鸭禽流感免疫抗体血凝检测及其应用

鸭是禽流感传播链中的一个重要环节,能否有效防控鸭禽流感的关键之一是使用科学的检测方法.目前,是参照禽流感血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验标准(GB/T18936-2003)[1],但是,鸭体内含有非特异性抑制因子,血清中的唾液酸残基会模拟红细胞受体,同红细胞受体竞争与流感病毒血凝素的结合,因而会导致非特异性抑制结果(假阳性)的出现,用鸡红细胞悬液检测水禽禽流感血清抗体时,常常存在非特异性凝集现象,出现前带和后带现象,有时能严重影响结果的判定.为此,本文采用不同种家禽的红细胞悬液做重复试验,探讨水禽血清的处理方法及不同种的家禽红细胞悬液对水禽禽流感血清抗体检测的影响, 在临床应用中,可为鸭禽流感免疫技术提供参考依据.     

血凝、血凝抑制实验在生产中的应用详解

1血凝实验(HA)、血凝抑制实验(HI)简介一些禽病病毒如新城疫病毒、流感病毒、传染性支气管炎病毒(经浓缩和酶处理后)、腺病毒127株及几种支原体具有凝集红细胞的活性(血凝素-神经酸酶HN蛋白与红细胞表面受体结合)。这种红细胞凝集现象可被特异性免疫血清所抑制,即血凝抑制实验(HI)。用该实验可检测鸡体注苗后抗体应答水平及证实是否曾受感染。HI实验的基本成分是血凝(HA)抗原,系列稀释的血清和红细胞悬液(0·5%~1·0%)。实验可在小试管或微量板(96孔V型板)中进行。生产中一般多用固定抗原稀释血清法(β-法),而很少用固定血清稀释抗原…     

4株猪流行性腹泻病毒的HA和HI试验

为观察猪流行性腹泻病毒(PDEV)的血凝特性,进而为建立PEDVHA和HI试验,评估疫苗免疫抗体水平奠定基础,将CV777、DR13、YN13和YN144共4株PEDV毒株,在37℃下,分别用0、5、10、50、100μg/mL胰蛋白酶处理30min,然后用鸡、兔和猪红细胞进行血凝(HA)试验;用已经鉴定为PEDV抗体阳性的血清和乳清分别进行血凝抑制(HI)试验。结果显示:4株PEDV毒株只与兔红细胞发生凝集反应;CV777、DR13毒株的HA现象需要用5μg/mL的胰蛋白酶进行预处理,但是YN13和YN144毒株的HA现象不需要胰蛋白酶作用;该凝集现象能够被PEDV抗体特异性抑制。结果表明,PEDV能够凝集兔的红细胞,不能凝集鸡和猪的红细胞,因而可以用兔红细胞建立PEDV的HA和HI试验方法。     

禽流感病0毒血凝素保守氨基酸对其受体结合位点的影响

采用PCR定点突变技术,对H5N1亚型禽流感病毒的血凝素HA基因受体结合位点相关的保守氨基酸分别进行以下位点的定点突变:35位K→R、45位D→N、98位Y→F、193位K→R和267位A→T,构建突变表达载体pCI-HA,转染293T细胞进行瞬时表达.流式细胞检测结果显示:193位K→R的突变体的HA的表达显著增加;98位Y→F突变体的HA的表达受到显著抑制.同时,血球吸附试验表明,同→HA突变体吸附鸡红细胞和马红细胞时,显示出不同的红细胞吸附能力.因此,受体结合位点相关的193位和98位的保守氨基酸不仅对受体结合位点结构域的形成有影响,它们还在决定AIV感染的宿主特异性中具有重要的作用.     

