侵染垂花悬铃花的木尔坦棉花曲叶病毒分子特征研究

 垂花悬铃花曲叶病是近期在广东发现的一种新病害,病株表现为叶片向上卷曲,叶脉肿大,叶脉变深绿色等症状。PCR检测结果显示, 该病样中均存在菜豆金色花叶病毒属病毒。基因克隆及序列分析结果表明,该病毒分离物（GD11）DNA-A全长为2 737 nt,具有菜豆金色花叶病毒属病毒基因组典型特征,为闭合环状单链DNA,编码6个ORFs;该序列与木尔坦棉花曲叶病毒(CLCuMV)各分离物序列的相似性均大于89.0%,其中与G6、Okra06及GX1等分离物序列的相似性大于99.0%。该病毒分离物也伴有卫星DNA β分子,其全长为1 348 nt,与CLCuMV各分离物的DNA β序列相似性大于85.0%,其中与G6、Okra06及GX1等DNA β的序列相似性均大于99.0%。因此,侵染广东垂花悬铃花的病毒分离物属于CLCuMV,且与入侵我国的朱槿分离物G6、黄秋葵分离物Okra06及棉花分离物GX1亲缘关系很近。本文首次报道了CLCuMV及其卫星β复合侵染垂花悬铃花。     

海南红麻曲叶病的病原检测与鉴定

 红麻曲叶病是2012年在海南省海口市发现的一种新病害,病株表现为叶片向上卷曲、叶脉肿大、叶脉变深绿色等症状。PCR检测结果显示,该病样中均存在菜豆金色花叶病毒属病毒。基因克隆及序列分析结果表明,该病毒分离物(HN08)基因组仅含A组分(DNA-A),其全长为2 738 nt,与木尔坦棉花曲叶病毒(CLCuMuV)各分离物的相似性均大于89.0 %,其中与中国各分离物的相似性均大于99.0 %。该病毒分离物也伴随有β卫星分子,其全长为1 346 nt,与CLCuMuV各分离物伴随的β卫星分子(CLCuMuB)序列相似性大于83.0 %,其中与分离物Fz1的序列相似性最高,为99.7 %。构建了HN08 DNA-A及其β卫星分子侵染性克隆,通过农杆菌注射接种红麻,接种后30 d,HN08 DNA-A及其β卫星分子混合接种的红麻植株新出叶片开始产生曲叶症状;接种后60 d,二者混合接种的植株大部分叶片表现为严重的曲叶症状,且与田间自然病株症状相同,而二者各自单独接种的红麻植株没有产生明显的症状。PCR及Southern blot检测进一步证实这些症状是由HN08 DNA-A及其β卫星分子的共同侵染引起的。因此,海南红麻曲叶病是由CLCuMuV及其伴随的β卫星分子(CLCuMuB)共同侵染引起的。本文首次报道了红麻是CLCuMuV自然新寄主。     

伴随卫星分子的两种单组分双生病毒TbCSV和TYLCCNV之间的拮抗互作

为明确烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus,TbCSV)和中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leafcurl China virus,TYLCCNV)在不同寄主中的相互作用,将含有TbCSV分离物Y35(Y35)和TYLCCNV分离物Y10(Y10)及伴随卫星DNAβ(Y35β或Y10β)侵染性克隆的农杆菌按不同组合接种本氏烟和心叶烟,定期观察植株症状。结果表明,当Y10和Y35同时伴随Y10β或Y35β时,接种植株60天后,在本氏烟中引起的曲叶症状减轻,而在心叶烟中曲叶症状减轻的现象在侵染早期较明显,且植株表现的症状与Y35+Y10β或Y35+Y35β引起的症状相似。PCR及Southern印迹检测结果显示,在本氏烟植株中,两种病毒及卫星在整个侵染过程中均能复制,且Y10和Y35的复制水平在侵染后期均降低。在接种后15天的心叶烟植株中能检测到所有DNA组分,但接种100天后在这些植株中均不能检测到Y10的复制,而Y35的复制水平与单独伴随卫星相比差异不大。表明TbCSV与TYLCCNV在症状形成和复制水平上存在拮抗互作,且这种拮抗作用随寄主不同表现各异。     

