澳洲鳗鲡微卫星分子标记的筛选与检测

采用小片段克隆法构建了澳洲鳗鲡(Anguilla australis)的部分基因组文库,并用地高辛标记的(CA)15作探针筛选阳性克隆,共获得76条微卫星序列.其中10次以下CA连续重复序列占83.67%,没有检测到30次以上的连续重复序列.根据微卫星序列两端足够长的侧翼序列,设计引物55对,选择合成引物26对,用澳洲鳗鲡3个个体的混合基因组进行引物筛选,其中的18对具有清晰的扩增条带.将筛选出的18对引物对澳洲鳗鲡1个群体的40个个体进行了遗传多样性分析,其中1对引物扩增产物为单态,17对扩增产物呈现多态;17对扩增多态的引物在40个个体中扩增出等位基因数目为5～14,平均为9个.该澳洲鳗鲡群体的PIC、Ho、He的平均值分别为0.715 7、0.677 9、0.7374,所有位点均符合哈迪-温伯格平衡(P=0.05),结果证明这17个微卫星位点适于澳洲鳗鲡群体结构的研究分析.[中国水产科学,2009,16(1):133-138]     

磁珠富集法分离草鱼微卫星分子标记

磁珠富集法是一种快速、高效的分离微卫星分子标记的方法。本研究通过该方法分离草鱼的微卫星分子标记。将草鱼（Ctenopharyngodon idella）基因组DNA经Sau3AI酶切,同收纯化400～900bp片段,连上接头,构建“基因组PCR文库”。用生物素标记的简单重复序列（CA）15作探针与其杂交,杂交复合物结合到包被有链霉亲和素的磁珠上,经一系列的洗涤过程,去除磁珠表面不含有微卫星的片段。将吸附在磁珠上的片段洗脱,PCR扩增放大,再进行克隆和测序,根据微卫星两端的保守序列设计引物,即可得到微卫星分子标记。本研究义通过同位素标记的探针（CA）15进行二次杂交筛选,获得阳性克隆132个,所得到的阳性克隆经测序,86．36％含有微卫星序列,共获得130个微卫星DNA序列。用引物设计软件Primer Premier5．0没计引物83对。     

云斑尖塘鳢微卫星分子标记的筛选与检测

用磁珠富集法分离云斑尖塘鳢的微卫星序列,由所获得的1032个克隆中筛选出146个阳性克隆,经测序81个含有微卫星序列,52个为完美型,27个为非完美型,2个为复合型,其中43个微卫星序列重复次数在10以上。所获得的云斑尖塘鳢微卫星序列中除探针中使用的CA重复单元和GA重复单元外,还有TAC等其他类型的重复单元。设计合成38对微卫星引物,其中29对引物可稳定扩增出条带,使用这些引物对云斑尖塘鳢48个个体进行检测显示:观测杂合度平均值为0.63,期望杂合度平均值为0.43。29对引物中1对引物表现为单态,7对表现为高度多态,14对表现为中度多态,7对表现为低度多态,多态性较为丰富,说明本研究开发的绝大部分微卫星分子标记较为理想。     

FIASCO法筛选鳜鱼微卫星标记

通过FIASCO(Fast Isolation by AFLP Sequences Containing repeats)法构建鳜鱼(Siniperca chuatsi)基因组微卫星富集文库,分离微卫星DNA序列并对其特征进行分析。鳜鱼基因组DNA经MseⅠ限制性内切酶消化后,选取200~800 bp的片段与MseⅠ接头连接,用生物素标记的寡核苷酸探针(AC)8、(CT)8、(AT)7、(GATA)8、(GATT)7与其杂交,杂交复合物结合到包被有链霉亲和素的磁珠上,变性洗脱获得单链目的片段,经PCR扩增形成双链,然后克隆到pGEM-T载体上,转化至DH5α中,首次成功构建鳜鱼基因组微卫星富集文库。对其中100个阳性克隆进行测序,60个(60%)含有微卫星序列(GenBank Accession Number:DQ789247~DQ789306)。成功设计了47对鳜鱼微卫星引物,并合成21对引物进行PCR扩增,结果筛选出18个多态性微卫星标记。结果表明:FIASCO法能有效提高筛选微卫星标记的效率。本研究筛选的微卫星标记可以用于鳜鱼遗传背景分析和遗传连锁图谱构建,并将为鳜鱼基因组结构分析、标记辅助育种以及数量性状位点(QTL)基因的定位等研究提供候选微卫星标记。     

