OsRUS1酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用检测

采用PCR技术扩增水稻（Oryza sativa L）根UV-B敏感基因1（ROOT UV-B SENSITIVE 1,RUS1）四个不同片段[OsRUS1（1-1782）、OsRUS1（1-504）、OsRUS1（510-1282）、OsRUS1（1188-1782）],连接到T载体pMD18-T-Simple上,测序无误后分别亚克隆到诱饵载体pGBKT7上,酶切和测序结果表明构建的4个OsRUS1基因片段的诱饵载体构建成功,读码框正确;转化重组载体于酵母感受态细胞Y187中,用LacZ、MEL1活性检测法和营养缺陷型培养基SD-Trp-DO培养法进行自激活检测和毒性检测,结果表明诱饵载体对酵母菌株Y187没有转录激活活性和毒害作用。说明构建的4个OsRUS1基因片段的诱饵载体可以用于酵母双杂交系统中,为下一步从水稻cDNA文库中筛选互作蛋白奠定了基础。     

水稻瘤矮病毒S9基因的生物信息学分析及原核表达蛋白的抗血清制备

以广东德庆市水稻瘤矮病的典型病株为材料,RT-PCR扩增并克隆了水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)的第9组分全长核苷酸序列。生物信息学分析表明,其基因结构特征与已报道的其他分离物基本一致。Pns9蛋白为细胞膜外蛋白,在植物呼肠孤病毒属内没有发现同源蛋白,与霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的入口蛋白(portal protein)及姜氏军团菌(Legionella drancourtii LLAP12)的假设蛋白(hypothetical protein LDG_3259)分别有33%和24%的氨基酸序列相似性,功能尚待确定。将S9基因克隆至原核表达载体pET-28b(+)得到高效表达,融合蛋白经亲和层析纯化后,免疫新西兰大白兔制备抗血清。Western blot和ELISA分析表明制备的兔抗为特异抗血清,效价为1∶13 1072。     

PRSV NIa-pro、NIa-vpg、NIb酵母双杂交诱饵表达载体的构建及自激活检测

用PCR技术获得NIa-pro、NIa-vpg、NIb基因片段,将这些基因分别克隆到pBD-GAL4载体中,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pBD-GAL4-NIa-pro、pBD-GAL4-NIa-vpg和pBD-GAL4-NIb.测序正确后,将重组质粒导入YRG-2酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用.结果表明,获得了正确的NIa-pro、NIa-vpg、NIb基因片段,并成功克隆到pBD-GAL4诱饵载体中,且转化有诱饵载体的YRG-2在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,说明表达产物对酵母细胞无毒性,对报告基因也无自激活作用,为下一步利用酵母双杂交系统检测与NIa-pro、NIa-vpg、NIb蛋白相互作用的蛋白奠定基础.     

酵母双杂交系统筛选与水稻黑条矮缩病毒P6互作的水稻蛋白

RBSDV编码的非结构蛋白P6为该病毒的沉默抑制子。为了研究P6与寄主水稻间的互作关系,首先利用RT-PCR扩增,获得水稻黑条矮缩病毒P6基因,并将其构建到酵母表达载体pGBKT7上,自激活验证表明,P6蛋白无自激活活性。利用酵母双杂交系统顺序转化法从水稻cDNA文库中筛选,获得4个与RBSDVP6互作的寄主因子,分别为水稻内囊体抗坏血酸过氧化物酶、醛糖1差向异构酶、immutans蛋白基因同源蛋白和一个功能未知蛋白。分析了3个已知功能的寄主因子在病毒侵染过程中的可能功能。     

PRSV NIa-pro、NIa-vpg、NIb酵母双杂交诱饵表达载体的构建及白激活检测

用PCR技术获得NIa-pro、NIa-vpg、NIb基因片段，将这些基因分别克隆到pBD-GAL4载体中，构建酵母双杂交系统的诱饵载体pBD-GAL4-NIa-pro、pBD-GAL4-NIa-vpg和pBD-GAL4-NIb。测序正确后，将重组质粒导入YRG-2酵母菌株，检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用。结果表明，获得了正确的NIa-pro、NIa-vpg、NIb基因片段，并成功克隆到pBD-GAL4诱饵载体中，且转化有诱饵载体的YRG-2在SD／Trp营养缺陷甲板上生长良好，说明表达产物对酵母细胞无毒性，对报告基因也无自激活作用，为下一步利用酵母双杂交系统检测与NIa-pro、NIa-vpg、NIb蛋白相互作用的蛋白奠定基础。     