AIV致病分子基础的研究进展

在自然条件下 ,AIV感染的宿主范围有较强的特异性 ,各毒株所表现的毒力也有所不同。从 HA蛋白切割位点氨基酸序列、HA蛋白切割位点附近的糖基化位点数目、HA蛋白受体结合位点性质以及 NA茎区长度等方面 ,阐明了 AIV毒力的差异及其感染宿主特异性的分子机理 ,为更好地预防与控制 AIV奠定理论基础。下面对 AIV致病的分子基础研究进展作一综述     

水禽新城疫血凝抑制试验存在的问题

新城疫病毒能够与鸡红细胞发生凝集现象,这种红细胞凝集现象可被特异性免疫血清所抑制,即红细胞凝集抑制试验(HI)。由于血凝反应可被特异性抗体所抑制,抗体与病毒结合后,血凝素不能吸附于红细胞表面的受体上,出现凝集抑制现象。该方法具有以下优点:①敏感性强,可以检测到微量的抗体,结果也较为准确,是较敏感的血清学反应之一;②特异性强,病毒凝集红细胞只能被特异的抗体所抑制;③检测速度快,1次HI试验只需2 h左右,即可判定结果;④HI试验对环境要求不高,操作简单,1次还可检测大量的样品。因此血凝抑制试验用于水禽血清,可以检测血清中的抗…     

禽流感病毒血凝素保守氨基酸对其受体结合位点的影响

采用PCR定点突变技术,对H5N1亚型禽流感病毒的血凝素HA基因受体结合位点相关的保守氨基酸分别进行以下位点的定点突变：35位K→R、45位D→N、98位Y→F、193位K→R和267位A→T,构建突变表达载体pCI-HA,转染293T细胞进行瞬时表达。流式细胞检测结果显示：193位K→R的突变体的HA的表达显著增加;98位Y→F突变体的HA的表达受到显著抑制。同时,血球吸附试验表明,同一HA突变体吸附鸡红细胞和马红细胞时,显示出不同的红细胞吸附能力。因此,受体结合位点相关的193位和98位的保守氨基酸不仅对受体结合位点结构域的形成有影响,它们还在决定AIV感染的宿主特异性中具有重要的作用。     

浅谈流感病毒的H A突变与受体识别的关系

近年来,经常发生禽流感病毒由禽类传染给人类的事件,但禽流感病毒在人与人之间却未发生传播,其机制可能是由于流感病毒表面的HA糖蛋白与靶细胞表面的唾液酸受体结合具有特异性。本文主要从A型流感病毒与人类受体结合的特异性、HA氨基酸的突变对禽流感感染人类的影响以及HA突变对流感病毒传播能力的影响等方面初步探讨了流感病毒HA突变与受体识别的关系,以期能为将来人们研究流感病毒的感染和传播机制提供思路。     

鳙鱼红细胞免疫功能初步检测及分析

为进一步分析非哺乳动物体内是否存在红细胞天然免疫功能,笔者以鳙鱼作为研究对象,运用荧光免疫细胞化学技术、流式细胞技术观察其红细胞的天然免疫粘附现象;运用免疫沉淀技术对鳙鱼红细胞膜总蛋白中的补体受体同源蛋白进行了分离,并采用SDS-PAGE及蛋白质免疫电泳技术对所分离的特异性蛋白进行了初步分析。结果证明,鳙鱼红细胞表面存在免疫功能受体,且该受体是鳙鱼红细胞发挥天然免疫功能的分子基础;经过免疫沉淀技术及蛋白质免疫印迹分析,得到该免疫功能受体的分子量大小为50 k Da~70 k Da。     

A型副鸡嗜血杆菌血凝素基因的克隆表达及其产物的生物学活性鉴定

根据GenBank中登录的A型Hpg Hp8株血凝素基因序列，设计合成了1对特异性引物，以Hpg Hp8株中提取的细菌DNA为模板，利用PCR扩增了Hpg血凝素全长基因（1035bp），将其克隆到pET-32a（＋）载体上，构建了原核表达载体pET—HA，表达并纯化了重组蛋白，通过免疫印迹及血凝和血凝抑制试验鉴定了该重组蛋白的生物学活性。结果显示，表达并纯化的Hpg HA重组血凝素蛋白可以和A型Hpg抗血清特异性结合，并且可以凝集鸡红细胞。表明，成功地构建了Hpg血凝素基因的原核表达载体，并表达、纯化了具有凝集鸡红细胞活性的Hpg—HA融合蛋白。     

