抗朊蛋白单抗用于牛海绵状脑病检测和细胞型朊蛋白在中枢神经组织中的定位和分布

朊病毒病（又称传染性海绵状脑病）的病原是致病型朊蛋（PrP^Sc），聚集在牛脑中能够引发牛海绵状脑病（BSE）。利用自制的单抗4C11和国外同类单抗进行免疫组织化学（IHC）的比较染色，结果显示单抗4C11和国际上常用的单抗在BSE阳性切片的IHC染色结果上没有显著差异；利用单抗4C11结合IHC方法检测中国山东省150例牛脑样品的实验表明，所有送检样品中IHC的检测结果均为阴性，而且IHC方法比较适合于我国BSE的检测；对中枢神经组织内细胞型PrP^c的IHC定位结果显示，PrP^c在牛脑组织不同部位的分布有差异。     

一种根癌农杆菌介导的GFP亚细胞定位方法的优化

利用根癌农杆菌介导的方法,采用CaMV 35S强启动子启动的含有GFP报告基因的双元表达载体pCAMBIA1301-35S-GFP-AZI1转化烟草表皮细胞。在激光共聚焦显微镜下进行观察,有绿色荧光产生。本文优化了GFP亚细胞定位的方法,即烟草为本氏烟草2～3周龄叶片,菌液OD600值为0.8,共培养时间为32 h,在此条件下能很好地进行GFP的亚细胞定位,为进一步研究新基因的亚细胞定位和瞬时表达奠定了基础。     

利用植物悬浮培养细胞进行蛋白质快速定位分析的方法

稳定遗传表达分析是一种植物中常用的整体解析基因的方式。有多种转化方式可供选择,也可根据所需要的获得的转基因植物材料选择受体材料。但是由于稳定遗传转化周期较长且大部分材料不适合于进行荧光观察,所以在一些基因的研究中逐渐被瞬时表达分析系统。虽然瞬时表达分析用时短,但是转化效率受到多方面的限制,转化材料无法保存。目前由于植物悬浮培养细胞材料均一,增殖迅速并且可以满足大批量研究需求逐渐成为植物研究中的热点材料。以此同时,在亚细胞定位方面,悬浮培养细胞还是良好的应用材料。采用农杆菌介导法进行植物悬浮培养细胞的转化中方法较为成熟,但是获得纯净的转基因细胞系的转化周期较长。在本研究中针对上述问题我们建立了一种转化时间短,转化效率高的植物悬浮培养细胞稳定遗传转化体系。同时将这个体系应用到基因的亚细胞定位当中进行蛋白质快速定位分析。     

鸡Perilipin1基因的克隆及亚细胞定位

本研究旨在克隆鸡(Gallus gallus)脂滴包被蛋白基因(Perilipin1)的cDNA序列,并检测其在鸡前脂肪细胞分化过程中的亚细胞定位.本研究以7周龄肉鸡腹部脂肪组织为材料,采用RT-PCR和RACE的方法扩增并克隆了鸡Perilipin1基因的5'UTR、CDS和3'UTR片段,分析了该基因的结构;以鸡原代前脂肪细胞为材料,利用免疫荧光及激光共聚焦技术,在诱导分化的不同时间点(12～120 h),检测了鸡Perilipin1在前脂肪细胞中的表达位置.结果表明,本研究获得的鸡Perilipin11基因5'UTR、CDS和YUTR序列总长度为2 379 bp,该基因由9个外最子、8个内含子组成(ATG位于第二外显子上);在鸡原代前脂肪细胞诱导分化过程中,Perilipin1始终包被在脂滴周围.综上,本研究成功克隆了鸡Perilipinl基因的完整cDNA序列并确定了Perilipin1在鸡前脂肪细胞分化过程中与脂滴的空间位置关系,该结果为深入开展鸡Perilipinl基因的功能研究,揭示鸡脂肪代谢的分子遗传机理提供了重要的理论依据.     