侵染曼陀罗的中国番茄黄化曲叶病毒及其卫星DNAβ全基因组结构特征

 从云南大理曼陀罗上采集到病毒分离物YN72,症状表现为叶脉增厚、叶片褪绿、植株矮化。全序列测定表明,YN72DNA-A全长2739个核苷酸。基因组比较发现,YN72DNA-A与中国番茄黄化曲叶病毒分离物(TYLCCNV-[Y43])同源性最高(93.4%),与中国番茄黄化曲叶病毒烟草分离物(TYLCCNV-[Y5])的同源性次之(92.9%),而与亚洲地区的其它双生病毒的同源性均在90%以下,表明曼陀罗中的分离物YN72是TYLCCNV的1个分离物。利用WTGs卫星分子DNAβ的特异性引物beta01和beta02,在YN72中PCR扩增到DNAβ分子。序列分析表明,YN7213全长1335个核苷酸,在其互补链上编码1个有功能的ORF(C1)。YN72β的全序列与TYLCCNV分离物卫星分子Beanβ和Y297β的同源性最高,分别为99.8%和99.3%;与其它所比较的DNAβ的同源性均低于80.6%。系统进化树研究表明,YN72卫星分子DNAβ与其辅助病毒是共同进化的。     

江苏朱槿上分离到的木尔坦棉花曲叶病毒基因组结构特征分析

 2012年5月,江苏南京朱槿上出现一种新的病毒病害,病株表现明显的叶片上卷、叶脉肿大、叶背伴有耳突、植株矮缩等症状。根据其症状及介体发生状况,对其伴随的病毒种类进行研究,结果发现采集的46份典型症状样品体内均可以检测到粉虱传双生病毒,对其基因组DNA-A组分克隆测序后发现其全长2 736 bp,编码6个ORF,BLAST分析显示该病毒与木尔坦棉花曲叶病毒同源性最高(99.9%),是木尔坦棉花曲叶病毒的一个分离物。病样中同时还检测到伴随DNAβ卫星分子,测序结果显示该卫星全长1 346 bp,编码1个ORF,BLAST及聚类分析结果显示该β卫星与木尔坦棉花曲叶病毒β卫星同源性最高(99.7%),为木尔坦棉花曲叶病毒β卫星的一个分离物。这是木尔坦棉花曲叶病毒首次在长江流域的报道。     

番茄黄化曲叶病毒北京分离物侵染性克隆的构建与其致病性

为明确番茄黄化曲叶病毒北京分离物（Beijing isolate of tomato yellow leaf curl virus,TYLCV-BJ）致病性的强弱,以感染TYLCV-BJ的番茄叶片DNA为模板PCR扩增获得该分离物基因组全长序列,并构建该分离物的侵染性克隆,将其分别接种到番茄、烟草和拟南芥植株上,比较该分离物和TYLCV上海分离物2(TYLCV-Shanghai 2,TYLCV-SH2)致病性的差异。结果显示,该分离物基因组全长序列同TYLCV-SH2的相似度为99.03%,在番茄和烟草植株上TYLCV-BJ比TYLCV-SH2发病更早,症状更重,TYLCV DNA和外壳蛋白积累量更高。TYLCV-BJ可以通过农杆菌Agrobacterium tumefaciens注射法在拟南芥中复制和系统侵染,而TYLCV-SH2不能有效侵染拟南芥。表明TYLCV-BJ的致病性强于TYLCV-SH2,所建立的侵染性克隆有广泛的研究和应用价值。     

木尔坦棉花曲叶病毒编码蛋白的亚细胞定位分析

 木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus,CLCuMV)是典型的单组分双生病毒,并伴随β卫星分子,是棉花曲叶病的主要病原之一。本研究利用农杆菌介导的瞬时表达系统,将CLCuMV及其卫星分子编码的7个病毒蛋白在本氏烟表皮细胞中表达。通过激光共聚焦显微镜观察发现:V1、C2和C3定位于细胞核;C1和βC1定位在细胞核以及细胞质或细胞膜上,并且在细胞质中形成丝状结构;V2和C4主要定位在细胞质或细胞膜上,细胞核也有微量表达,V2可形成大小不一的颗粒状聚集体结构,C4在细胞膜上可见点状聚集体结构。同时,利用RT-PCR和Western blot对病毒各基因的转录和表达水平进行了分析。CLCuMV编码蛋白的亚细胞定位为蛋白功能的进一步研究提供重要理论依据。     

香石竹斑驳病毒云南分离物全基因组序列测定和侵染性克隆构建

香石竹斑驳病毒(Carnation mottle virus,CarMV)是危害香石竹的一种重要病毒,本研究通过构建农杆菌介导的CarMV侵染性克隆来进一步研究该病毒基因功能。首先获得CarMV云南分离物全长序列,与报道的上海分离物相似性达到94.78%;将CarMV全长cDNA基因序列构建到具有35S启动子的双元表达载体pCV-nGFP,通过农杆菌浸润到本氏烟中瞬时表达,本氏烟系统叶片RT-PCR能检测到CarMV。试验结果表明,本研究构建Car-MV侵染性克隆通过农杆菌介导可快速高效侵染植物,可以用于病毒基因功能研究;同时CarMV云南分离物全长序列测定结果表明其属于P164 K331组群。     