施氏鲟性别相关的微卫星标记筛选

用32个微卫星标记分析了30尾（15尾♀;15尾♂）性成熟（12龄）施氏鲟（Acipenser schrenckii）雌雄个体的遗传差异。结果表明：雌、雄群体的遗传多样性差异没有达到显著水平。在6个微卫星标记中有9个等位基因在雌、雄群体中分布比例差异达到50%以上,其中雌性群体HLJSX 194-239bp、HLJSX201-207bp、HLJSX209-210bp、HLJSX210-178bp和HLJSX215-221bp 5个等位基因频率显著高于雄性群体;雄性群体HLJSX194-184bp、HLJSX201-214bp、HLJSX210-233bp和HLJSX226-194bp 4个等位基因频率显著高于雌性群体,初步表明这些基因位点可能与性别决定位点存在一定连锁关系。本研究结果为施氏鲟早期性别鉴定积累了基础数据。     

凡纳滨对虾EST微卫星标记初步筛选

对161 075条凡纳滨对虾dbEST(database of “Expressed Sequence Tags”)的数据进行SSR序列筛选,搜索参数为二~六核苷酸重复6次以上(包括6次),共获得含SSR的EST序列12 600条,占整个凡纳滨对虾dbEST数据库的7.8%,其中二核苷酸重复10 104条,占总ESTSSR序列的80.2%; 三核苷酸重复2 036条(16.1%),四核苷酸重复336条(2.7%),五核苷酸重复35条(0.3%),六核苷酸重复89条（0.7%）。大部分发现的微卫星序列为完美型(perfect)的重复序列。在二核苷酸所获得的SSR重复单元中,AG/CT是优势重复单元,共分布4 820条,占二核苷酸各重复单元的47.8%;其次是AC/GT重复,共分布3 584条,占二核苷酸各重复单元的35.4%;最后是AT/TA 和CG/GC,分别占二核苷酸各重复单元的16.6%和0.2%。通过对凡纳滨对虾EST序列中SSR位点信息的发掘分析,共设计77对微卫星引物,在10个个体中成功扩增的引物有54对,成功扩增率为70.1%。其中多态性丰富的引物28对,多态率为51.9%。等位基因数为2～5,PCR产物大小为140～600 bp。本研究筛选的ESTSSR标记将为凡纳滨对虾的分子遗传学研究、种质鉴定等提供可靠的工具。     

斑马鱼微卫星分子标记检测鲤鱼种间多态性

用6072对斑马鱼（Danio rerio）微卫星引物对黑龙江鲤（Cyprinus carpio haematopterus Temminck et Schlegel）、荷包红鲤（Cyprinus carpio var．wuyuanensis）和柏氏鲤（Cyprinus pellegrini Tchang）进行种间遗传差异分析，共发现563个斑马鱼微卫星标记在鲤鱼种间表现出多态性。从中随机抽选25个标记，对斑马伍和3种鲤鱼的遗传多样性进行分析，使用Phylip3．63软件按照Nei氏标准遗传距离计算种间遗传距离，再用MEGA3．0软件绘制NJ系统发生树，并进行1000次bootstrap检验系统树。结果显示，黑龙江鲤与荷包红鲤首先聚类，然后是柏氏鲤、斑马鱼。这些具有多态性的斑马鱼微卫星标记可用于鲤鱼种间种质鉴定，同时，借用模式生物斑马鱼的丰富遗传标记资源，增加同科的鲤鱼遗传连锁图谱上遗传标记的密度，必将对鲤鱼遗传育种进入分子育种时代起到促进作用。     

企鹅珍珠贝微卫星分子标记的筛选

运用生物素与链霉亲和素的强亲和性原理,用生物素-磁珠吸附微卫星富集法,筛选企鹅珍珠贝（Pteria penguin）的微卫星分子标记序列,进而对南海区企鹅珍珠贝的遗传多样性进行分析。对136个菌落中的85个阳性克隆进行微卫星测序,获得64个序列,达到85.93%。所得到的55个重复6次以上的微卫星序列中,除生物素探针中...     

企鹅珍珠贝微卫星分子标记的筛选

运用生物素与链霉亲和素的强亲和性原理,用生物素-磁珠吸附微卫星富集法,筛选企鹅珍珠贝(Pteria penguin)的微卫星分子标记序列,进而对南海区企鹅珍珠贝的遗传多样性进行分析。对136个菌落中的85个阳性克隆进行微卫星测序,获得64个序列,达到85.93%。所得到的55个重复6次以上的微卫星序列中,除生物素探针中使用的CA重复外,还得到TG、TC、GA的重复序列。重复序列中完美型36个,占65.5%;不完美型14个,占25.5%;混合型5个,占9.1%。利用Primer Premier5.0设计引物40对,合成其中的20对并进行PCR筛选,15对可扩增出特异性条带。研究表明,筛选出的企鹅珍珠贝微卫星分子标记可用于进一步的遗传多样性分析。     

