Pathological Changes in Virus Enteritis of Mink

The lesions which characterize viral enteritis of mink (VEM) were studied in twenty-six, ten-week-old mink which had been infected by force feeding a tissue suspension containing a Wisconsin strain of mink enteritis virus. The pathogenesis of the lesions was reconstructed from gross and histopathological changes observed in animals which were selected randomly from the group each day for necropsy during the course of the disease.

Alterations were observed in the tissues of all mink examined from post-inoculation day (PID) 4 through 13. The principal macroscopic lesions which consisted of fibrinous enteritis, enlargement and hemorrhage of the spleen and edema of mesenteric and hepatic lymph nodes were most conspicuous on PID 7 and 8. Histopathological changes including necrosis and desquamation of intestinal epithelium, depletion of mature lymphocytes in lymph nodes, thymus and spleen and loss of partly differentiated myeloid and erythroid cells from spleen and bone marrow also reached full development on PID 7 and 8. However, nuclear inclusion bodies which were presumed to be a product of the causative agent and, therefore, of diagnostic significance were most prevalent on PID 3, 4 and 5. The inclusions were observed in mucosal epithelial cells of the intestine, parenchymal cells of the liver and in lymphocyte precursor cells of the spleen, intestinal lymph nodules and masenteric and hepatic lymph nodes.

     

水貂细小病毒性肠炎弱毒疫苗的研究

用猫泛白细胞减少症病毒(FPV)弱毒作为制苗毒种,经CRFK细胞培养15代,使其滴度稳定在10~(5.0)～10~(5.0)TCID_(50)/0.03mL之间.经4代猫体返祖试验证明,该弱毒无返祖现象.10倍免疫剂量的水貂安全试验证明,该弱毒毒力稳定,对水貂无感染性.用FPV弱毒4～15代病毒研制成功的水貂肠炎弱毒疫苗,各项试验证明,该苗安全可靠,免疫剂量为10~(3.0)×1mL,免疫效果好,保护率在95%以上,免疫期6个月以上.     

Some Clinical and Hematological Features of Virus Enteritis of Mink

Twenty-six, ten-week-old mink were infected by force feeding by pipette 2 ml of a tissue suspension containing a Wisconsin strain of mink enteritis virus. Four days later, diarrhea and partial or complete loss of appetite developed simultaneously in all of the animals. Squinting and occasional vomiting were also observed. By the sixth day after inoculation, all of the mink were anorectic and weak. Anorexia persisted for 48 to 96 hours. Diarrhea and vomiting continued until the eighth to ninth day after exposure. For the first two days after the appearance of diarrhea, the feces contained large quantities of mucus and intestinal casts were seen frequently in the droppings. Thereafter, the feces consisted mostly of yellowish green, watery fluid and contained no casts. Some of the animals died on the eighth day after infection. Those which survived were severely dehydrated and debilitated, but resumed eating and achieved complete clinical recovery within the next five to six days.

Leukopenia, i.e., total leukocyte count of less than 5,000 cells per mm³ of blood, was found in seven of nine mink examined during the height of the disease. Leukopenic animals were deficient in both lymphocytes and neutrophils.

     

猫细小病毒、犬细小病毒、貂细小病毒的特征比较

猫细小病毒、犬细小病毒和貂细小病毒是3种极为相似的细小病毒。最初人们主要根据患病水貂、猫、犬临床症状相似的特点,注意到它们之间可能有密切关系。时至今日,对这3种病毒的许多方面都已进行了深入的研究。作者从猫细小病毒、犬细小病毒、貂细小病毒病共同特性、生物学差异和进化机制等方面对这3种病毒的特征进行了比较和综述。     

水貂肠炎病毒VP2基因的原核表达及鉴定

在分析水貂肠炎病毒VP2基因主要抗原位点分布的基础上,设计了1对特异性引物,克隆一段长为846 bp,编码主要抗原位点的基因片段。将该基因片段定向插入表达载体PET-32a中,转化BL21(DE3)菌株,IPTG诱导实现高效表达。诱导表达比较实验结果表明,在37℃,IPTG浓度为1.0 mM,诱导时间为6 h,诱导表达达到最大效率。重组蛋白以包涵体形式存在,大小约为50 KD,应用兔抗水貂MEV抗体,经Western-blotting验证该重组蛋白具有MEV的抗原性,可为今后抗MEV单克隆抗体制备及相关免疫学检测方法的建立提供良好的抗原物质。     