禽流感血凝抑制试验中应注意的一些问题

禽流感病毒能够与鸡红细胞发生凝集现象，这种红细胞凝集现象可被特异性免疫血清所抑制，即红细胞凝集抑制实验(HI)。由于血凝反应可被特异性抗体所抑制，抗体与病毒结合后，血凝素不能吸附于红细胞表面的受体上，因此血凝抑制试验可以用于：①检涮血清中的抗体水平；②鉴定病毒；③辅助诊断病毒性疾病；④作为适时免疫的辅助手段，     

NA蛋白对流感病毒受体结合特性影响的研究

为研究两株H7亚型流感病毒A/chicken/Jilin/SD020/2014(H7N2)(简称JL/020)和A/Anhui/1/2013(H7N9)(简称AH/1)受体结合特异性差异的影响机制,本实验利用反向遗传操作技术,构建一系列重配病毒和HA基因点突变病毒,检测其对受体结合特性的影响。固相ELISA检测结果表明血凝素蛋白(HA)中的57和312位氨基酸不影响流感病毒的受体结合特性,而神经氨酸酶蛋白(NA)使r-JL/020(AH/1骨架)结合SAα2,3Gal受体的结合能力高于r-AH/1(R57K/R312K),表明NA影响了流感病毒受体结合特性;同源建模进一步发现HA中的57和312位点与流感病毒受体结合结构域相距较远;交叉血凝抑制试验(HI)结果表明,H7单因子血清和H7N9全病毒血清对拯救的JL/020和AH/1病毒株的抑制价没有差异,而N2单因子血清对病毒的抑制能力存在差异。以上结果表明,NA蛋白影响了流感病毒的受体结合特性。本研究表明,除HA以外,NA也能够影响流感病毒的受体结合特性,该实验为进一步研究流感病毒受体结合特性提供了实验依据。     

不同种禽类红细胞悬液对HI结果的影响

红细胞凝集抑制试验能够用于监测某些畜禽传染病,如新城疫、禽流感等的抗体水平,由于动物血清中存在某些非特异性血凝物质,致使血凝抑制试验的结果出现非特异性血凝现象。本实验采用鸡、鸭和鹅的红细胞分别与同一份血清进行血凝抑制实验,结果表明,用鸡红细胞来检测鸭、鹅血清抗体效价时,出现非特异性血凝的血清份数较少;而用鸭、鹅红细胞来检测鸡血清的抗体效价时,出现非特异性血凝的血清份数较多。     

血凝和血凝抑制试验及易出现问题的原因分析

某些病毒能够与动物的红细胞发生凝集,即为红细胞凝集反应（HA）。这种凝集反应易被加入的特异性血清所抑制,即为红细胞凝集抑制试验（HI）。在禽病中目前这2种方法较常用作新城疫病毒、禽流感病毒等的诊断和血清学监测。     

血凝抑制试验影响因素分析

某些病毒(如禽流感病毒和新城疫病毒)能够与禽类的红细胞发生凝集,这种红细胞凝集现象可以被特异性免疫血清所抑制,即红细胞凝集抑制试验(HI).该方法是根据病毒的血凝蛋白具有识别并吸附于红细胞表面受体的生物学特性而建立起来的.由于血凝反应可被特异性抗体所抑制,抗体和病毒结合后,血凝素不能吸附于红细胞表面的受体上,所以血凝抑制试验可用于:发现与鉴定病毒;诊断病毒性疾病;监测机体血清抗体水平;为免疫程序制定提供准确基础数据,防止重复免疫、免疫失败和免疫空档的发生.该方法是一种在基层临床实践中极易推广的检验、检疫手段与诊断方法.目前在血凝抑制试验方面存在一些不规范操作问题,从而影响试验结果的准确性,导致不正确结果的出现.     