水稻中介体亚基的表达谱分析及亚细胞定位

中介体是一种大分子蛋白复合物,在真核生物的转录调控中发挥重要的作用。基因的时空表达控制着植物的生长和发育。虽然近年来拟南芥(Arabidopsis thaliana)中介体亚基的功能研究进展迅速,但对其基因的时空表达信息知之甚少。为研究水稻(Oryza sativa)中介体亚基基因的表达模式,以拟南芥中介体亚基基因为查询序列,在NCBI核酸数据库上进行搜索,共获得24个水稻中介体亚基基因,其中除了Med19存在两个拷贝以外,其余22个亚基基因均为单拷贝。利用水稻21个组织共59个样本的芯片数据,对23个中介体亚基基因的表达数据进行聚类,结果表明,OsMed12的表达组织特异性最强,其次为OsMed11,其他21个亚基基因表达无明显规律,较接近组成型表达。以GUS为报告基因的OsMed8启动子活性分析结果与其表达谱结果一致,可以看出在植株的分生组织、营养生长早期和生殖生长初期表达较强。亚细胞定位结果显示,OsMed6被定位在细胞核中;OsMed8定位在细胞核和细胞质膜中。本研究获得了水稻中介体基因的表达模式和蛋白亚细胞定位的重要的数据,对于进一步研究水稻中介体亚基的功能提供了很有价值的参考信息。     

香蕉MaROP1基因表达产物的亚细胞定位

植物类Rho相关G蛋白（Rho-related GTPases from plants,ROP）属于小G蛋白超家族,是高等植物体内广泛存在的一类重要信号分子,在植物生长发育过程中起着关键的调控作用。本实验室从香蕉果实采后抑制差减杂交文库中获得一个香蕉ROP基因,命名为MaROP1。半定量RT-PCR表明该基因在香蕉的根、球茎、叶、花和果实中的表达存在差异,其中在球茎中的表达量最高且与其它器官的表达差异显著。为进一步研究该基因的功能,构建了以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）为报告基因的融合植物表达载体pCAMBIA1302-MaROP1,并利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱表皮细胞瞬时表达,荧光显微镜检测表明该基因表达产物定位在细胞膜上。     

基于液滴微流控的壳寡糖植物免疫诱导剂荧光检测

为了建立基于液滴微流控芯片平台的植物免疫诱导剂的荧光信号检测技术,该文设计制作了具有液滴生成结构的芯片,制备包裹烟草(BY-2)细胞的液滴,并对包裹了细胞的液滴数目进行统计分析。将包裹细胞的液滴孵育一氧化氮探针后使用质量浓度为50μg/m L壳寡糖处理,在荧光显微镜下观测其产生的荧光,利用荧光酶标仪对比采用96孔板和液滴承载的细胞的荧光变化趋势。结果显示,水相流速为100μL/h,油相流速为300μL/h时,微流控芯片产生的液滴尺寸适合包裹细胞,其中液滴包裹单细胞的比例达22.9%。经壳寡糖处理后的细胞在生成的液滴中产生了明显的荧光,且用96孔板和液滴承载的细胞的荧光变化趋势一致。研究结果为开发基于液滴微流控技术的植物免疫诱导剂的高通量筛选平台提供参考。     

猪犁鼻上皮的超微结构及酶细胞化学定位的研究

扫描和透射电镜下见受体细胞树突的表面有大量的微绒毛和静纤毛,但无嗅泡和纤毛,核上区有发达的高尔基复合体,树突内有大量的线粒体、溶酶体和滑面内质网,树突顶部有2～10个中心粒和许多小泡。支持细胞的特征是表面有一些胞质突。基细胞很少,有时见到有丝分裂相,说明受体细胞和支持细胞由基细胞分化来。受体细胞的GERL系统和各种溶酶体呈CMP酶阳性,而自噬小体呈CMP酶阴性。结合透射电镜和电镜酶细胞化学定位,证明受体细胞有活跃的自体吞噬活动。静纤毛的顶端和犁鼻管腔的分泌物呈AKP酶阳性,说明受体细胞有分泌功能.     

水稻1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶基因OsITL1的克隆、亚细胞定位及表达分析

磷酸肌醇代谢在生物感受胞外刺激及信号转导中起着重要的作用.1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶（5/6-激酶）是磷酸肌醇代谢过程中很重要的一种酶,它具有肌醇激酶和蛋白激酶的双重功能.我们曾对拟南芥中的5/6-激酶基因AtITL1在逆境胁迫中的功能进行了研究,初步证明该基因与渗透胁迫有关（Chen et al.,2003）,本研究采用电子克隆的方法得到了水稻的5/6-激酶基因OsITL1,并对其亚细胞定位及在逆境胁迫下的表达特点进行了分析.     