致病性水貂肠炎病毒MEV-ZJ1株的分离与鉴定

自临床疑似水貂病毒性肠炎发病貂的粪便中分离出1株病毒,经病毒形态观察、理化特性检测、血清学、聚合酶链式反应（PCR）和动物试验鉴定表明,该分离毒为水貂肠炎病毒（mink enteritis virus,MEV）,命名为MEV-ZJ1株。用分离毒接种水貂,试验动物均表现出典型水貂病毒性肠炎临床症状。研究表明,MEV-ZJ1分离株对水貂具有致病性,是1株强毒,为进一步开展该病毒流行病学、致病机理、疫苗免疫与诊断检测的研究奠定了基础。     

水貂肠炎病毒VP2基因原核表达及鉴定

采用PCR技术扩增MEV VP2基因,将该基因片段定向克隆原核表达载体PET-30a,构建MEV VP2基因原核表达重组质粒PET-30a-VP2。将该重组质粒转化到宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导后进行SDSPAGE和Western-blotting分析。结果表明:该基因全长1 755 bp,其目的基因序列完全正确,能编码584个氨基酸。利用载体上的His标签对其进行纯化,经SDS-PAGE鉴定该重组蛋白以包涵体的形式存在,大小约为70 ku;Western-blotting验证该重组蛋白具有被抗MEV血清识别的特性,具有良好的反应原性,可为MEV基因工程亚单位疫苗、免疫学诊断方法等提供参考。     

水貂肠炎病毒的提纯及部分生化特性分析

应用高速离心—PEG沉淀—蔗糖和氯化铯密度离心—氯化铯平衡密度梯度离心等方法,从水貂肠炎病毒猫肾细胞培养物中提纯病毒粒子。提纯的病毒粒子分为氯化铯浮密度为1.32～1.36g/ml的空壳病毒粒子和氯化铯浮密度为1.40～1.42g/ml的实心病毒粒子。应用SDS—PAGE分析,实心病毒粒子有结构蛋白3种,(VP_1,VP_2、VP_3),空壳病毒粒子有2种(VP_1、VP_2);从第5d培养物中提纯的实心粒子的VP_3含量少于第7d培养物的量。从第7d培养物中提纯的实心病毒粒子经尿素、NP_(40)、TritonX—100裂解后,在薄层聚丙烯酰胺等电聚焦电泳中出现4条蛋白带。从感染48h的细胞培养物中提取到水貂肠炎病毒线状双股复制型DNA(RF—DNA)。通过琼脂糖凝胶电泳测定,该RF—DNA大约有5000个硷基对。经限制性内切酶分析,RF—DNA有2个HindⅢ酶切点,1个PstⅠ酶切点和1个ECoRⅠ酶切点。     

水貂肠炎病毒VP2基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

利用昆虫杆状病毒表达系统表达水貂肠炎病毒(mink enteritis virus,MEV) VP2 基因,表达的蛋白能够形成病毒样粒子,具有反应原性,为研究MEV新型疫苗奠定基础。采用PCR方法扩增MEV VP2 基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体,目的基因定向克隆到pFast-BacⅠ载体中,构建重组转座载体后转化DH10 Bac感受态细胞,获得重组Bacmid 质粒后转染Sf9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行 Western blotting鉴定。结果成功克隆MEV VP2基因。Western blotting结果证实,表达蛋白能够被MEV单克隆抗体识别。在 Bac-To-Bac 杆状病毒表达系统中成功的表达了MEV VP2蛋白,目的蛋白具有较好的反应原性。     

水貂肠炎病毒高免卵黄抗体的制备及应用

用水貂肠炎病毒免疫蛋鸡制备卵黄抗体,结果表明,经５次免疫制备的卵黄抗体,于最后一次免疫第１０天ＡＧＰ效价达１：３２,第３０天效价为１：８。该抗体较稳定。４℃保存１２０天,－２０℃保存１８０天效价不变。用该抗体治疗细小病毒肠炎病犬,治愈率达９３．９％,证实用水貂肠炎病毒制备卵黄抗体是成功的,可用于国小病毒肠炎的治疗。     

Feline Panleucopaenia Virus—in vitro Comparison of Strains with a Mink Enteritis Virus

