利用小RNA深度测序和组装技术鉴定紫藤花叶病病原

<正>RNA沉默(RNA silencing)是一种在真核生物体内普遍保守的基于核酸序列特异性抑制基因表达的调控机制[1]。2009年Kreuze等[2]发现病毒特异的小RNA(small RNA,sRNA)在序列上是重叠的,因此推测通过深度测序技术获得的大量sRNA序列能用来组装病毒的基因组并用来鉴定和发现新病毒。利用sRNA深度测序技术已在作物和昆虫上鉴定发现多种病毒[3、4],但在木本植物上还未见报道。     

基于高通量测序技术检测草地贪夜蛾病毒多样性

为探索草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda病毒的多样性,通过宏转录组和小RNA测序技术手段分析鉴定了自云南省采集的草地贪夜蛾田间自然种群携带的病毒类型。结果显示,宏转录组测序数据分析可比对得到14个病毒科,包括5个昆虫相关的病毒科,5个植物病毒科和4个细菌病毒科。昆虫相关的病毒分别属于杆状病毒科Baculoviridae、呼肠孤病毒科Reoviridae、分体RNA病毒科Partitiviridae、传染性软腐病病毒科Iflaviridae和弹状病毒科Rhabdoviridae,其中传染性软腐病病毒和分体RNA病毒为首次在草地贪夜蛾中报道。同时利用小RNA深度测序技术从草地贪夜蛾样品中检测到鳞翅目杆状病毒、分体RNA病毒和传染性软腐病病毒的序列,进一步验证了宏转录组的分析结果。表明利用高通量测序技术可初步揭示存在于草地贪夜蛾自然种群的昆虫病毒多样性。     

利用小RNA高通量测序技术检测玉米病毒

正玉米是我国重要的粮食作物,种植范围日趋增大,病害的发生对玉米造成极大为害,病毒病对玉米稳产高产已构成严重威胁。近年来,安徽、山东和辽宁玉米主要种植区病毒病危害较重。为了检测发病玉米的病毒种类,本研究利用小RNA高通量测序技术鉴定玉米病毒,明确种类,以期为制定抗病毒策略提供理论依据。据不完全统计,世界上有40多种玉米病毒病(http://en.wikipedia.org),在我国发生并报道的有5种,分别为玉米粗缩病、玉米矮花叶病、玉米条纹矮缩病、玉米红叶病和玉     

利用高通量测序检测新疆野苹果上的病毒

新疆野苹果Malus sieversii (Ledeb.) Roem.是苹果的祖先, 也是重要的育种遗传资源, 常用作砧木。近年来, 新疆野苹果的分布面积骤减, 对其的保护越来越重要。本研究采用高通量测序技术, 对采自新疆伊犁天山野果林的26份样本进行病毒检测, 检测到苹果褪绿叶斑病毒(apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV)和苹果茎痘病毒(apple stem pitting virus, ASPV)。通过RT-PCR检测所有样品(127份), 检测到ACLSV、ASPV和苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus, ASGV), 检出率分别为22%、19.7%和11%。结合RACE PCR技术扩增得到ASGV新疆野苹果分离物基因组全长序列, 暂时命名为ASGV-XJ。去除3′末端poly(A)后的长度为6 506 bp, 有两个彼此重叠的开放阅读框(open reading frame, ORF), ORF1(47-6 364 nt)编码一个241 kD的多聚蛋白, 包含甲基转移酶(methyltransferase)、木瓜蛋白酶(papain-like-protease)、解旋酶(nucleotide triphosphate-binding helicase)、RNA 依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase)和C端的外壳蛋白(coat protein, CP)等; ORF2(4 798-5 760 nt)编码一个36 kD的运动蛋白(movement protein, MP)。系统发育分析表明, 分离物间没有表现出寄主专一性和地理分布规律。上述结果对新疆野苹果的保护工作有重要的参考意义。     

2011年云南烟草病毒病发生动态及复合侵染分析

 烟草病毒病发生普遍,在我国部分烟区已上升为烟草的第一大病害。烟草是云南省主要经济支柱之一,然而,病毒病的发生严重影响烟叶的产量和质量,造成一定经济损失。20世纪80～90年代,我国系统地调查了全国烟草侵染性病害,并对侵染我国烟草的病毒种类和严重影响生产的主要种类进行鉴定检测。2005年Zhang等^［1］对云南烟草病毒病及病原进行了研究。但是随着种植业结构的调整,品种的更换,烟草病毒种类出现新的变化,在田间病毒侵染情况也会发生变化。因此,有必要重新调查和鉴定云南烟草病毒种类,弄清影响云南烟草的病毒种类和优势种类,明确其复合侵染情况,从而指导病毒病的防控。     

