山羊骨髓间充质干细胞生物学性能鉴定及诱导分化为心肌细胞的研究

研究了关中奶山羊骨髓间充质干细胞的分离、培养和生物学特性,并在体外诱导分化为心肌细胞表型。结果表明,山羊MSCs具有很好增殖能力;能够耐受反复冷冻和解冻;表达细胞表面标志CD44、CD105、CD166,弱表达CD34、CD106,而不表达CD14、CD45。该类细胞用5-氮胞苷诱导分化后,能够表达心肌α-actin,并呈PAS染色阳性。     

山羊骨髓间充质干细胞生物学性能鉴定 及诱导分化为心肌细胞

研究了关中奶山羊骨髓间充质干细胞的分离、培养和生物学特性，并在体外诱导分化为心肌细胞表型。结果表明，山羊MSCs具有很好增殖能力；能够耐受反复冷冻和解冻；表达细胞表面标志CD44、CD105、CD166，弱表达CD34、CD106，而不表达CD14、CD45。该类细胞用5-氮胞苷诱导分化后，能够表达心肌α-actin，并呈PAS染色阳性。     

鸡小肠上皮干细胞的分离培养

为建立鸡小肠上皮干细胞（Intestinal epithelial stem cells，IECs）体外培养体系并对其进行生物学特性研究，取18日龄鸡胚，分离小肠获得IECs，在DMEM/F12培养基中培养并观察其形态。通过传代及生长曲线的绘制分析其增殖情况，并经形态学观察及细胞免疫组织化学、RT-PCR等方法对所得到的纯化后的鸡小肠上皮干细胞进行鉴定。结果表明，鸡IECs可在体外扩增培养，目前传代至P11，纯化所得的鸡小肠上皮细胞经形态学观察及免疫荧光、RT-PCR法鉴定为阳性，由此可得出结论：鸡小肠组织中可以分离出IECs，且能够在体外增殖培养。     

鹿茸角软骨细胞体外培养方法的建立及生长特性分析

【研究目的】建立梅花鹿鹿茸软骨细胞体外分离培养和扩增方法，观察鹿茸软骨细胞在体外培养的生物学特性，为鹿茸再生机理的研究奠定基础；【方法】体外分离培养鹿茸软骨细胞，采用组织学、MTT比色法、免疫组化等多种手段动态检测细胞生长增殖情况；【结果】核心部分，约150字鹿茸软骨细胞贴壁生长，原代细胞比传代生长速度快，原代及传代4代内的鹿茸软骨细胞均有活跃的增殖能力，软骨细胞呈三角形，多边形等多种形态，II型胶原免疫组化，甲苯胺蓝染色为阳性；【结论】体外分离培养鹿茸软骨细胞具有较强的增殖能力，传代培养4代内细胞生长旺盛并维持其生物学特性, 可满足后续实验研究要求。     

以小鼠骨髓间充质干细胞为饲养层分离培养胚胎干细胞的研究

【研究目的】为了探求一种更简单有效地分离培养昆明小鼠胚胎干细胞的饲养层培养体系;【研究方法】将昆明小鼠3.5d的胚胎,接种于昆明小鼠骨髓间充质干细胞的饲养层培养体系,来分离培养昆明小鼠的胚胎干细胞。【结果】发现在骨髓间充质干细胞的饲养层培养体系上,获得了典型的ES细胞样集落,碱性磷酸酶染色呈阳性,且具有分化的潜能。【结论】小鼠骨髓间充质干细胞可以作为饲养层来分离培养ES细胞,并且能保持ES细胞的体外未分化状态。     

山羊表皮干细胞分离纯化的研究

表皮干细胞（epidermal stem cells,ESCs）干细胞特性的维持是干细胞内在属性和微环境共同作用的结果,体外长期培养ESC的关键是维稳定的微环境。实验将组织块脱出的细胞经分次消化和IV型胶原快速贴附分离出表皮干细胞,在含20%条件培养基的无血清培养液进行培养。原代细胞表现K19阳性,并且能形成PGC集落样细胞团。从表皮和真皮组织中均可得到上皮样细胞,经纯化后均表现出明显的表皮干细胞特性：呈片状生长,铺路石样形态。将两类细胞分别传至5代和8代,后代细胞β1整合素染色呈阳性。对5代和8代细胞分别进行克隆分析实验,其克隆形成率分别为18.5%和8.5%。实验证明组织块法能够得到较好的维持ESC的微环境,所分离的ESC具有干细胞特性并能稳定传代。     

