酵母菌6-磷酸海藻糖合成酶基因在大肠杆菌中的表达及功能验证

海藻糖是由两个葡萄糖残基经α，α-1，1糖苷键连接而成的非还原性二糖，大量实验表明，海藻糖不仅作为碳水化合物以储存能量，具有在冷冻、干燥、高渗透压等严酷环境中保护生物膜和蛋白质结构的功能，还可保护DNA免受放射引起的损伤（Yoshinaga et al．，1997）。海藻糖的这一独持性质可望用于干燥冷冻食品、药品和酶的稳定剂以及化妆品的保护剂等。     

Prd29A启动子在小麦中的诱导表达活性及大肠杆菌海藻糖合成酶基因的转化

以gus基因为报告基因，通过瞬时表达测定了Prd29A诱导型启动子在小麦愈伤组织中的诱导表达活性。结果表明，Prd29A-gus基因的表达水平可在不同浓度NaCl盐的胁迫条件下得到显著提高。由此证实，Prd29A启动子在小麦中具有较强的诱导表达活性。在此基础上，将Prd29A诱导型启动子驱动下的大肠杆菌海藻糖合成酶基因（otsA）采用花粉管途径导入目的小麦品系，经PCR筛选、Southern鉴定及转化后代海藻糖含量的测定，获得了一批otsA转基因植株及株系，为进一步选育耐盐抗旱的转基因小麦新品系奠定了基础．     

乙烯合成酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

通过PCR的方法从丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)ICMP2189中克隆到了乙烯形成酶基因efe,并且在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中利用T7强启动子进行了高效表达,表达蛋白占总蛋白的45%。气相色谱分析表明,含有efe基因的大肠杆菌可以高效地产生乙烯。     

海藻糖合成酶基因导入小麦研究初报

海藻糖主要存在于一些低等生物体内,它对许多处于逆境的低等生物维持生命、抵抗不良环境胁迫起着重要作用.高等生物虽然具有许多复杂的抗逆机制,但尚无象海藻糖那样具有多种功能且高效的抗逆产物.据此,人们开始尝试利用海藻糖来提高高等植物的抗逆能力.Oscar等将大肠杆菌中的ostA,ostB基因转入烟草及马铃薯,获得了良好的抗逆效果[1].陈红漫等在国内首次将酵母中海藻糖合成酶基因克隆并转入烟草,发现海藻糖对叶片中细胞器的膜结构具有较好的保护作用[2].可见,海藻糖在双子叶植物中具有较好的抗逆效果,但其在禾谷类作物中的作用还有待于进一步的研究.本试验旨在将海藻糖合成酶基因转入普通小麦,研究其在小麦中的作用,以期提高小麦的抗逆性.     

啤酒糖酵母菌6-磷酸海藻糖合成酶编码基因tps1的cDNA克隆

本工作从抗逆性极强的啤酒糖酵母菌株 Ａ Ｓ２１４１６ 中分离纯化总 Ｒ Ｎ Ａ 和 ｍ Ｒ Ｎ Ａ ,以 Ａ Ｍ Ｖ 逆转录酶合成了单链ｃ Ｄ Ｎ Ａ 。采用保守引物扩增并克隆了该酵母菌的６ － 磷酸海藻糖合成酶编码基因ｔｐｓ１ ,建立了该基因 Ｄ Ｎ Ａ 片段的物理图谱,发现其酶切位点与已见报道的６ － 磷酸海藻糖合成酶编码基因相同。     

茶树海藻糖-6-磷酸合成酶基因(CsTPS)的克隆及表达分析

海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)是海藻糖合成途径中的一个关键酶.目前,TPS基因的研究多数集中于细菌和真菌等,而对植物的研究较少.本实验通过对茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)全器官转录组文库序列比对,获得一条与其他物种同源性较高的编码TPS基因的EST序列,通过RACE扩增后获得茶树TPS基因cDNA全长序列,命名为Cs TPS(GenBank登录号JQ742017).该基因cDNA全长3 125 bp,包含一个2799 bp的开放阅读框,编码932个氨基酸.多序列比对分析结果表明,Cs TPS基因编码的蛋白具有明显的TPS和TPP两个结构域.系统进化分析表明,其编码的氨基酸序列与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)和番茄(Solanum lycopersicum)等植物的TPS同源性较高,且CsTPS与拟南芥TPS1(AtTPS1)的同源性高于TPS2(AtTPS2)和TPS3(AtTPS3).qPCR分析显示,CsTPS基因在茶树不同组织器官中呈现差异性表达.低温诱导促使老叶和嫩叶中的CsTPS基因上调程度明显大于根系,表明CsTPS基因可能参与了茶树抗寒机制.     

