次直观地阐述了RBSDV在灰飞虱消化系统的侵染和扩散过程, 为有效阻断灰飞虱携带并传播病毒奠定基础。     

苹果花叶病毒的RT-PCR检测及其在我国苹果产区的分布

为了开发苹果花叶病毒（Apple mosaic virus,ApMV）田间样本RT-PCR检测方法和揭示我国ApMV的发生情况,以田间染病苹果组织为材料,对ApMV RT-PCR检测体系中总RNA提取方法、反应体系及程序进行了选择和优化,并利用优化的检测方法对我国苹果主产区13个省的23个市（县）ApMV发生情况进行了检测。以RNA提取改良法提取的田间样本总RNA为模板,RT-PCR优化体系的灵敏度达到能够检测15μg田间样本组织中的ApMV,且在果树整个生长发育时期能够检测1年生枝条树皮组织的带毒情况;ApMV在我国普遍发生,13个省的23个市（县）均检测到了ApMV,采集的327个样本带毒率为80.1%,其中未显花叶症状样本205个,ApMV阳性率为68.3%;在23个地区中,只有河北张家口、河南三门峡和陕西白水样本带毒率低于50%。     

Taxonomy of Wisteria vein mosaic virus and extensions to its host range and geographical distribution

Wisteria mosaic, a serious disease of Wisteria spp. in horticultural production in many parts of the world, is caused by a virus, Wisteria vein mosaic virus (WVMV). This paper reports the presence of the virus in a new host, Wisteria venusta , and a new geographical distribution, New South Wales, Australia. A partial sequence (1329 nucleotides) of this isolate of WVMV was obtained, which represents the first available sequence data for the virus. Alignment of the nucleotide and predicted amino acid sequences with those of members of the Potyviridae showed closest identity with viruses of the Potyvirus genus. The predicted amino acid sequence has one open reading frame, open at the 5' end, corresponding to part of the nuclear inclusion b protein and the capsid protein, followed by a 251-nucleotide untranslated region and a polyadenylated tail at the 3' end.     

侵染扶桑和棉花的木尔坦棉花曲叶病毒侵染性克隆构建及致病性测定

从广东广州扶桑和广西南宁棉花中分离得到木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus,CLCuMV)的2个分离物GD37和GX01,序列分析表明两分离物的基因组全序列同源性为99.4%,卫星分子序列同源性为99.2%。构建了GD37和GX01的侵染性克隆,农杆菌接种表明CLCuMV GD37能侵染本氏烟、心叶烟、三生烟、普通烟,GD37和GD37β共同接种产生叶片下卷、植株矮化等症状,但不能侵染棉花、番茄、矮牵牛;而分离自棉花的CLCuMV GX01能够侵染本氏烟,GX01和GX01β共同接种在本氏烟上产生叶片下卷皱缩等症状,但不能侵染棉花。Southern-blot结果表明在GD37单独侵染或与GD37β共同侵染的植株中均能检测到相应DNA分子的积累。     

应用纳米磁珠实时荧光定量PCR方法检测番茄黄化曲叶病毒

In order to develop a rapid, sensitive and specific qPCR assay for detection and quantification of Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), a pair of primers and TaqMan probe were designed according to the conserved sequence of known TYLCV isolates. Combining with MNP technique, a novel MNP-qPCR detection method was established and verified based on specificity, sensitivity and reproducibility tests. The results indicated that the Ct value of plotted standard curve showed good linear relationship(R² =0.9994)with the log of copy number of template. The established method showed a high specificity for TYLCV detection without crossing reaction with Tomato severe leaf curl virus and Tomato yellow leaf curl Sadinia virus, and was 10-fold more sensitive than routine PCR. Both coefficients of variation were less than 2%, indicating a good reproducibility. We have provided a novel method for detection of TYLCV in plant samples rapidly and quantitatively.     

应用多重PCR技术同步检测柑橘4种重要嫁接传播病原

 柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV),柑橘碎叶病毒(Citrus tatter|leaf virus,CTLV),柑橘裂皮病类病毒(Citrus exocortis viroid,CEVd)和柑橘黄龙病(Huanglongbing, HLB)亚洲种病原(Candidatus liberobacter asiaticus)是重要的柑橘嫁接传播病原。本文建立了同时检测HLB病菌、CTV、CEVd 和CTLV 4种柑橘嫁接病原的一步法、双温多重PCR检测技术体系,同时在体系中设置内参基因。应用该体系快速评价了4种嫁接传播病原在田间侵染情况,结果表明28个田间样品CTV、CEVd、CTLV和HLB感染率分别为89.3 %、17.9 %、10.7 %和28.6 %,接近半数样品为混合感染。并且将该方法应用于快速评价茎尖嫁接苗病毒的脱除情况。     

侵染中国河北大豆的大豆花叶病毒的鉴定和全基因组序列分析

本研究利用小RNA深度测序技术在河北卢龙大豆叶片上检测到6株大豆花叶病毒(soybean mosaic virus, SMV), 命名为SMV-Gm1~SMV-Gm6。根据小RNA深度测序结果和参考基因组序列设计引物克隆了SMV河北分离物的基因组序列。测序结果经拼接后获得了6个SMV基因组全长序列, 大小分别为9 588 nt(SMV-Gm1、SMV-Gm3和SMV-Gm5)和9 584 nt(SMV-Gm2、SMV-Gm4和SMV-Gm6)。开放阅读框位于基因组第132位至第9 332位核苷酸, 编码一个多聚蛋白(分子量约为350 kD)。BLAST比对和系统发育分析发现, SMV-Gm1、SMV-Gm3和SMV-Gm5与江苏SMV分离物(登录号:MH919386)的基因组核苷酸序列相似性最高, 为98.06%~98.07%, 且遗传距离较近, 并与江苏、浙江和山西SMV分离物聚为一小簇;SMV-Gm2、SMV-Gm4和SMV-Gm6与韩国SMV分离物(登录号:FJ640954)的基因组核苷酸序列相似性最高, 为98.48%~98.51%, 且遗传距离较近。     

引起玉米粗缩病的水稻黑条矮缩病毒河南分离物的分子特征

<正>目前已报道的造成玉米粗缩病的病原有3种,分别是玉米粗缩病毒(Maize rough dwarf virus,M RDV),水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)[1]。我国于1954年在新疆和甘肃发现该病,上世纪60年代曾在中东部夏玉米区流行,至70年代以来各玉米产区已陆续发生[2],近年来在黄淮海夏玉米区特别是套播或晚春播、早夏播玉米田发生危害严重。