大白猪仔猪皮肤成纤维细胞系建立及生物学特征

为获得可用于体细胞核移植中需要的供核细胞,本试验研究了大白猪仔猪(约克夏)皮肤成纤维细胞分离、培养、传代的方法,及其体外生长特征.应用本研究方法,所培养细胞在体外的生长增殖过程呈典型的"S"型.在冷冻、复苏试验中,组织块或细胞经冷冻保存复苏后活率较冻存前有所下降,但大多数细胞仍能正常生长.通过本方法,可以获得能在体外正常传代培养的细胞系,为动物克隆研究提供了供核细胞来源.     

家兔子宫内膜细胞炎症模型的建立

摘要：胶原酶消化法分离和培养家兔子宫内膜细胞,大肠杆菌细菌脂多糖（LPS）诱导子宫内膜细胞炎症,以培养细胞的形态学和传统炎症指标作为炎症发生和发展的判断标准。以不同浓度的LPS作用于细胞,收集不同时段培养上清液,ELISA法测定TNF-α、IL-1β的含量。结果表明,100ng/mL LPS是体外培养的子宫内膜细胞诱导炎症的最适浓度。炎症模型组培养上清液中TNF-α、IL-1β的含量比同期空白组高（P＜0.01）,表明炎症模型建立成功。     

梅花鹿鹿茸间充质层与前成软骨层细胞的培养及SB-431542对其增殖的影响

分离培养梅花鹿鹿茸间充质层细胞和前成软骨层细胞,通过研究TGF-β的特异性小分子拮抗剂SB-431542对这两种细胞增殖的影响,探讨TGF-β在鹿茸间充质层细胞和前成软骨层细胞增殖与分化中的调节机制。从生长30天的梅花鹿鹿茸中分离间充质层细胞和前成软骨层细胞,进行体外培养,将传代培养第2代的间充质层细胞和前成软骨层细胞分别在含不同浓度SB-431542（0、1、3、5、8、10 μmol/L）的培养液中培养,48小时后用MTT法测定这两种细胞增殖活性的变化,用SPSS软件对其增殖的差异性进行分析。结果显示,体外培养的鹿茸间充质层细胞呈成纤维细胞样,前成软骨层细胞呈纺锤形或梭形,台盼兰染色显示细胞活性均在90%以上。经SB-431542处理的间充质层细胞的增殖活性低于对照组(P＜0.05),而前成软骨层细胞增殖活性高于对照组(P＜0.05),且3μmol/L和5μmol/L的SB-431542处理的前成软骨层细胞增殖活性明显高于对照组(P＜0.01)。试验表明,TGF-β可能在维持鹿茸间充质层细胞的快速增殖和诱导间充质细胞向软骨细胞分化等过程中起重要的作用。     

猪血源树突状细胞诱导培养与鉴定

摘要：【目的】规范DCs诱导培养和鉴定的方法,为研究相关病毒致病机制、制定相应的治疗与预防措施奠定技术平台。【方法】分离猪外周血单个核细胞（PBMCs）,贴壁细胞经一定浓度GM-CSF和IL-4诱导,不同时间观察形态变化,7天后收集所诱导的细胞,经光镜、流式细胞术及激光共聚焦显微镜鉴定其形态、表面标志物CD1a/SWC3a;利用双色流式细胞术检测DC MHC-II分子和CD80/86表达情况。【结果】试验结果显示,所诱导的细胞具有典型树突状形态;其表面CD1a/SWC3a双阳性率达到90.1%,MHC-II/CD80/86分子双阳性率达98.3%;激光共聚焦显微镜观察细胞呈集落状,细胞表面CD1a/SWC3a双阳性,表明已经成功诱导出猪血源DC,并获得诱导的标准程序,为研究以DC为靶细胞的猪病毒性疾病免疫致病机理奠定基础。     