枳两个GRAS基因cDNA全长的克隆及其亚细胞定位分析

利用生物信息学方法以拟南芥SCL6和杨树GRAS cDNA 序列作为模板,对柑橘EST数据库进行同源检索筛选出柑橘SCL6和GRAS基因的cDNA序列,并以枳[Poncirus trifoliata （L.） Raf.]花cDNA为模板,根据以上cDNA序列设计5＇末端和3＇末端扩增的特异引物,利用5＇ RACE和3＇ RACE技术,分别获得该基因的5＇和3＇末端,序列拼接后获得枳的SCL6和GRAS cDNA全长.分别命名Pt-SCL6和Pt-GRAS,大小分别是2 668 bp 和1 911 bp,在GenBank的登录号分别是GQ505957和GU072592,其分别编码706个和636个氨基酸全长.生物信息学分析表明Pt-SCL6和Pt-GRAS的cDNA序列中分别有microRNA171 （miR171） 和miR1446的识别位点,其与其它植物的GRAS一样有着高度保守的序列即GRAS结构域.构建Pt-SCL6和Pt-GRAS亚细胞定位载体35S-GW-GFP-GQ505957/GU072592,基因枪转化洋葱表皮细胞,暗培养24 h后激光共聚焦显微镜下观察.亚细胞定位结果表明Pt-SCL6和Pt-GRAS均定位于细胞膜中.转录因子Pt-SCL6和Pt-GRAS表现出在细胞膜区域定位的现象.     

pH和三种阴离子对紫色土亚硒酸盐吸附-解吸的影响

p H和三种竞争性阴离子对紫色土亚硒酸盐吸附-解吸的影响的研究结果表明,随着p H的增大,紫色土对亚硒酸盐的吸附量减少,酸性条件下紫色土对亚硒酸盐吸附量最大。平衡液中加入磷酸氢二钠显著降低了土壤对亚硒酸盐的吸附,硫酸盐对紫色土吸附亚硒酸盐的影响很小,低浓度碳酸氢根离子对紫色土吸附亚硒酸盐具有促进作用,但高浓度的碳酸氢根离子则降低了紫色土吸附亚硒酸盐。磷酸氢根离子和硫酸根离子对亚硒酸盐吸附的影响符合Langmuir和Freundlich拟合方程式,决定系数R2值均在0.90以上。三种阴离子对亚硒酸盐的解吸影响不同,当有磷酸氢根离子和碳酸氢根离子存在时,亚硒酸盐的解吸率增大,而硫酸根离子的存在却对紫色土亚硒酸盐的解吸影响不大。在紫色土地区农业生产中采用含磷酸盐肥料和碱性碳酸氢铵肥料,这些措施可能增加土壤硒的有效性,进而增加植物硒吸收和积累。认识紫色土固液界面硒的吸附-解吸规律,可为提高紫色土地区硒生物有效性,从而进一步提高农产品中硒含量提供科学依据。     

Effects of iron toxicity on the morphological and biological characteristics of rice root border cells

Toxicity of Fe²⁺ is one of the major constraints for lowland rice production in tropical and subtropical areas. The root tip is a primary site of iron (Fe²⁺) toxicity in rice. To explore the effects of iron toxicity on the morphological and biological characteristics on the border cells in rice (Oryza sativa L.), experiments were carried out using the border cells in two cultivars. The experimental results revealed the following properties of border cells shared by both rice cultivars: the first border cells appeared almost synchronously with the emergence of the primary root tip; the number of border cells reached maximum when the root was 25 mm long; the border cells were most viable when the root length was 20 mm; and the relative activity of pectin methylesterase (PME) was the highest when the root length was 2 mm. The two rice cultivars exhibited different trends in their response to Fe²⁺ toxicity: the number of root border cells in Fe²⁺-resistant Zhongyou 9288 increased when experiencing low levels of Fe²⁺ treatment, but then declined at higher Fe²⁺ levels. The number of root border cells in Fe²⁺-sensitive Shanyou No. 10, however, declined rapidly when the concentration of Fe²⁺ increased. The results also showed that Fe²⁺ toxicity hindered the development of root border cells of both rice cultivars, but the Fe²⁺ sensitive variety experienced thickened the root cap cell walls that led to programmed cell death.     

