玉米纹枯病菌诱导启动子P_(LHT1)核心顺式作用元件的鉴定

玉米纹枯病是玉米上重要的病害之一,前期通过高通量测序筛选到一个受纹枯病菌诱导表达的玉米基因LHT1,为了揭示该基因的调控机制,本研究克隆了该基因的启动子区域(P_(LHT1))并对其病原诱导核心元件进行了鉴定。结果表明,P_(LHT1)包含有4个激发子响应元件、3个GT-1元件、4个SA响应元件、3个ABA响应元件、1个生长素响应元件和1个GA响应元件。该启动子在多个组织器官中高水平表达,且在接种纹枯病菌菌株YWK196后,该启动子在4 h内就能够高效诱导表达报告基因。启动子截短分析发现,-1 416 bp至-1 087 bp区间的缺失使P_(LHT1)丧失了受纹枯病菌诱导的能力,对照Plant CARE的分析结果,该区段含有3个已知的病原菌诱导元件GT-1,将该区段内的3个GT-1进行单个缺失后,发现-1 416 bp至-1 087 bp区段受纹枯病菌诱导的活性减弱并未完全丧失;此外,将3个GT-1元件同时替换为GGGGGG后,-1 416 bp至-1 087 bp区域不再响应纹枯病菌的侵染,这些结果说明,这3个GT-1元件在P_(LHT1)响应纹枯病菌的侵染中协同发挥作用。     

小麦查尔酮合成酶基因及其启动子序列的克隆与分析

查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)是植物抗病抗逆过程中的一个关键酶。根据小麦抑制消减杂交中分离得到的小麦查尔酮合成酶基因片段,结合TAIL-PCR技术从小麦(Triticum aestivum L.)叶片中克隆得到查尔酮合成酶基因,命名为Ta CHS,其序列全长为2 543 bp,包含1 264 bp的启动子区、1 185 bp编码区和一个94 bp的内含子。分析显示该基因编码的氨基酸具有CHS家族的所有保守功能位点。同源性分析表明,Ta CHS与已报道的其他禾本科植物CHS基因编码的氨基酸序列同源性高达88%以上。启动子序列分析显示Ta CHS启动子区域具有光反应元件、植物激素响应元件、真菌诱导元件、M YB结合位点、TATA-Box和CAAT-Box等多种顺式作用元件。Ta CHS基因在全蚀菌侵染小麦后的表达开始上调,侵染后4 d达到最大值,之后开始下调。以上结果表明Ta CHS基因可能与小麦防御全蚀菌侵染有关。     

大豆疫霉细胞凋亡相关基因的鉴定与表达分析

为探讨大豆疫霉Phytophthora sojae细胞凋亡潜在的调控机制,根据已知的细胞凋亡蛋白,利用在线工具BLASTP、pFAM和SMART在大豆疫霉蛋白组数据库中鉴定细胞凋亡同源蛋白并构建其进化树,通过转录组数据和实时荧光定量PCR技术分析细胞凋亡相关基因在大豆疫霉生长、发育及侵染不同时期的表达情况。结果显示:在大豆疫霉中共鉴定到13个细胞凋亡同源蛋白,包括核酸内切酶G(PsNUC1)、细胞色素c(PsCYCS)、凋亡诱导因子(PsAIF)、丝氨酸蛋白酶(PsHtrA-1、PsHtrA-2和PsHtrA-3)、多聚ADP核糖聚合酶(PsPARP-1、PsPARP-2和PsPARP-3)和TatD核酸酶(PsTatD1、PsTatD2、PsTatD3和PsTatD4)。在进化上,PsNUC1、PsCYCS、PsAIF、PsHtrA-1、PsPARP-1、PsPARP-2、PsPARP-3、PsTatD1和PsTatD2与人及秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans的同源蛋白亲缘关系较近,而与真菌相关蛋白亲缘关系较远,PsHtrA-2、PsHtrA-3、PsTatD3和PsTatD4与酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae相关蛋白相似度更高,说明大豆疫霉细胞凋亡蛋白在进化中发生了较大变异。大豆疫霉细胞凋亡相关基因PsHtrA-1和PsRARP-1在孢子囊阶段诱导表达,PsHtrA-2和PsRARP-2在游动孢子阶段上调表达,PsAIF、PsHtrA-3、PsRARP-1和PsRARP-2在侵染阶段明显诱导表达,PsCYCS在侵染阶段下调表达。细胞凋亡相关基因在大豆疫霉不同阶段的表达模式有较大差异,说明细胞凋亡在大豆疫霉生长、发育及致病过程中具有重要作用。     