猪耳缘成纤维细胞的体外培养

为了建立猪耳缘成纤维细胞培养体系,为猪核移植实验做准备。主要采用组织块法进行猪耳缘成纤维细胞的培养、传代、冷冻和复苏,观察细胞的形态、生长和贴壁能力。结果显示：组织块培养法培养的细胞,生长较快,呈放射状,体外能正常传代。冷冻和复苏后,细胞能够正常的贴壁、增殖,经胰酶消化后,为核移植实验提供良好的细胞核供体。说明组织块培养方法是简单有效的获得猪耳缘成纤维细胞的方法,获得的细胞可以在体外至少传4代,能够为猪核移植胚胎提供供体细胞。     

精原干细胞的体外增殖与分化

最近,由于干细胞研究普遍取得的令人鼓舞的进展以及干细胞分离、培养、移植等新技术方法的出现和发展,出生后雄性个体的生殖系干细胞———精原干细胞(spermatogonialstemcell,SSC)已成为一个愈加引人瞩目的课题。SSC位于睾丸曲细精管基膜上,既具有自增殖(self-renewal)潜能和定向分化潜能,又是自然状态下出生后个体内在整个生命期间能够进行自增殖并能将基因传递至子代的惟一成体干细胞。了解干细胞增殖与分化的调节机制,获得足够数量的种子细胞一直是所有干细胞研究共同面临的迫切问题之一。近年来,借助于SSCs移植技术这一功能性检测方法,国内外学者就SSCs体外培养的条件进行了深入探讨,取得了可喜进展。结合自己的前期工作,参考相关最新进展,就影响哺乳类SSCs体外存活、增殖、分化的因素及未来需要解决的问题进行了评述。     

精原干细胞的体外增殖与分化

最近,由于干细胞研究普遍取得的令人鼓舞的进展以及干细胞分离、培养、移植等新技术方法的出现和发展,出生后雄性个体的生殖系干细胞——精原干细胞(spermatogonial stem cell, SSC)已成为一个愈加引人瞩目的课题。SSC位于睾丸曲细精管基膜上,既具有自增殖(self-renewal)潜能和定向分化潜能,又是自然状态下出生后个体内在整个生命期间能够进行自增殖并能将基因传递至子代的惟一成体干细胞。了解干细胞增殖与分化的调节机制,获得足够数量的种子细胞一直是所有干细胞研究共同面临的迫切问题之一。近年来,借助于SSCs移植技术这一功能性检测方法,国内外学者就SSCs体外培养的条件进行了深入探讨,取得了可喜进展。结合自己的前期工作,参考相关最新进展,就影响哺乳类SSCs体外存活、增殖、分化的因素及未来需要解决的问题进行了评述。     

牛胎儿成纤维细胞的分离培养及转染线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因

为了为核移植法制作转线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因克隆牛提供供体细胞,体外分离培养牛胎儿成纤维细胞并进行了线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因转染。首先采用组织块贴壁法分离培养牛胎儿成纤维细胞,线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因表达载体以脂质法介导转染牛胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR 鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,对阳性克隆进行传代2-3次后利用RT-PCR检测外源基因的转录。结果表明,组织块贴壁后7天可获取原代成纤维细胞,基因转染后利用G418筛选9天即可获得转基因细胞,对转基因细胞进行传代,PCR 检测显示CMV启动子和ω-3脂肪酸去饱和酶基因整合到细胞基因组中,RT-PCR检测显示ω-3脂肪酸去饱和酶基因在转基因传代细胞中得到有效转录。本研究为下一步通过核移植方法获得转基因肉牛提供了条件。     

牛滋养层干细胞样细胞系的建立

为了成功建立牛滋养层干细胞样细胞系,探讨牛滋养层干细胞样细胞（Bovine Trophoblastic Stem-like Cells）体外培养条件及相关影响因素,以胎牛子宫成纤维细胞条件培养液作为培养基,胶原铺被培养皿,利用体外受精牛囊胚培养得到牛滋养层干细胞样细胞,并调整培养体系,以探讨其最适生长条件。结果表明：利用添加FBS、β-巯基乙醇、肝素以及胎牛子宫成纤维细胞条件培养液的DMEM/F12,体外培养牛囊胚,可以初步建立牛滋养层干细胞样细胞系。     