黄瓜花叶病毒两个甜瓜分离物的基因组及其侵染性克隆

为明确黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus,CMV）甜瓜分离物的分子变异情况及其侵染性,对2个甜瓜分离物CH99和XH18的基因组进行克隆、测序和分析,并通过构建全长cDNA克隆分析其侵染性。结果显示,黄瓜花叶病毒甜瓜CH99分离物3条RNA长度分别为3 356、3 049和2 211 nt,甜瓜XH18分离物3条RNA长度分别为3 381、3 048和2 217 nt。分离物CH99与XH18的核苷酸序列一致性为89.40%～95.80%,氨基酸序列一致性为90.00%～97.80%,CH99分离物与其他CMV分离物的核苷酸和氨基酸序列一致性平均值分别为79.23%～89.29%和73.52%～93.90%,XH18分离物与其他CMV分离物的核苷酸和氨基酸序列一致性平均值分别为79.81%～89.83%和74.02%～95.14%。遗传发育分析显示,这2个分离物均属于亚组IB成员。接种试验结果显示,分离物CH99和XH18的侵染性克隆构建成功,这2个分离物均能系统侵染本生烟、甜瓜和黄瓜,并在本生烟和甜瓜上引起较严重的症状,在黄瓜上引起的症状较弱,而二者均不能侵染西...     

侵染云南雾水葛的菜豆金色花叶病毒属病毒的全基因组结构特征

 为明确云南雾水葛表现叶片黄化、花叶等症状的植株是否被菜豆金色黄花叶病毒属病毒侵染,本研究通过PCR扩增、克隆测序及核苷酸序列特征分析,确定样品中病原种类及其系统进化关系。结果显示,该病样中检测到雾水葛金色花叶病毒(pouzolzia golden mosaic virus,PouGMV),该分离物全基因组具有典型的菜豆金色花叶病毒属单组分病毒结构特征,与来自越南的Vietam分离物(KC857508)亲缘关系最近,相似性最高达94.6%,与PouGMV其他分离物亲缘关系相对较远,相似性在88.9%~93.2%之间。病毒alpha卫星分子检测及分析显示,该样品中检测到的alpha卫星分子,其全长核苷酸序列与云南番茄黄化曲叶alpha卫星(tomato yellow leaf curl Yunnan alphasatellite,TYLCYnA)相似性最高,达到92.3%。研究结果表明云南雾水葛中分离到PouGMV,且异源伴随TYLCYnA卫星分子。这是雾水葛金色花叶病毒伴随alpha卫星分子侵染雾水葛的首次报道。     

木尔坦棉花曲叶病毒已对我国棉花生产构成严重威胁

木尔坦棉花曲叶病毒是引起巴基斯坦和印度棉花曲叶病流行的主要病原之一,是由烟粉虱以持久方式传播。近年来,在广东和广西分别发现了严重侵染朱槿和黄秋葵的木尔坦棉花曲叶病毒。虽然广东和广西不种植棉花,但该病毒传播介体烟粉虱在广东、广西及我国棉花产区都有分布。因此该病毒的入侵,对我国棉花生产构成严重威胁。     

传播木尔坦棉花曲叶病毒的烟粉虱隐种鉴定

为明确广东地区传播木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus,CLCu Mu V)的烟粉虱隐种,采用分子鉴定、烟粉虱传毒试验与分子检测的方法,对传播CLCu Mu V的烟粉虱隐种进行了鉴定。结果表明:在广东棉花、红麻和黄秋葵曲叶病发生的田间,2014年采集的30头烟粉虱mt COI与Asia II 7隐种序列同源性为98.3%~99.6%,2015年采集的10头烟粉虱中,8头烟粉虱mt COI与MEAM1隐种序列同源性为99.2%~99.5%,2头烟粉虱mt COI与Asia II 7隐种序列同源性为99.8%~99.9%,说明烟粉虱种群包括入侵隐种MEAM1和土著隐种Asia II 7。在利用烟粉虱人工传毒试验中,MEAM1、Asia II 7和Asia II 1这3个隐种均可在棉花曲叶病株上饲毒获得CLCu Mu V及β卫星分子;除MEAM1隐种外,Asia II 7、Asia II 1隐种可传播CLCu Mu V,侵染红麻及黄秋葵植株引起曲叶病,前者传毒效率分别为50%和100%;而后者为33%和100%。以上3个烟粉虱隐种传毒接种棉花未见成功。     