猪流感病毒H1N1亚型济南株HA、NA、NP基因的克隆与序列分析

根据GenBank中流感病毒H1N1亚型HA、NA、NP基因序列,分别设计扩增HA、NA、NP基因的特异性引物,用RT-PCR方法扩增猪流感病毒(SIV)H1N1济南株(SW/SD/JT/07)HA、NA、NP基因,分别将RT-PCR产物克隆入pMD18-T载体,进行测序分析。结果显示,SW/SD/JT/07(H1N1)HA基因长为1 701bp,编码566个氨基酸;HA蛋白切割位点为IPSIQSR↓G,属于非高致病性毒株;HA蛋白有8个糖基化位点,其中有6个在HA1蛋白上,有2个在HA2蛋白上,与个别参考毒株糖基化位点个数不同;HA蛋白上的受体结合位点与多数参考毒株一致。SW/SD/JT/07(H1N1)NA基因长为1 410bp,编码469个氨基酸;NA基因颈部未发现氨基酸缺失现象;NA蛋白的头部有5个可能的抗原位点Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ分别由5个区段组成,在340、346、366位分别为P、I、N,其余参考毒株在相应位置的氨基酸分别为S、V、S;NA蛋白共有8个糖基化位点,与个别参考毒株的糖基化个数不同。SW/SD/JT/07(H1N1)NP基因长为1 565bp,编码498个氨基酸,根据HA、NA、NP基...     

兔出血症病毒对人类红细胞的血凝谱研究

应用兔出血症病毒标准毒株与人类各型红细胞进行血球凝集反应(HA)。结果表明,兔出血症病毒能凝集人类各型红细胞,且对“O”型、“B”型和“AB”型红细胞的凝集反应快而强烈,HA效价很高(5×213 ～5×215);而对“A”型红细胞的凝集反应慢而弱,HA效价很低(5×21)。据此认为,除“A”型红细胞外,其它3 种血型的红细胞均可用于兔出血症的实验室诊断。     

鸡醛化红细胞在鸽Ⅰ型副粘病毒HA和HI试验中的应用

在血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验中，传统的方法采用新鲜红细胞。由于新鲜红细胞容易破碎，保存时间短，每次试验需临时准备，使用很不方便。本文采用醛化红细胞进行鸽1型副粘病毒的HA和HI试验，并与新鲜红细胞进行对照，结果表明，两种红细胞在鸽1型副粘病毒的HA和HI试验中的结果基本一致，而使用醛化红细胞更为便利。现将结果报道如下。1材料与方法l．l鸽1型副粘病毒（鸽A／PMV－1）；鸽A”MV－IZH株由本室鉴定保存，在9－11日龄鸡胚培养后收获尿囊液无菌检查后置4C保存备用。用于HI试验的病毒经0．2％甲醛37C灭活24小时后置…     

流感病毒 HA 受体结合位点抑制剂研究进展

目前临床所用控制流感病毒的药物和疫苗受到病毒耐药性、疫苗滞后性等诸多因素的限制,使能阻止病毒侵入宿主细胞的抑制剂成为当前研究的热点。唾液酸是流感病毒囊膜表面血凝素（HA）的受体,但研究表明唾液酸并不适合作为研制流感病毒侵入宿主细胞抑制剂的结构模型。研究发现流感病毒的HA 受体结合位点必须外露才能与宿主细胞受体结合,因此 HA 受体结合位点可以被宿主免疫系统监视,成为抗体潜在的靶向契合位点。随后发现的 HA 受体结合位点抗体能与 HA 受体结合位点的保守氨基酸残基结合,能有效阻止流感病毒感染宿主。因此,可用 HA 受体结合位点抗体作为流感病毒感染抑制剂的模型,研制流感病毒抑制剂。论文就流感病毒 HA 的分子结构和功能,HA 结合受体的机制,HA 受体结合位点抗体以及该类抗体对流感病毒的抑制效果进行了阐述,以期对以 HA 受体结合位点抗体为模型研制流感病毒感染抑制剂提供帮助。     

鸡醛化红细胞在血凝和血凝抑制试验中的应用

应用鸡醛化红细胞 (FoRBC)代替新鲜配制红细胞 (FrRBC) ,进行血凝试验 (HA)和血凝抑制试验 (HI) ,以检测病毒滴度及其对应抗体效价。结果 :0 75 %FoRBC与 1 %FrRBC所测病毒HA和相应抗体HI效价一致。表明 0 75 %FoRBC可以替代 1 %FrRBC ,且具有不易破裂 ,保存期长 ,使用方便 ,无自凝 ,图象清晰、稳定 ,结果易判定等优点