大豆与疫霉菌非亲和互作早期差异显示基因的表达分析

大豆疫霉根腐病是大豆的毁灭性病害。为了深入了解大豆对疫霉菌的分子抗病机制,以大豆疫霉菌1号生理小种游动孢子接种抗性品种绥农10的根部及下胚轴,通过反转录差异显示技术分离到疫霉菌侵染0、0.5、1、2和4h后大豆下胚轴和茎部的差异表达基因,其中至少有8个基因与抗病相关。接种后0.5 h开始上调表达的有肉桂酸-4-羟化酶基因、ATP合成酶β亚基基因,以及类花生泛素结合酶基因;接种后1h和2h依次开始上调表达的有尿苷二磷酸-N-乙酰基-α-D-氨基半乳糖基因和豌豆蓝铜蛋白基因;接种后4 h才上调表达的有TGA型碱性亮氨酸拉链基因、大豆环孢素基因和14-3-3蛋白基因。这8个基因中有1个基因与信号传导有关、4个基因与抗病和防御有关、2个基因与转录调控有关、1个基因与能量代谢有关。研究表明,以上8个基因在疫霉菌游动孢子萌发、侵入大豆和在大豆体内扩展过程中起着重要作用。     

白菜型冬油菜NCED3基因、启动子的克隆及其表达分析

从2个不同抗寒性的冬油菜品种中克隆了NCED3基因及其启动子序列,并分析其在叶片和根中的表达,研究NCED3基因在冬油菜中的作用机理。结果表明,陇油6号的NCED3基因开放阅读框(ORF)长度为1 794 bp,编码597个氨基酸,分子量65.74 kD,理论等电点为5.81;天油2号的ORF与其长度相同,分子量为65.78 kD,理论等电点为5.94。2个蛋白都是亲水蛋白,具有疏水峰。根据预测,启动子具有生物过程中常见的顺式作用元件如CAAT-box等、分生组织表达CAT-box相关的顺式作用元件、-30 TATA box附近的核心启动子元件等,还有ABRE、TGA-element、CGTCA-motif、TGACG-element等激素响应元件,此外,还鉴定出低温响应元件（LTR）。2个品种启动子序列的相似度为99.38%,只有1个不同的顺式作用元件,即circadian,推测其与昼夜节律相关。低温、PEG及ABA处理后NCED3在叶片和根中的表达均高于对照,增加范围为0.07~6.48,且均于8 h达到峰值。与根系的表达特性相比,胁迫处理后叶片的基因表达均在2 h显著升高,天油2号的升高幅度（1.54~6.00）均大于陇油6号（0.04~1.95）。     

含有多个应答逆境元件的合成启动子在水稻中的表达分析

 存在于启动子中的各种顺式作用元件在基因应答逆境的过程中起重要的作用，对这些元件进行适当组合是构建诱导型合成启动子的重要可行途径之一。本研究利用多个逆境应答元件(S盒、D盒、Gst1盒、TCA盒和LURP1基因启动子的-85~-46区)和CaMV35S核心(-46-+8)序列相连，组成一个人工合成启动子PRBS，并构建了GUS为报告基因的转化载体，通过农杆菌介导的遗传转化方法获得其水稻转基因植株。利用T₁代转基因水稻株系，通过检测GUS酶活性，研究了PRBS在不同逆境及外源激素作用下的表达特征。结果发现PRBS组成型表达水平低，可不同程度地应答稻瘟病病原菌侵染，机械损伤和外源激素(ABA、SA和MeJA)处理，表明PRBS可作为诱导型启动子用于水稻抗逆基因工程遗传改良。     