应用纳米磁珠实时荧光定量PCR方法检测番茄黄化曲叶病毒

In order to develop a rapid, sensitive and specific qPCR assay for detection and quantification of Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), a pair of primers and TaqMan probe were designed according to the conserved sequence of known TYLCV isolates. Combining with MNP technique, a novel MNP-qPCR detection method was established and verified based on specificity, sensitivity and reproducibility tests. The results indicated that the Ct value of plotted standard curve showed good linear relationship(R² =0.9994)with the log of copy number of template. The established method showed a high specificity for TYLCV detection without crossing reaction with Tomato severe leaf curl virus and Tomato yellow leaf curl Sadinia virus, and was 10-fold more sensitive than routine PCR. Both coefficients of variation were less than 2%, indicating a good reproducibility. We have provided a novel method for detection of TYLCV in plant samples rapidly and quantitatively.     

我国46个棉花品种对木尔坦棉花曲叶病毒的抗性鉴定

为明确我国主要棉花品种对木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus,CLCuMuV)的抗性水平,采用烟粉虱田间自然传毒和CLCuMuV侵染性克隆人工接种方法分别对收集的46个棉花品种进行抗性鉴定。结果显示:46个棉花品种田间播种后90 d,新海21号、新海31号、新37号及112-2号4个品种自然发病的病株率为41.70%~100.00%,病情指数为39.81~100.00;新陆早36号、新陆中52号、中棉35号、中棉43号、鲁棉研36号、金宏祥10号6个品种的病株率为8.30%~16.70%,病情指数为0.93~9.26;其余品种未见发病。46个棉花品种人工接种CLCuMuV后60 d,新海21号、新海31号、新海37号和112-2号4个品种的病情指数为75.00~100.00,表现为高感;新陆中66号和新陆早46号病情指数分别为20.83和20.37,表现为中感;新陆早62号等10个品种的病情指数为10.46~15.87,表现为中抗;新陆早47号等14个品种的病情指数为5.26~9.26,表现为抗病;豫棉15号等11个品种的病情指数为2.22~4.86,表现为高抗;新陆早13号、新陆早61号、新陆中32号、新陆中56号和中棉41号病情指数均为0,表现为免疫。     

Tomato leaf curl Guangxi virus is a distinct monopartite begomovirus species

Three begomovirus isolates were obtained from tomato plants showing leaf curl symptoms in Guangxi province of China. Typical begomovirus DNA components representing the three isolates (GX-1, GX-2 and GX-3) were cloned and their full-length sequences were determined to be 2752 nucleotides. Nucleotide identities among the three viral sequences were 98.9–99.7%, but all shared <86.7% nucleotide sequence identity with other reported begomoviruses. The sequence data indicated that GX-1, GX-2 and GX-3 are isolates of a distinct begomovirus species for which the name Tomato leaf curl Guangxi virus (ToLCGXV) is proposed. Further analysis indicated that ToLCGXV probably originated through recombination among viruses related to Ageratum yellow vein virus, Tomato leaf curl China virus and Euphorbia leaf curl virus. PCR and Southern blot analyses demonstrated that isolates GX-1 and GX-2 were associated with DNAβ components, but not isolate GX-3. Sequence comparisons revealed that GX-1 and GX-2 DNAβ components shared the highest sequence identity (86.2%) with that of Tomato yellow leaf curl China virus (TYLCCNV). An infectious construct of ToLCGXV isolate GX-1 (ToLCGXV-GX) was produced and determined to be highly infectious in Nicotiana benthamiana, N. glutinosa, tobacco cvs. Samsun and Xanthi, tomato and Petunia hybrida plants inducing leaf curl and stunting symptoms. Co-inoculation of tomato plants with ToLCGXV-GX and TYLCCNV DNAβ resulted in disease symptoms similar to that caused by ToLCGXV-GX alone or that observed in infected field tomato plants.     

Agroinoculation Shows Tobacco leaf curl Yunnan virus is a Monopartite Begomovirus

We demonstrated that only 2 out of 15 isolates of Tobacco leaf curl Yunnan virus (TbLCYNV) were associated with the satellite DNAβ molecules. To investigate the infectivity of this virus, an infectious clone of TbLCYNV isolate Y143 (TbLCYNV-Y143) was agroinoculated or whitefly transmitted into Nicotiana benthamiana, N. glutinasa, Petunia hybrida and N. tabacum. TbLCYNV-Y143 alone was able to induce severe upward leaf curling, vein thickening or stunt symptoms in these plants. Co-inoculation of TbLCYNV-Y143 with DNAβ molecules associated with other begomoviruses induced similar symptom types on these plants. This indicates that TbLCYNV is a monopartite begomovirus. The relevance of results that only two isolates of TbLCYNV were associated with DNAβ molecules is discussed.