鸡传染性法氏囊病病毒的分离鉴定与培养特性研究

为研究鸡传染性法氏囊病病毒在不同宿主上的培养特性,从河南省某疑似感染鸡传染性法氏囊病病毒的鸡场采集病料,通过琼脂免疫扩散试验初步筛选出IBDV毒株,并将毒株回归易感鸡,在SPF鸡胚及DF1细胞上培养。结果显示：培养出的病毒作为抗原与标准阳性血清之间均出现阳性沉淀线;回归SPF鸡试验显示发病率达100%,死亡达60%,病死鸡只出现法氏囊肿大、出血甚至出现紫葡萄样;该毒株能引起鸡胚CAM增厚、胚体出血,引起DF1细胞变圆脱落;ELD50与TCID50分别为10-4.6/0.1 mL、10-5.5/0.1 mL。试验证实IBDV分离株,属于超强毒株,该毒株可以在鸡胚和DF1细胞上适应增殖,将其命名为HN12号分离株。     

棉胚珠来源单细胞的培养及部分特性初探

棉胚珠来源的单细胞进行悬浮培养，并对其部分特性进行研究，发现大部分细胞可显著伸长并可分化为纤维细胞，且提高ＧＡ３浓度及适当的ｐＨ（ｐＨ５．０）可促进细胞的伸长和分化。而１００μＭ的香豆素便可显著抑制细菌的伸长和分化。     

奶牛和绵羊子宫内膜细胞体外培养方法的研究

为了探讨适用于奶牛和绵羊子宫内膜细胞的培养方法,采用了组织培养法、常温消化法、先组培后消化法和先消化后组培法,并适时用倒置显微镜观察,探讨哪一种原代培养方法更适合获得奶牛和绵羊子宫内膜细胞。结果表明,组织培养的奶牛和绵羊子宫内膜细胞生长较快,细胞形态为梭形和铺路石样交织在一起;常温消化法没有成功获得奶牛子宫内膜细胞,但获得了绵羊子宫内膜细胞;而先组培后消化法获得了奶牛子宫内膜细胞,但无法传代、不能长久生长;而先消化后组培法获得的细胞与单一组培法获得的奶牛和绵羊子宫内膜细胞情况相似,细胞上出现很多组织残块,覆盖在细胞上面不利于细胞增殖。说明组织培养方法是简捷快速获得牛、绵羊子宫内膜细胞的方法,获得的子宫内膜细胞可以在体外至少传4代,这类细胞可以用于研究动物子宫内膜的功能和相关分子调控机制。     

提高红掌叶片愈伤组织诱导和植株分化及壮苗率的技术研究

研究了不同培养基、糖类、培养条件及活性炭对红掌幼嫩叶片愈伤组织诱导和植株分化及壮苗率的影响。结果表明：在改良MS+6-BA1.0mg/l+2,4-D0.1mg/l,添加葡萄糖30g/l和暗培养,可获得较高的愈伤组织诱导率;在继代培养中添加活性炭1.0g/l,有利于提高幼芽分化和壮苗率。各个品种间的愈伤组织诱导率与植株分化率有一定差别。红掌组培苗无需另行作生根培养即可获得较为健壮的小苗,移栽成活率可达95%以上。     

西门塔尔牛耳皮肤成纤维细胞的体外培养

供体动物细胞体外培养模式的建立是动物克隆研究与生产的必要条件。本试验先利用组织块培养再利用胰酶消化纯化的方法培养西门塔尔牛耳皮肤成纤维细胞,进而为牛体细胞核移植做准备。结果表明,先组织块培养后再消化纯化的方法获得的牛耳皮肤成纤维细胞形态良好,传代后的细胞成活率较高,贴壁良好,且牛耳皮肤细胞的增殖情况符合体外培养细胞正常生长增殖的一般规律。因此,利用组织块培养后再消化纯化是一种获得牛耳皮肤成纤维细胞简单而有效的方法,能够作为牛体细胞核移植技术中供体细胞制备方法。