植物受病原物诱导启动子概述

植物受病原物诱导启动子是一类能对病原物的侵染作出响应的启动子,其活性主要局限于被侵染之时及被侵染的位点。植物受病原物诱导启动子的这一特性赋予其在抗病基因工程中潜在的应用价值。相比植物庞大的启动子组,已发现的植物受病原物诱导启动子仍是少数,关于其作用机制的研究仍有待加强和深入,而其调控的基因与植物抗病性关系还需要引起足够的重视。作者在对植物受病原物诱导启动子进行归类的基础上,重点关注了病原物诱导启动子调控基因的编码产物与植物抗病性的关系,对植物受病原物诱导启动子的顺式调控元件作了简要分析,并对该领域的发展动向进行了讨论。     

利用基因YKT6鉴定疫霉属的不同种

 利用分子标记或对特异位点的碱基序列进行分析是植物病原物分子检测的基础,可以在属和种的水平上对物种进行区分和鉴定。对疫霉属的不同种已有一系列的分子检测方法。SNARE蛋白相关基因YKT6拥有保守的侧翼编码区,适于设计疫霉属特异性的PCR引物,同时其内含子所具有的多态性可开发出几乎所有疫霉种的分子标记。利用疫霉属特异性引物对P-YKT6-F/P-YKT6-R可在31个疫霉种中特异地扩增出一条约600 bp的条带,而在腐霉或其他真菌中不能扩增出该条带。利用大豆疫霉的引物对Ps-YKT6-F/ Ps-YKT6-R和辣椒疫霉的引物对Pc-YKT6-F/Pc-YKT6-R,能分别从大豆疫霉菌株和辣椒疫霉菌株中扩增出一条399 bp和282 bp的条带,常规PCR和巢式PCR的灵敏度分别达到100 pg和10 fg。利用这些引物也可从土壤和病组织中检测到目标病原菌。此外,利用上述特异性引物开发出了大豆疫霉和辣椒疫霉的实时定量PCR检测方法。基于YKT6基因的分子标记和检测方法可用于疫霉种的调查检测和法定定量检测。     

葡萄VvSUC12基因启动子的克隆及上游调控因子鉴定

枝干病害葡萄溃疡病近年来严重限制了葡萄产业发展。研究表明葡萄蔗糖转运蛋白参与寄主植物和病原菌的互作过程。为解析蔗糖转运蛋白VvSUC12在葡萄免疫反应过程中的功能,本研究克隆了VvSUC12基因翻译起始位点上游1 500 bp的启动子区,通过生物信息学分析发现该区域包含4个Dof转录因子结合序列(A/TAAAG)及多种激素调节与防御相关的顺式元件。实时荧光定量分析显示,接种可可毛色二孢菌显著诱导VvSUC12和VvDof19基因的表达。通过酵母单杂交实验筛选得到与VvSUC12启动子互作的转录因子VvDof19。酵母双杂交实验证实VvDof19具有自激活活性;进一步通过烟草瞬时表达发现Dof19-GFP的相对GUS活性约为对照GFP的9倍,表明转录因子VvDof19能够激活VvSUC12基因的表达。研究结果为深入研究蔗糖转运蛋白在葡萄免疫反应中的功能奠定基础。     

芜菁WRKY group Ⅲ家族鉴定及其对根肿病菌和激素的响应

WRKY转录因子是植物中特有的一类转录因子，已有研究表明WRKY groupⅢ家族众多基因在抵御生物胁迫的过程中发挥着重要的作用。为了解WRKY groupⅢ家族成员在芜菁根肿病抗性中的潜在功能，利用生物信息学分析方法，鉴定到21个候选WRKY groupⅢ家族基因，其不均匀分布于芜菁的9条染色体，编码蛋白包含258～916个不等的氨基酸残基，含0～8个不等的motif结构，大部分成员包含按顺序排列的motif 4-5-7/(8-2)-1-3。WRKY groupⅢ家族各成员启动子区域含有大量光、激素和逆境胁迫响应元件，在激素响应元件中以Me-JA最多。qRT-PCR结果显示WRKY groupⅢ家族基因可响应根肿病菌诱导，其中BrWRKY46-2、BrWRKY70-2在抗病材料根部表达量显著上调，感病材料中降低；经外源SA诱导后表达量上调，Me-JA诱导后下调，表现出相反的表达模式。亚细胞定位结果显示，BrWRKY46-2和BrWRKY70-2均定位于细胞核中。推测芜菁WRKY groupⅢ家族基因广泛参与了根肿菌响应过程，且BrWRKY46-2和BrWRKY70-2与芜菁品种抗病和...     