利用高通量测序分析侵染贵州火龙果的病毒

对疑似感染病毒的火龙果(Hylocereus undatus Britt.)进行高通量测序,分析病毒种类和相对含量,为火龙果病毒诊断和检测提供理论基础。测序reads经拼接和注释,共3 969条contig注释为病毒,包含44 354 147条reads。10条contig注释为CVX-NTU(JF937699),其含有的reads占所有病毒reads数量的85.18%;10条contig注释为ZyVX(AY366208),占所有病毒reads数量的4.97%;6条contig注释为SchVX(AY366207),占所有病毒reads数量的3.75%;6条contig注释为CVX(AF308158),占所有病毒reads数量的0.26%。拼接获得的CVX-NTU序列完全覆盖CVX-NTU(JF937699)基因组,核苷酸序列一致性为97%。编码的5个ORF核苷酸序列与CVX-NTU(JF937699)一致性为97%~98%,氨基酸序列一致性为97%~99%。拼接获得的CVX-NTU序列与CVX、ZyVX和SchVX的核苷酸序列一致性分别为78%、75%和70%。这是首次利用高通量测序检测火龙果病毒的报道。     

利用小RNA测序技术鉴定吉林省甘薯病毒

在吉林省7个主要甘薯种植区共采集85份甘薯叶片样品,利用小RNA深度测序技术对混合样品进行检测,经RT-PCR和测序验证,鉴定出样品中存在10种病毒,包括6种RNA病毒和4种DNA病毒.分别是马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属的甘薯羽状斑驳病毒Sweet potato feathery mottle virus (SPFMV...     

利用多重RT-PCR技术检测草莓病毒的研究

 目前已报道侵染草莓的病毒有20多种,其中草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus, SMoV)、草莓轻型黄边病毒(Strawberry mild yellow edge virus, SMYEV)和草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus, SVBV)是分布较广、危害较重的3种主要病毒。     

河南省烟草病毒的小RNA测序检测

To identify viruses in Henan tobacco-planting areas, from 2015 to 2017 and 2019, 288 symptomatic tobacco samples were collected and then subjected to small RNA sequencing. Results showed that at least 7 viruses were detected from these samples which including four previously reported viruses, cucumber mosaic virus (CMV), tobacco mosaic virus (TMV), potato virus Y (PVY) and tobacco vein banding mosaic virus (TVBMV). Other three viruses, wild tomato mosaic virus (WTMV), brassica yellows virus (BrYV), and cycas necrotic stunt virus (CNSV) were firstly detected in Henan province. However, tobacco etch virus (TEV) and tobacco ringspot virus (TRSV) were not detected from these samples. In addition, CMV, TMV, PVY, TVBMV, and BrYV were the dominant viruses infecting tobacco in Henan Province.     

小RNA深度测序鉴定昭通市烟草脉斑病病毒

烟草脉斑病在云南昭通市的烟草上发生危害严重,为明确昭通市烟草脉斑病的病毒种类,本研究采集昭通市的4个烟草种植区症状表现为疑似烟草脉斑病的烟草样品,采用小RNA深度测序技术对不同来源的混合样品进行小RNA测序分析。结果显示混合样品中的病毒分别属于烟草花叶病毒属Tobamovirus、马铃薯Y病毒属Potyvirus和马铃薯卷叶病毒属Polerovirus。根据不同病毒属设计通用引物,分别对不同地区的烟草样品进行RT-PCR验证,结果表明,烟草样品中病毒种类有烟草花叶病毒、烟草脉带花叶病毒、烟草脉扭病毒和马铃薯Y病毒的PVYN、PVYN-Wi和PVYNTN株系。     