香蕉ROP1基因酵母双杂交体系的诱饵载体构建及毒性与自激活效应检测

用PCR技术获得香蕉ROP1基因片段,构建酵母双杂交系统表达载体pGBKT7-ROP1,测序正确后将重组质粒导入AH109酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用.结果表明,用PCR技术获得了正确的ROP1基因片段,并正确构建了ROP1基因的酵母双杂交表达载体,并转化到AH109酵母菌株中,含诱饵载体的AH109在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,说明表达产物对酵母细胞无毒性,含诱饵载体的AH109在His、Trp二重营养缺陷平板上不能生长,说明对报告基因无自激活作用,为下一步利用酵母双杂交系统筛选与ROP1蛋白相互作用的蛋白奠定基础.     

橡胶树14-3-3蛋白基因的酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活和毒性检测

以克隆到的3个编码橡胶树14-3-3蛋白的基因HbGF14a、HbGF14b、HbGF14c和为基础,构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-HbGF14a、pGBKT7-HbGF14b、pGBKT7-HbGF14c,并对其进行自激活和毒性实验鉴定.自激活实验结果表明,3个诱饵载体没有自激活性;毒性实验结果表明,pGBKT...     

水稻矮缩病毒Pns6和P8蛋白在病毒侵染水稻原生质体后的表达

【目的】为明确水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus, RDV) Pns6和P8蛋白在病毒侵染水稻原生质体后的表达动态,【方法】利用PEG介导的病毒侵染原生质体体系,通过免疫荧光和电镜技术分析Pns6、P8蛋白以及病毒粒体在水稻原生质体中的定位;同时,通过Western blot和实时荧光定量PCR分析Pns6和P8蛋白及其RNA在水稻原生质体中的积累量。【结果】病毒接种水稻原生质体48 h后,Pns6蛋白在细胞质中可以形成类似于病毒原质(viroplasm)的点状内含体,P8蛋白也大量的表达。同时,病毒粒体在水稻原生质体中也形成内含体状的结构。病毒接种水稻原生质体12 h后,均可检测到Pns6和P8蛋白的表达,并且在36 h后达到最高值。病毒接种水稻原生质体后,Pns6 RNA在24 h时表达量达到最高,P8 RNA在36 h时表达量达到最高。【结论】RDV侵染水稻原生质体后,Pns6和P8蛋白均有表达,并且病毒也可能通过形成病毒原质来完成病毒在寄主细胞的复制和装配。     

水稻黑条矮缩病毒P7-1基因对水稻的遗传转化及转基因植株的抗病性分析

【目的】通过在水稻中过量表达水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus, RBSDV) P7-1基因,分析RBSDV P7-1是否是导致水稻不育的重要致病因子,并明确过量表达P7-1转基因植株对病毒的抗性。【方法】采用RT-PCR方法从感病植物中扩增获得RBSDV P7-1基因,构建pCAMBIA-1300-P7-1载体,通过农杆菌转化法获得转基因水稻,观察水稻是否能够正常结实,并采用人工接种病毒方法分析转基因植株的抗性。【结果】过量表达RBSDV P7-1的转基因水稻生长、结实正常。在接种7 d和14 d时转基因植株中病毒积累量显著低于野生型对照,但在28 d时部分转基因株系中病毒积累量高于对照,接种30 d时转基因植株的发病率与对照无明显差异。【结论】在水稻中过量表达RBSDV P7-1不影响水稻的结实;转基因水稻在RBSDV侵染早期可抑制病毒的积累,但在后期对病毒的抗性与对照没有明显差异。     