稻瘟病菌一假定几丁质酶多克隆抗体的制备及其检测

 为检测几丁质酶的表达,制备稻瘟病菌的一假定几丁质酶多克隆抗体,探索其可能运用。将稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae) 几丁质酶基因克隆入融合表达载体pET\|32a,并在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行诱导表达。表达菌株经0.5 mmol/L IPTG诱导4～6 h后,用Ni²⁺\|NTA亲和柱纯化蛋白,得到可溶的几丁质酶\|His融合蛋白。以该融合蛋白免疫新西兰雄兔,制备多克隆抗体。ELISA分析表明该抗体效价达1∶204 800,特异性良好。用该抗体ELISA检测了稻瘟病菌4个不同田间菌株中,不同的菌株表达量不同。对稻瘟病菌侵染水稻3、5和7d后的病叶进行抗原Western验证,结果表明,稻瘟病菌不同的侵染时间其几丁质酶表达量有明显差异。 几丁质酶表达的差异是否与菌株间致病型等生物学和生理学差异有关,目前正在进一步研究。     

象耳豆根结线虫Hsp70基因的克隆与原核表达

采用RT-PCR、c DNA末端快速扩增法(RACE),克隆了象耳豆根结线虫Hsp70基因的全长c DNA(Me Hsp70)序列。Me Hsp70 c DNA全长2 203 bp,含有1 959 bp的开放阅读框,编码653个氨基酸,相对分子量为71.09 k Da,具有3段Hsp70家族的签名序列,Gen Bank登录号KF739434。同源性分析表明,氨基酸序列与其他真核生物的Hsp70序列具有很高的相似性。该Hsp70与其他物种中的Hsp70进行系统进化分析,结果显示,Hsp70的系统发育树不能体现物种间的亲缘关系,推测其反映的是不同物种间Hsp70生物学功能的相似性程度。构建了一个原核表达载体p EASY-E1-Me Hsp70,当IPTG终浓度为0.4~1.0 mmol/L时,能诱导表达融合蛋白。Me Hsp70基因的克隆和表达,将为象耳豆根结线虫的生态适应性机理研究提供依据。     

稻瘟病菌MoCOS1基因调控MoCMR1基因表达的研究

 以往研究证明MoCOS1可能是一个新型的转录因子,其突变体不产生分生孢子,黑色素合成明显减少。经过RNA-Seq分析,发现受MoCOS1调控的基因达到442个,其中MoCMR1的表达水平受到MoCOS1的下调。本研究中通过实时定量PCR进一步证实MoCOS1基因突变导致MoCMR1基因表达水平下降。基因MoCMR1突变后,黑色素产量略有减少,但分生孢子形态及产量和MoCOS1的表达量没有发生变化。     

葡萄A病毒外壳蛋白原核表达及抗血清制备

 葡萄A病毒（Grapevine virus A,GVA）为线性病毒科（Flexiviridae）葡萄病毒属（Vitivirus）的代表种,是葡萄皱木复合病（rugose wood complex disease）的重要病原之一,可引起葡萄嫁接成活率下降、春季萌芽延迟、生长减弱甚至衰退死亡等危害\[1,2\]。GVA为线状单链RNA病毒,基因组共编码5个开放阅读框（ORF1\|5）,其中ORF4 编码外壳蛋白（coat protein, CP）,是病毒粒子包裹和系统移动所必需的功能蛋白\[3,4\]。GVA自然寄主为葡萄,机械摩擦可侵染本氏烟等草本寄主\[2\],由于嫁接和无性繁殖材料调运等因素造成该病毒远距离传播,目前在世界多个国家和地区均有发生。     