Abstract— —From liver and spleen emulsions of mink suffering from mink enteritis, a virus was recovered in tissue culture of kitten kidney monolayers. The cytopathic effect induced was indistinguishable from that described for feline panleucopaenia virus, and the virus had similar properties of chloroform, ether, acid and heat resistance. Serological comparison with 6 strains of feline panleucopaenia virus in vitro showed all viruses to have similar antigenicity. Résumé— —Un virus provenant des émulsions du foie et de la rate de vison souffrant d'entérite “de visons” a été recouvré dans des cultures de tissus de rein de chat. L'effet cytopathique induit n'a pas été différent du virus décrit dans la panleucopénie féline et ce virus possède des propriétés similaires de résistance au chloroforme, à l‘éther, à l'acide et à la chaleur. Une comparaison sérolo-gique in vitro avec 6 souches de virus de panleucopénie féline montra que tous les virus avaient un pouvoir antigenique similaire. Des rapports antérieurs avaient décrit l'isolement d'un virus provenant d'un léopard avec panleucopénie féline suspecte (FP), l'identification de ce virus comme agent causal de la FP chez les chats domestiques, des détails sur l'effet cytopathique (CPE) et une comparaison de ses propriétés avec celles d'une souche de virus provenant d'une rhinotrachéite virale (Johnson, 1964, 1965a, b, c, 1966). L'entérite du vison a été reconnue premièrement au Canada par Schofield (1949) et la similarité entre cette maladie et l'entérite féline (FP) a été reconnue par Wills (1952) qui montra l'existence d'une relation antigenique entre les virus de ME et FP dans les tests de protection croisé. Cette observation a été appuyée par les découvert de Wills et Belcher (1956) qui montrèrent que le vaccin FP protégeait le vison contre ME et les travaux de Burger, Gorham et Ott (1963) qui démontrèrent qu'un vaccin ME inactivé protégeait les chats contre FP. Myers et Fritz (1959) démontrèrent cependant des différences histologiques dans la muqueuse intestinale du vison infecté avec des tissus FP et ME, mais Myers, Albert and Brandly (1959) échouèrent de démontrer l'identité antigenique du FPV et du MEV chez le vison, par des tests de protection croisée. Plus récemment Gorham, Hartsough, Sato et Lust (1965) démontrèrent in vitro une parenté antigenique entre MV et FP, en utilisant un virus propagé par des cellules félines, considéré comme un virus FP. Antérieurement des comparaisons complètes de virus ME and FP in vitro ne furent pas possible. Seulement récemment le virus FP a été propagé dans des cultures de tissus (Johnson, 1965) mais une propagation du virus ME in vitro n'a pas ete rapportée. Le rapport présent décrit l'isolement d'un virus de tissus ME qui sérologiquement ne peut pas être différenciéin vitro d'autres 6 souches de virus FP, dans les tests de neutralisation croisée, mais qui est comparable au point de vue effet cytopathique et propriétés physiques. Zusammenfassung— —Von Leber- und Milz- Emulsionen von Nerz mit Nerz-Enteritis wurde in Gewebe-Naehrboden von Einzellagen von Nieren von jungen Katzen ein Virus gewonnen. Der zytopathische Effekt der damit erreicht erreicht wurde, konnte nicht von dem unterschieden werden, der fuer Katzen-Panleukaemie-Virus beschrieben worden ist; und das Virus hatte aehnliche Eigenschaften fuer Chloroform-, Aether-, Saeure- und Hitze-Widerstand. Serologische Vergleiche mit 6 Arten von Katzen-Panleukaemie-Virus in vitro zeigten, dass alle Viren aehnliche Antigenitaet hatten. Fruchere Berichte beschrieben die Isolierung eines Virus von einem Leoparden mit vermutlicher Katzen-Panleukaemie, die Erkennung dieses Virus als gelegentliche Ursache derselben Krankheit in Haus-katzen, Einzelheiten des zytopathischen Effekts, und ein Vergleich seiner Eigenschaften mit einer Kultur von Katzen-Rhinotracheitis-Virus (Johnson, 1964, 1965 a, b, c, 1966). Nerz-Enteritis wurde zuerst von Schofield (1949) in Kanada erkannt. Die Aehnlichkeit zwischen dieser Krankheit und Katzen-Enteritis wurde von Wills (1952) erkannt. Er zeigte, dass eine antigene Beziehung zwischen den Viren von Nerz-Enteritis und Katzen-Panleukaemie im “cross protection test” bestand. Diese Beobachtung wurde durch die ßefunde von Wills und Belcher (1956) unter-stuetzt, die zeigten, dass Katzen-Panleukaemie-Vaccine Nerz gegen Nerz-Enteritis schuetzten, und Burger, Gorham und Ott (1963), die demonstrierten, dass inaktivierte Nerz-Enteritis-Vaccine Katzen gegen Katzen-Panleukaemie schuetzten. Dagegen zeigten Myers und Fritz (1959) histo-logische Unterschiede in der intestinalen Mucosa von Nerz, das mit Katzen-Panleukaemie und Nerz-Enteritis-Gewebe infiziert war; und Myers, Albert und Brandly (1959) waren nicht in der Lage, antigenische Identitaet von Katzen-Panleukaemie-Virus und Nerz-Enteritis-Virus in “cross protection tests” in Nerzen nachzuweisen. Kuerzlich demonstrierten Gorham, Hartsough, Sato und Lust (1965) in vitro eine antigenische Beziehung zwischen Nerz-Enteritis und Katzen-Panleukaemie. Sie benutzten ein Virus, das in Katzenzellen erzeugt und wahrscheinlich Katzen-Panleukaemie-Virus war. Komplette in vitro-Vergleiche von Nerz-Enteritis und Katzen-Panleukaemie-Viren sind frueher nicht moeglich gewesen. Erst kuerzlich wurde Katzen-Panleukaemie-Virus in Gewebe-Naehrboden gewonnen (Johnson 1965); keine fruehere in vitro-Erzeugung von Nerz-Enteritis-Virus ist berichtet worden. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Isolierung eines Virus von Nerz-Enteritis-Gewebe, das serologisch nicht von 6 Arten von Katzen-Panleukaemie-Virus bei in vitro- cross Neutralisierungs-Tests unterschieden werden kann. Es ist in seinem zytopathischen Effekt und physischen Eigenschaften vergleichbar.     