抗真菌鲎素基因在大肠杆菌中的表达

人工设计并合成了抗真菌多肽鲎素基因,将合成的鲎素基因首先克隆到了ｐＵＣ１８载体上,利用通用引物测序,获得了与预期碱基序列完全一致的目的基因。再将鲎素基因克隆到原核表达载体ｐＧＥＸ－５Ｘ－１上,诱导表达融合蛋白。经ＩＰＴＧ诱导,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ进行检测,在２９ｋＤ处出现了ＧＳＴ－鲎素融合蛋白条带,与预期分子量大小相     

宇佐美曲霉木聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达

在已知宇佐美曲霉E001菌株木聚糖酶Xyn II cDNA序列（Genbank登录号为DQ114485）的基础上，合成1对引物（含 EcoR I和Sal I酶切位点），以重组质粒pUCm-T-xyn II为模板，扩增得到编码Xyn II成熟肽的cDNA片段（555 bp）。将其与表达质粒pET-28a连接，构建了重组表达质粒pET-28a-xyn II，转化E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL，获得重组工程菌B21/xyn II。经IPTG诱导表达，木聚糖酶的比酶活力最高可达35.6 U/mg。最后采用金属Ni2+螯和层析柱对所表达的木聚糖酶进行纯化，达到了电泳纯。重组表达的木聚糖酶最适温度为45℃，最适pH值为4.6。     

大肠杆菌海藻糖磷酸合酶基因的克隆

根据报道的大肠杆菌（Escherichia coli)海藻糖－6－磷酸合酶基因（otsA)，设计引物，通过PCR技术从大肠杆菌XLI菌株的总DNA中扩增到一个1．4kb片段。经克隆、测序分析，该片段长1425bp并含一完整的开放读框（ORF）。在核苷酸水平上，该ORF与已报道的otsA基因具有99．86％的同源性。在氨基酸水平上，其推断性的编码产物蛋白与OtsA具有100％一致性。     

以玉米幼胚为受体转化海藻糖合成酶基因

本文将含酿酒酵母海藻糖合成酶基因（TPS1）的重组质粒pC1300WTPS,用农杆菌EHA105介导转化玉米幼胚,不经诱导愈伤组织而筛选分化直接成苗。通过对幼胚大小和半胱氨酸(Cys)浓度筛选,发现长度在1.5～2.0mm的幼胚更适合农杆菌介导的幼胚转化,并且在农杆菌与幼胚的共培养阶段添加200mg/L的半胱氨酸,能够有效降低幼胚在农杆菌浸染过程中的褐化率（29.3%）,比对照褐化率（53.7%）减少约一倍。经PCR检测216株转化植株,得到1株阳性植株。     

人肥胖基因在大肠杆菌中的表达及生物学活性检测

肥胖基因(ob)编码的瘦蛋白可以反映机体脂肪含量信息,在发育、繁殖、造血及体重调节等方面具有重要功能。利用PCR方法扩增去除信号肽的人肥胖基因cDNA序列,并将位于基因5!端的CCC转变为大肠杆菌(Escherichiacoli)常用密码子CCG,扩增片段经测序证实后,克隆到原核表达载体pET5a,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.1mmol/LIPTG诱导,获得分子量约为16kD的特异蛋白表达带,表达量最高占菌体蛋白总含量的55%。重组蛋白纯化后,注射昆明白小白鼠,小白鼠体重明显下降,说明纯化的重组蛋白具有生物学活性。     

鸡MxA全基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

MxA是由Ⅰ型干扰素诱导宿主细胞所产生的抗病毒蛋白家族的成员之一。本文以Poly:IC和干扰素联合诱导鸡成纤维细胞，使MxA基因活化并转录mRNA，然后从细胞中提取总RNA，并进行RT-PCR，扩增MxA基因，序列分析后克隆到pGEX原核表达载体中，在大肠杆菌中进行诱导表达。表达产物经复性、纯化回收后，得到浓度为10mg/ml较纯的MxA重组蛋白。经体内、体外活性检测实验表明，此表达产物具有阻断新城疫病毒感染的功能,具有很好的研发前景。     