一个推测的野油菜黄单胞菌Ⅲ型分泌效应子基因XopXccP对寄主植物的致病性分析

 野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv. campestris, Xcc)是一种在全球范围内引起十字花科植物黑腐病的重要病原细菌。Xcc中效应蛋白与植物互作机理的研究还不够全面, 在已经测序的菌株Xcc 8004中, Xc_2994基因预测编码一个III型分泌效应蛋白XopXccP, 其生物学功能尚不清楚。为了探索XopXccP的生物学功能, 我们构建了Xcc 8004菌株的XopXccP基因缺失突变体, 结果发现XopXccP基因缺失后, 病原菌在多个甘蓝、花椰菜以及模式植物拟南芥(Col-0)上的致病性显著下降, 甚至几乎不致病。同时, 采用农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法, 获得了转XopXccP基因拟南芥纯系, 经过诱导效应蛋白XopXccP在拟南芥中表达, 发现转基因拟南芥出现类似病斑的细胞死亡。本研究结果初步证明, XopXccP是一种毒性蛋白, 是Xcc 8004对多数十字花科植物致病所必须的。     

鞭毛素蛋白FliCxcv对水稻免疫反应的诱导功能鉴定

 为揭示来源于番茄细菌性斑点病菌(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Xcv)菌株XV18鞭毛素(FliCxcv)作为一种病原相关分子模式(PAMP)诱导水稻免疫反应的功能,本研究对FliCxcv编码基因flicxcv进行了基因克隆、序列分析、原核表达、蛋白纯化和诱导活性测定。结果表明,通过PCR特异性扩增,从Xcv菌株XV18中克隆了1 200 bp的fliCxcv基因片段,其序列与GenBank中己测序菌株的完全一致。在大肠杆菌中对该基因全长、N端和C端截短序列进行了原核表达,并获得了纯化的FliCxcv全长及其截短蛋白。将纯化蛋白浸润接种到水稻品种日本晴叶片组织,发现FliCxcv全长及其截短蛋白均能诱导水稻叶片细胞死亡、H₂O₂产生以及防卫基因(OsPAL和OsPR1b)表达等免疫反应,但诱导活性存在差异。因此,本研究验证了FliCxcv具有激发水稻细胞免疫反应的PAMP功能,为水稻免疫诱导制剂的研发提供了材料。     

瓜类细菌性果斑病菌hrcN基因的生物学功能分析

以分离自西瓜上的Aac5菌株为例,通过同源重组的方法,构建了hrc N基因插入缺失突变体,通过PCR方法和Southern blot验证突变菌株,对突变体进行致病性、致敏性、生长曲线和运动性测定。为明确hrc N基因与其他基因的关系,通过实时荧光定量PCR法定量检测了hrp A、hrc V、hrc U、Lux I、LuxR 5个基因的表达量。结果显示:与野生型相比,突变体致病力和致敏性明显减弱,致病时间延迟,群体感应信号减弱,生长能力明显下降,运动性减弱,互补菌株只能恢复部分功能;5个基因在突变体中的表达量均上调,hrc N基因与这5个基因之间均为负调控关系。说明hrc N基因在果斑病菌致病能力上发挥重要作用。     

棉铃虫类肌钙蛋白基因的克隆、原核表达纯化及其时空表达谱分析

为探索棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)类肌钙蛋白基因HaCal的生理功能及其所编码蛋白的生物特性,采用PCR方法克隆了HaCal的开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,借助在线软件对其进行生物信息学分析,通过原核表达技术诱导表达和纯化其编码的蛋白,并通过实时荧光定量PCR技术分析其在棉铃虫不同发育龄期和组织中的表达量。结果显示,HaCal的ORF序列长度为564 bp,编码187个氨基酸,理论分子量为20.52 kD,理论等电点为7.64。其保守结构域与Calponin家族一致,但不含跨膜区和信号肽,系亲水性蛋白。原核表达结果显示,融合蛋白大小与理论值一致,纯化获得了纯度较高的目的蛋白。HaCal在棉铃虫幼虫不同发育阶段和不同组织中均有表达,在6龄幼虫体内表达量最高,是1龄幼虫的2.34倍;在5龄幼虫中肠中表达量最高,是头部的257.14倍。表明棉铃虫类肌钙蛋白基因HaCal可能与棉铃虫的生长发育过程密切相关。