酵母双杂交表达载体pGBKT7_NPR1与pGADT7_NPR1的构建及酵母菌的转化

NPR1是水杨酸介导的系统获得性抗性（SAR）途径中不可或缺的一个转录辅助因子。在SA诱导下,NPR1被转运至细胞核内并与一些转录因子结合,以启动下游基因的表达。本研究通过PCR扩增获得拟南芥中NPR1基因CDS序列,经过限制性内切酶酶切后在T4连接酶作用下分别克隆至pGBKT7与pGADT7酵母表达载体上,并成功将其转化至Gold酵母菌株中。为利用酵母双杂交筛选NPR1参与形成的转录复合体中其它可能存在的蛋白质并阐明其在植物防御信号传导途径中的互作模式奠定了基础。     

水稻瘤矮病病毒和矮缩病病毒的核苷酸结合蛋白和核酸结合蛋白及其结合能力分析

采用α-32P标记的三磷酸核苷酸与病毒粒子共浴的方法及Northwestern分子杂交方法,研究证明了RGDV结构蛋白中,P1蛋白可能是依赖于RNA的RNA聚合酶, P5蛋白可能具有RNA鸟苷酰转移酶功能,P6蛋白可能是核酸结合蛋白,是RGDV复制包装中的关键蛋白。与RGDV结构蛋白具有相同生物功能的RDV的核酸结合蛋白与核酸的结合能力最强,依赖于RNA的RNA聚合酶与核酸的结合能力次之,RNA鸟苷酰转移酶与核酸的结合能力最弱。结果暗示了可以根据与核酸的结合能力,辅助判断RDV或RGDV这3个结构蛋白的生物功能。     

高粱花叶病毒Hcpro、CP和PIPO基因酵母双杂交载体构建及自激活验证

采用同源克隆技术获得侵染甘蔗高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)的Hcpro、CP、PIPO基因片段.将该基因片段连接至pGBKT7载体,分别构建酵母双杂交诱饵载体pGBKTT-Hcpro、pGBKT7-CP和pGBKTT-PIPO,经PCR、酶切及测序鉴定,证明重组诱饵载体构建成功后,将重组质粒导入Y2H Gold酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用.结果表明,含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性.含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Leu、SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His营养缺陷平板上不能生长,表明重组诱饵质粒表达产物对ADE2、HIS3报告基因无自激活作用.研究结果为下一步利用酵母双杂交系统检测与高粱花叶病毒Hcpro、CP、PIPO蛋白相互作用的甘蔗蛋白提供基础.     

水稻黑条矮缩病毒基因组片段S10的cDNA克隆及全序列分析

基于RT-PCR策略克隆了水稻黑条矮缩病毒（rice black streaked dwarf virus,RBSDV）浙江分离株基因组S10,并测定了它的全序列。结果表明,水稻黑条矮缩病毒浙江分离物（RBSDV-Zj）基因组片段S10全长1801 nt（EMBL登录号为AJ297433）,仅含有一个大的开放阅读框（open reading frame,ORF）,编码一个63.1 kD的多肽,与日本的水稻黑条矮缩病毒基因组片段S10在核苷酸和氨基酸水平上同源性分别为93.8%和96.2%;与意大利玉米粗缩病毒（maize rough dwarf virus,MRDV）的基因组片段S10在核苷酸和氨基酸水平上的同源性分别为87.7%和92.0%,推测它们是同一病毒的不同地理小种。     

水稻黑条矮缩病病毒外壳蛋白基因S10的原核表达、多克隆抗体制备及应用

用RT-PCR方法从感染水稻黑条矮缩病毒(rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)水稻中克隆该病毒的外壳蛋白基因S10,然后将此外壳蛋白基因再亚克隆到原核表达载体PET-32a中构建成重组原核表达载体pET32a-CP。将重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,Ni+ NTA亲和柱纯化获得分子量约为76kD含硫氧还蛋白的融合蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫兔子制备RBSDV外壳蛋白的多克隆抗体,并用制备的多克隆抗体建立了可靠、灵敏、特异的检测RBSDV的免疫捕获RT-PCR及Dot-blot ELISA方法,为该水稻病毒病的诊断提供技术支持。