亚洲棉油菜素内酯合成酶基因(GaCPD2)的克隆、表达分析及功能验证

持续光形态建成与矮化基因(constitutive photomorphogenesis and dwarf,CPD)是油菜素内酯(brassinosteroids,BRs)合成中的关键限速酶,为研究棉花中CPD基因表达模式和验证其功能,采用RTPCR方法首次从亚洲棉(Gossypium arboreum L.)石系亚1号中克隆到了一个细胞色素P450单加氧化酶基因GaCPD2(GenBank登录号:KJ183066)。生物信息学分析表明,该基因CDS序列长度1 413 bp,编码470个氨基酸,理论相对分子质量53.98 kD,理论等电点9.40,主要由α-螺旋、β-折叠、延伸链和无规则卷曲组成。多序列比对结果表明,GaCPD2具有细胞色素P450保守结构域,氨基酸序列与其他已报道物种中同源基因的相似性最高为84.0%。荧光定量PCR结果表明,GaCPD2在根、茎、叶、花和纤维组织中均有表达,开花后第10天的纤维中表达量最高,是0DPA的10倍左右。克隆了GaCPD2基因启动子序列,生物信息分析表明,GaCPD2基因启动子包含大量与光响应有关的顺式作用元件以及部分胁迫应答元件,推测其可能受光调控,参与胁迫应答。构建过表达载体转化拟南芥油菜素内酯合成突变体cpd91(Columbia背景),发现转基因株系的叶片展平,株高及育性恢复至野生型,表明GaCPD2基因在BR合成中起着重要作用,为研究油菜素内酯对棉花生长发育的影响提供了基础资料,有助于揭示BR调控植物株型及产量性状的分子机理。     

野油菜黄单胞菌中6-磷酸海藻糖合成酶注释基因的功能鉴定

6-磷酸海藻糖在微生物碳代谢调节及抗逆生理中起着极其重要的作用。在野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)8004菌株的基因组中,XC1076注释为6-磷酸海藻糖合成酶。利用突变和表型检测技术,对XC1076进行功能鉴定,结果显示,XC1076的Tn5gusA5插入突变体006B12,在含3%NaCl的NYGB培养基中生长明显缓慢,在含葡萄糖为惟一碳源的NCM培养基中几乎不能生长,反式互补能够基本恢复野生型表型,这说明XC1076与碳代谢调控和抗高渗有关。这些表型实验结果揭示,XC1076的ORF编码的蛋白具有6-磷酸海藻糖合成酶活性。致病生化因子检测显示,XC1076与Xcc胞外酶和胞外多糖的分泌无关。     

pfl-act基因在大肠杆菌中的高效表达及其纯化

丙酮酸甲酸裂解酶是肠道细菌在厌氧代谢中十分关键的酶,丙酮酸甲酸裂解酶激活因子(pyruvateform ate lyase activator,PFL-A)在功能上具有重要的作用。为进一步研究PFL-A的激活机理,以大肠杆菌K-12的基因组为模板,通过G enB ank上公布的序列设计引物,扩增出目的基因,克隆到pM D 18-T载体,经测序,所扩增出的基因与p f l-act基因具有99%的同源性。将p f l-act连接到高效表达载体pET-22b( )中,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,结果发现,p f l-act以包涵体形式表达。改变诱导剂、诱导剂量或培养温度,对包涵体的形成均没有明显的影响。     

睾丸酮丛毛单胞菌teiR基因载体构建及在大肠杆菌中的表达

提取睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)基因组DNA,利用PCR扩增teiR基因,将扩增产物克隆到pKtac2(含强启动子tac)和pK18中,构建重组质粒pKtac2-teiR和pKteiR100。将重组质粒分别转化大肠杆菌(Escherichia coli)HB101, 提取细菌总蛋白,ELISA测定细菌总蛋白中teiR基因的表达量,结果表明: 含tac强启动子的pKtac2-teiR重组质粒具有更高的转录活性;将p6(含3a-HSD/CR基因)分别和重组质粒(pKtac2-teiR和pKteiR100)共转化大肠杆菌(Escherichia coli)HB101, 测定细菌总蛋白中3a-HSD/CR 和teiR基因的表达量,结果表明: 在大肠杆菌中teiR可以明显促进3a-HSD/CR 的表达, pKtac2-teiR与p6共转化后teiR基因的表达量比pKteiR100与p6共转化后teiR基因的表达量高,但是pKtac2-teiR与p6共转化后的3a-HSD/CR的表达量低于pKteiR100与p6共转化后的3a-HSD/CR的表达量。     