水牛输卵管上皮细胞无血清培养的研究

以广西沼泽型水牛（Bubalus bubalis）输卵管为材料，比较研究不同取材方法、有无血清及生长因子对水牛输卵管上皮细胞培养的影响。试验采用了三种不同的取材方法。原代用含血清的培养液来培养，传代用添加生长因子的无血清复杂培养液和不添加生长因子的无血清基础培养液结合梯度减量无血清培养法和直接无血清培养法来培养并进行观察。结果表明，水牛输卵管上皮细胞可以在添加生长因子的无血清复杂培养液中生长、并且最长可维持56d优于基础无血清培养的15d；刮取法获得的细胞活率为95％优于消化法的70％和剪碎法的83％；细胞冷冻复苏率为83．6％；第5代的染色体数目为48条，这说明细胞依然保持正常的生物学特性和二倍体核型。     

Growth of hydrogenotrophic and acetoclastic methanogens on substrate from rice plant callus cells in anaerobic soil: an estimation to the role of slough-off root cap cells to their growth

Flooded paddy fields are the major anthropogenic sources of methane (CH₄) emission, and organic materials of rice plant origin were estimated to be important as its source. This study used rice (Oryza sativa L. cv, Yukihikari) callus cells as a model material for slough-off root cap cells, and carbon-13 (¹³C)-labelled callus cells were subjected to decomposition in aerobic and anaerobic soil microcosms for 56 days. DNA was extracted from a soil incubated with carbon-12 (¹²C)- and ¹³C-callus cells and subjected to buoyant density gradient centrifugation to identify methanogenic archaeal species that assimilated carbon from the callus cells. ¹³C-labelled 16S rRNA gene (16S rDNA) fragments from methanogenic archaea were not polymerase chain reaction (PCR)-amplified in heavy fractions under aerobic soil conditions, while they were successfully done from day 3 onwards under anaerobic soil conditions. Eighty-four denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) bands in heavy fractions were sequenced, revealing that they were members of Methanosarcina spp. (20 clones), Methanosaeta spp. (18 clones), Methanocella spp. (25 clones), Methanomicrobiales (10 clones), Methanobacterium spp. (7 clones) and Cluster ZC-I (2 clones). They included hydrogenotrophic and acetoclastic methanogens and were phylogenetically different from those residing in rice roots and, presumably, from those assimilating root exudate and mucilage-derived carbon. This study indicates that carbon of slough-off root cap cells propagates specific methanogenic species in rice rhizosphere under anaerobic soil conditions and thus augments the diversity of the total rhizospheric methanogenic community.     

猕猴桃皮多酚提取及其对B16细胞黑色素的影响

植物多酚类物质对皮肤增白和美容有着重要的作用,是美容护肤保健品中的主要成分,猕猴桃皮中多酚类物质含量丰富,可成为美容保健品的原料。为了探究猕猴桃皮中多酚类物质的提取及其美白作用,该研究采用深共熔溶剂（Deep-Eutectic Solvents,DESs）提取猕猴桃皮多酚,通过单因素试验和响应面试验确定优化提取工艺,用高效液相色谱分析猕猴桃皮多酚的成分,并研究猕猴桃皮多酚对酪氨酸酶的影响及对B16细胞黑色素的作用机制。结果表明：深共熔溶剂是提取猕猴桃皮多酚的较佳溶剂,提取猕猴桃皮多酚优化工艺为DES-1含水率18%、料液比1:29 g/mL、提取时间22 min、提取温度69 ℃,猕猴桃皮多酚得率55.53 mg/g。猕猴桃皮多酚中的主要成分有(+)-儿茶素、绿原酸、咖啡酸和表儿茶素,并且猕猴桃皮多酚对体外酪氨酸酶活性有抑制作用。此外,当猕猴桃皮多酚浓度为100 μg/mL时对B16细胞内黑色素生成有明显的抑制作用,能使细胞内黑色素相对含量降为75.08%,细胞内酪氨酸酶活性降至69.45%,且优于阳性对照组曲酸（P<0.05）。结果表明,猕猴桃皮多酚可作为一种天然美白剂应用于化妆品及其他保健品中。     