利用小RNA深度测序技术鉴定上海地区‘红美人’柑橘病毒种类

为明确上海地区‘红美人’柑橘的病毒种类, 2020年4月在崇明、金山、奉贤、嘉定、闵行和浦东采集疑似病毒感染的叶片样品11份, 采用小RNA深度测序技术结合RT-PCR对不同来源的混合样品进行病毒种类鉴定。结果表明, 样品中含有柑橘衰退病毒Citrus tristeza virus (CTV)、柑橘黄化脉明病毒Citrus yellow vein clearing virus(CYVCV)、柑橘树皮裂纹类病毒Citrus bark cracking viroid(CBCVd)和柑橘类病毒Ⅴ Citrus viroid V(CVd-Ⅴ)。同时发现, 上海地区‘红美人’柑橘病毒复合侵染现象普遍。基于CTV和CYVCV的CP全长基因及CBCVd和CVd-Ⅴ全基因组序列系统进化分析结果表明:除了CYVCV的分离物与地理来源具有明显的相关性外, 其余病毒及类病毒均没有严格的地域相关性。研究结果为开展‘红美人’柑橘种苗病毒检测及病毒病的防治奠定基础。     

基于小RNA深度测序技术鉴定侵染我国部分省市草莓种苗的病毒种类

随着草莓保护地栽培面积的增加和无性繁殖种苗的繁殖与调运,草莓病毒病的发生与流行日益严重。为明确侵染我国部分省市草莓种苗的病毒种类,应用小RNA深度测序技术进行检测,并利用RT-PCR技术对结果进行验证及序列分析。结果表明,从来自我国7省市的41株具有典型病毒病症状的草莓种苗样品中检测到草莓斑驳病毒strawberry mottle virus (SMoV)、草莓镶脉病毒strawberry vein banding virus(SVBV)和草莓轻型黄边病毒strawberry mild yellow edge virus (SMYEV)3种。SMoV、SVBV和SMYEV的检出率分别为34.1%、24.4%和2.4%。选取不同产地草莓种苗上检出的不同病毒进行部分序列测定和分析,获得了3个SMoV分离物(四川分离物schhy13、辽宁分离物lnhy23和河北分离物hbhy28)的部分RNA1 3′端非编码区606 bp核苷酸序列,其一致性为98.12%～99.34%。测定并获得了5个SVBV分离物(辽宁分离物lnhy15、lnhy17、lnhy24、河北分离物hbhy28和陕西分离物sh...     

基于小RNA深度测序和RT-PCR检测侵染广东省冬种马铃薯的病毒

为明确侵染广东省冬种马铃薯的病毒种类及优势病毒,结合小RNA深度测序技术及RTPCR检测方法,对采集于广东省冬种马铃薯7个主产区的189份疑似病样进行检测分析。结果表明,经小RNA深度测序技术检测马铃薯病毒病混合样,发现存在马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、马铃薯S病毒(Potato virus S,PVS)和马铃薯卷叶病毒(Potato leaf-roll virus,PLRV)3种病毒。进一步设计3种病毒的特异性引物并利用国内已报道的其它5种马铃薯病毒的特异性引物进行RT-PCR检测,发现189份马铃薯病毒病疑似病样中仅检测到PVY、PVS和PLRV这3种病毒,检出率依次为75.13%、10.05%和4.76%,且3种病毒在马铃薯上还存在复合侵染,复合侵染率为14.19%,其中PVY在各马铃薯产区均可检测到。表明侵染广东省冬种马铃薯的病毒为PVY、PVS和PLRV,其中PVY是优势病毒。     

‘阳光玫瑰’葡萄病毒小RNA测序鉴定及RT-PCR检测

 ‘阳光玫瑰’是我国从日本引进的葡萄优良品种。为了明确我国‘阳光玫瑰’葡萄病毒病的病原,本研究采用小RNA测序技术对2株显症和无症状的‘阳光玫瑰’葡萄样品进行病毒鉴定结果显示:显症样品中测定到8种病毒,其中包含葡萄蚕豆萎蔫病毒(Grapevine fabavirus, GFabV)和灰比诺葡萄病毒(Grapevine Pinot gris virus, GPGV);无症状样品中测定到3种葡萄病毒。对46个‘阳光玫瑰’样品进行14种葡萄病毒的RT-PCR检测,结果表明:‘阳光玫瑰’葡萄带毒率较高,病毒复合侵染情况普遍;显症样品中,GFabV检出率为88.2%,GPGV和葡萄浆果内坏死病毒(Grapevine berry inner necrosis virus,GINV)检出率为64.7%和29.4%,均明显高于无症状样品(13.8%和10.3%)。本研究旨在探明‘阳光玫瑰’葡萄携带病毒的种类和侵染状况,为其病毒病防控及病毒脱除奠定基础。