小反刍兽疫病毒N基因在大肠杆菌中的表达及鉴定

参照GenBank中小反刍兽疫病毒((Peste des petits ruminants virus,PPRV)N基因序列（Nigeria/75/1）(1 578 bp)设计了1对添加EcoRⅠ和Not Ⅰ酶切位点的引物,对从奥地利引进的pCI-neo-PPRN质粒进行PCR扩增,克隆至pGM-T载体,并转化大肠杆菌Escherichia. coli TOP10感受态细胞,获得重组质粒pGM-T-PPRN。将重组质粒经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切的产物插入原核表达载体pET-32a（+）,构建原核表达质粒pET-PPRN,将其转化进BL21(DE3)感受态细胞中后用IPTG诱导表达, 收集菌液进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析,结果表明小反刍兽疫病毒N基因在BL21(DE3) 成功表达。所表达融合蛋白的相对分子质量约为80 kD,并能被组氨酸单抗、PPRV标准阳性羊血清及PPRV疫苗免疫羊血清所识别。     

丹参海藻糖-6-磷酸合成酶基因（SmTPS）的克隆及其表达分析

对丹参EST序列进行Blast分析,得到一条海藻糖-6-磷酸合成酶（TPS）基因,将其命名为SmTPS,GenBank注册号为JF937196。该基因cDNA全长2836 bp,包含一个长为2574 bp的ORF,编码857个氨基酸。生物信息学分析表明,分子量为97.04 kD,等电点为5.76,含α-螺旋、β转角、延伸连和无规则卷曲。该蛋白同时具有海藻糖-6-磷酸合成酶（TPS）和海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶（TPP）的功能结构域。系统进化树分析表明丹参TPS功能域和拟南芥AtTPS6属于一类,而TPP功能域与低等生物酵母ScTPS2属于一类。实时定量PCR结果分析表明,SmTPS基因在丹参不同组织器官中差异表达,其茎中表达量最高。在干旱和低温处理下,其表达量与对照相比均可上调约2倍,表明SmTPS基因在丹参抵抗干旱和低温胁迫中发挥一定的作用。     

牛nanog基因原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达

从6周龄的胎牛（Bos taurus）原始生殖嵴中提取总RNA,通过RT-PCR扩增nanog基因,将其克隆到PMD-18T载体,然后再亚克隆到pGEX-KG表达载体上,获得原核表达质粒pGEX-KG-nanog,限制性内切酶分析和DNA测序证明所插入片段为牛nanDg基因编码序列。重组质粒转化大肠杆菌JM109（Escherichia coli）,在不同的培养温度（25、30和37℃）和不同浓度的IPTG（0．10、0．25、0．50、1．00和2．00mmol／L）诱导下均获得了表达,结果表明,培养温度和IPTG浓度对GST-Nanog融合蛋白在大肠杆菌中的表达影响甚微;经Western blot检测证实该蛋白约60kD,并具有GST抗原活性,证实目的蛋白为Nanog蛋白。     

鸡MxA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

MxA是由Ⅰ型干扰素诱导宿主细胞所产生的抗病毒蛋白家族的成员之一。采用RT-PCR方法从鸡胚成纤维细胞(CEF)中扩增MxA,将其克隆至载体pMD-T18中,筛选阳性克隆后回收目的片段,将其克隆入原核表达质粒pGEX-6p-1,构建其重组表达质粒pGEX-MxA,以IPTG诱导表达,经SDS-PAGE、鸡胚新城疫病毒增殖干扰实验和VSV-CEF微量细胞抑制实验进行分析、鉴定。结果表明,经RT-PCR扩增获得的MxA序列与GenBank报道的序列一致,SDS-PAGE和干扰实验证实重组质粒可以表达出相应分子量为45kD的蛋白,与GST-MxA融合蛋白分子量一致,影像分析系统分析显示表达的融合蛋白约占菌体蛋白的30%。