氮素不同形态配比对菠菜体内游离氨基酸含量和相关酶活性的影响

采用溶液培养试验,研究了氮素不同形态配比对菠菜茎叶中游离氨基酸含量及3种主要氮代谢酶活性的影响。结果表明:1)随着营养液中铵硝比(NH4+-N/NO3--N)的降低,菠菜茎叶中游离氨基酸的总量呈下降趋势。在全硝营养下(NH4+-N/NO3--N=0∶100)下,菠菜茎叶中游离氨基酸的总量只有全铵营养(NH4+-N/NO3--N=100∶0)的34.4%。2)在全铵营养下,菠菜茎叶中游离氨基酸的主要组分是谷氨酰胺、精氨酸和谷氨酸,三者占游离氨基酸总量的百分比依次为39.8%、20.2%和8.9%;在全硝营养下,菠菜茎叶中游离氨基酸以谷氨酸、天冬氨酸和丝氨酸为主,三者占游离氨基酸总量的百分比分别为30.3%1、8.6%和8.5%。3)提高营养液中硝态氮的比例,可以显着提高菠菜茎叶中硝酸还原酶(NR)的活性,同时降低了谷氨酸脱氢酶(GDH)的活性,谷氨酰胺合成酶(GS)活性则呈现先升后降的抛物线状变化规律。4)菠菜茎叶中NR活性与谷胺酰胺含量之间存在着显著负相关关系(r=-0.968)。     

猪体细胞核移植电融合参数的研究

本研究用体外成熟42-46h的猪卵母细胞为核移植受体,猪颗粒细胞为核移植供体,对猪体细胞核移植的电融合参数进行了探讨。结果发现,当脉冲时间为40μs时,0．77kV／cm组的融合率（59．3％）明显高于1．54kV／cm组（38．6％,P〈0．05）,分裂率（77．8%）及桑椹胚／囊胚发育率（33．3％）显著高于2．31kV／cm组（52．2％,13．6％,P〈0．05）;当电场强度为0．77kV／cm时,20μs组的融合率（68．0％）明显高于30μs组和40μs组（42．7％和35．5％,P〈0．05）,分裂率（89．3％）明显高于脉冲时间为40μs组（60．5％）;当电场强度为0．77kV／cm,脉冲时间为20μs时,电脉冲1次的融合率（72．8％）明显高于电脉冲2次（56．0％,P〈0．05）,在直流电脉冲前是否施加交流电（1．0V）对融合率（70．0％vs76．0％）、分裂率（77．3％vs75．0％）以及胚胎发育率（17．3％vs18．4％）均无显著影响（P〉0.05）。 以上结果表明,在本所实验室条件下,猪体细胞核移植中的适宜电融合参数为：0．77kV／cm,20μs,电脉冲1次,这将为随后的猪体细胞核移植奠定了基础。     

Frequency of phage-infected bacterial cells in the floodwater of a Japanese paddy field

In aquatic environments, viruses play an important role in the microbial food web through microbial mortality from viral lysis. Bacteriophages (phages) compose the majority of viral communities in the floodwater of paddy fields. The present study evaluated bacterial mortality from phage lysis in the floodwater of a Japanese paddy field based on the frequency of phage-infected bacterial cells by transmission electron microscopy. Floodwater was sampled five times during the rice cultivation period from two plots of NPK plus lime (no-compost plot) and NPK plus lime and compost (compost plot) under a long-term and ongoing fertilizer trial that began in 1925. The frequency of visibly infected cells in the compost plot was larger, ranging from 2.4 to 3.6% (average 3.0%), than that in the no-compost plot, which ranged from 1.6 to 2.9% (average 2.0%). The fractions of bacterial mortality from phage lysis in the floodwater samples were estimated to range from 12.8 to 27.3% (average 17.2%) and from 21.7 to 35.0% (average 27.9%) for the samples collected from the no-compost plot and the compost plot, respectively. This is the first study to estimate bacterial mortality from phage lysis in the paddy field ecosystem, and the frequency of phage lysis in floodwater was found to be within the frequency ranges observed in other aquatic environments.     