Epizootiology of Mink Enteritis: III. Carrier State in Mink

The MEV carrier state in mink was studied and evidence that mink may carry the virus and excreted it in feces over a period of a year is presented. The significance of the carrier state is discussed especially in regard to the epizootiology of the disease.     

水貂病毒性肠炎巢式PCR,PCR-RFLP联合诊断方法的建立

根据水貂肠炎细小病毒的VP2基因序列设计4条特异性引物,建立了检测水貂肠炎细小病毒的巢式PCR方法。采用一次扩增的敏感性来检测5个TCID50/mL的细小病毒MEVB株,二次扩增的敏感性来检测0.05个TCID50/mL的细小病毒MEVB株。同时,利用该方法第一轮PCR产物酶切,能够区分犬细小病毒与水貂肠炎细小病毒,具有重要的实用价值和应用的前景。     

水貂肠炎细小病毒灭活疫苗抗体消长规律的研究

应用血凝抑制试验对水貂肠炎细小病毒灭活疫苗免疫水貂进行抗体水平动态监测,结果表明,疫苗接种14 d抗体达到保护,21~30 d抗体水平达到高峰;免疫180 d抗体仍在保护值以上。攻毒试验证实,免疫180 d后90%免疫水貂获得保护,确定水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗免疫保护期可持续6个月。     

水貂肠炎细小病毒的分离鉴定及其VP2基因的序列分析

本试验从疑似细小病毒感染的病死水貂中分离到1株病毒。经PCR鉴定、细胞培养、蛋白质电泳鉴定最终确定为水貂肠炎细小病毒(MEV),命名为MEV-WFD。对该分离病毒的衣壳蛋白VP2基因进行克隆测序分析,结果表明此病毒VP2基因3处碱基发生点突变,其中一处的突变导致第328处氨基酸残基由疏水性丙氨酸(Ala)变为亲水性苏氨酸(Thr)。将此株病毒VP2基因与GenBank上公布的所有MEV的VP2基因碱基序列进行同源性比较及进化树分析,结果表明该病毒与ZYL-1、MEV/LN/-10和Manzhouli的VP2基因同源率最高,为99.8%;进化树构建结果表明,该病毒与6株已公布的病毒属于同一进化分支。     

实验性水貂细小病毒性肠炎的病理形态学研究

健康水貂6只,3只作对照,另3只口服-20℃保存9个月的水貂细小病毒性肠炎粪毒。实验貂临床症状典型,小肠粘膜出现“气球样”上皮细胞,肠腺和绒毛上皮细胞广泛变性、坏死、脱落,胞浆内可见嗜酸性小体;胞核可见两种类型Cowdry A型包涵体;在肠系膜淋巴结、骨髓、脾和肾上腺也观察到了核内包涵体。在小肠绒毛上皮细胞膜上和肠腺腺腔中发现大量G-小杆菌。同时,用扫描电镜观察了各肠段粘膜表面的变化;用透射电镜研究了空肠前段粘膜上皮细胞中水貂细小病毒(MPV)的形态发生及其所引起的超微病变,发现核仁及其相随染色质参与了核内包涵体的形成。