Effects of zinc activity in nutrient solution on uptake,translocation, and root export of cadmium and zinc in three wheat genotypes with different zinc efficiencies

The interactions of zinc (Zn) and cadmium (Cd) in uptake and translocation are common but not consistent. We hypothesized that Cd²⁺ and Zn²⁺ activity in the apoplasmic solution bathing root-cells could affect Zn accumulation in plants dependent on the wheat genotype. This hypothesis was tested using seedlings of two bread wheat genotypes (Triticum aestivum L. cvs. Rushan and Cross) and one durum wheat genotype (Triticum durum L. cv. Arya) with different Zn efficiencies grown in chelate-buffered nutrient solutions with three Zn²⁺ (10^?11.11, 10^?9.11, and 10^?8.81?µM) and two Cd²⁺ (10^?11.21 and 10^?10.2?µM) activity levels. Increasing Zn²⁺ activity in the nutrient solution significantly increased Zn concentration in root and shoots of all three wheat genotypes, although the magnitude of this increase was dependent on the genotype. Cadmium decreased Zn concentration in roots of “Cross” while it had no significant effect on root Zn concentration in “Rushan.” At Zn^2+?=?10^?11.11?µM, Cd decreased shoot Zn concentration in “Arya” whereas it increased shoot Zn concentration at Zn^2+?=?10^?8.81?µM. Cadmium increased shoot Zn concentration of “Rushan” and “Cross” at Zn^2+?=?10^?8.81?µM but it had no significant effect on shoot Zn concentration of these genotypes at Zn^2+?=?10^?11.11?µM. The zinc-inefficient genotype “Arya” accumulated significantly more Cd in its root in comparison with “Cross” and “Rushan.” Cadmium concentration in roots of “Arya” was decreased significantly with increasing Zn activity. The effect of Zn on accumulation of Cd in roots of “Cross” and “Rushan” was dependent on the dose provided, and therefore, both synergistic (at Zn^2+?=?10^?9.11?µM) and antagonistic (at Zn^2+?=?10^?8.81?µM) interactive effects were found in these genotypes. Zinc supply increased the Zn concentration of xylem sap in “Cross” and “Rushan” whereas Zn content in xylem sap of “Arya” was decreased at Zn^2+?=?10^?9.11?µM and thereafter increased at Zn^2+?=?10^?8.81?µM. Cadmium treatment reduced Zn concentration in xylem sap of “Arya,” while it tended to increase Zn content in xylem sap of “Cross.” At Zn-deficient conditions, greater retention of Zn in root cell walls of Zn-inefficient “Arya” resulted in lower root-to-shoot transport of Zn in this genotype. Results revealed that the effect of Cd on the root-to-shoot translocation of Zn via the xylem is dependent on wheat genotype and Zn activity in the nutrient solution.     

BRL饲细胞及血清浓度对体外小鼠精原干细胞的影响

分别以大鼠肝细胞(BRL)或小鼠胚胎成纤维细胞(STO)为饲养层．采用含5％、10％及20％胎牛血清的培养液，培养6日龄小鼠生精上皮细胞，研究饲养层和血清浓度对精原干细胞生物学行为的影响。结果表明：在培养的第1周内，2个及4个连成串的精原细胞合胞体数量明显增加，同时大多数精原细胞逐渐退化。培养1周后，大多数精原细胞经短暂的存活及分裂活动后退化消失，培养体系中仅保留下少量单个及由细胞间桥相连的双个及4个成串或成团的A型精原细胞。这些细胞在随后的培养过程中，不表现明显的分裂活动，呈圆球形，表达碱性磷酸酶。不同条件培养体系中的精原细胞及精原干细胞的生物学行为无明显不同，培养20～30d时均有少量精原干细胞存活。这说明BRL细胞能用作饲养层促进精原干细胞存活，但对其更新性增殖没有明显作用；培养液中高浓度胎牛血清对精原干细胞存活和增殖无明显影响，但能促进睾丸体细胞增殖。