瓦氏马尾藻微卫星分子标记的筛选

采用锚定PCR技术,构建了瓦氏马尾藻(Sargassum vachellianum)微卫星富集文库。阳性克隆筛选、测序和序列分析结果表明,在筛选的523个白色菌落中,214个克隆(占筛选白色菌落数的41%)含有重复的微卫星序列,其中105个(20.1%)有随机侧翼区,可以进行引物设计,109个缺乏足够的侧翼序列。在获得的微卫星序列中,完全的占50%;不完全的占2.3%;复合的占47.7%。重复次数5以上的微卫星序列主要以二碱基重复为主,除引物中使用的CT、GT和CAC重复单元外,还观察到AC、GA、CG、AT、CTA、TAG和AGT的重复序列。微卫星重复次数主要集中在6~10次之间,占92%,最高为23次。设计的54对微卫星引物中有8对能够在野生瓦氏马尾藻群体中进行多态性扩增。本研究中构建的瓦氏马尾藻富集微卫星文库将为以后开发未知微卫星标记提供帮助。     

鲢微卫星标记研制及其在鲢和鳙遗传多样性研究中的应用

鲢(Hypophthalmichthys molitrix)和鳙(Aristichys nobilis)是中国特有的四大家鱼中2个重要成员,主要分布于黑龙江、长江和珠江水系.传统人工养殖依靠天然鱼苗.但是,人口增长和人类经济活动加剧使其天然产卵和孵化场消失或遭到破坏.人工育苗技术虽然解决了鱼苗供应问题,但由于遗传资源管理和使用方法的不完善,使两种鱼的生长表现、抗病抗逆性和遗传多样性等都有明显的降低.另外,因洪水导致的养殖个体逃逸也使天然群体的遗传多样性受到干扰.近年来,比较大规模的人工鱼苗放流实践也加剧了对天然群体遗传多样性的扰动.对这些问题的深入研究迫切需要一套适用的分子标记.为评价鲢和鳙的遗传多样性、确定它们的遗传分化和地理分化、科学合理地管理和开发利用遗传资源,本研究构建了富集GT微卫星序列的基因组短片段文库.随机选择并测序的97个克隆中有87个含有微卫星序列.根据其中的21条序列,设计了22对微卫星标记引物并用来分析了在长江荆州段捕获的32尾野生鲢和7尾野生鳙的遗传多样性.所有标记引物在两种鱼中通用.在全部样品中共发现129个等位基因.每位点等位基因数在3～10个,平均5.9个.不同标记揭示的遗传多样性指数在0.33～2.00,平均1.22.由于使用的鱼个体数少,如鳙,只有7个个体,样品也只来源于长江荆州江段.本研究无法基于两种鱼的天然分布,对两种鱼的遗传分化、地理种群多样性比较、养殖群体和天然群体差异等问题进行深入分析.但是,这组标记的研制将有助于这2个中国特有经济鱼种的遗传多样性分析、遗传资源的管理及开发利用等相关研究.本研究中,微卫星DNA标记的研制使用了固定有微卫星核心序列的磁珠.这样的磁珠与两端接有已知序列的DNA片段杂交能富集出含有微卫星核心序列的片段.通过扩增和连接转化,可方便地获得大量含微卫星核心序列的片段.与已有的方法不同的是,本研究用AFLP方法的某些步骤使片段两端加上已知引物序列,方便易行.迄今,这两种鱼还没有微卫星标记连锁图谱.构建这样的图谱是本项目研究的长远目标.     

Effect of stunting of juvenile bighead carp Aristichthys nobilis (Richardson) on compensatory growth and reproduction

The study was conducted to determine if stunting of young bighead carp Aristichtys nobilis (Richardson) would affect subsequent growth and reproduction. Juveniles (3 g each) were stocked directly in cages (control) in a lake or stunted in tanks for 6, 12, 18 or 24 months before being stocked in cages. Initially, body weights and lengths of stunted carp in cages were significantly lower (P<0.05) than those of the control fish. The carp stunted for 6, 12 and 18 months showed growth compensation, although their weights and lengths were slightly lower than those of the control fish. The body weight and length of fish stunted for 24 months were the lowest throughout the rearing period. Sexual maturation occurred only in the control fish and those stunted for 6 and 12 months. However, the onset of gonad maturity was delayed significantly (P<0.05) in males stunted for 12 months and in both groups of stunted female fish. The relative fecundity (44 000–56 000 eggs per kg body weight) and number of 3‐day‐old larvae produced per female (78 000–89 000) did not differ significantly among the three treatments (P>0.05), but production was somewhat lower in fish stunted for 12 months.     

鳙在冷藏和微冻贮藏下品质变化规律的研究

文章研究了鳙（Aristichthys nobilis）在不同贮藏温度下的品质变化规律。将经过前处理的鳙分别贮藏在4℃和-3℃中,通过测定其感官和理化指标,即总挥发性盐基氮（TVB—N）、硫代巴比妥酸（TBA）、鲜度K值、pH、汁液流失率和蒸煮损失率,评价不同温度对鳙品质的影响。结果显示,鳙分别在4℃贮藏至第10天和-3℃贮藏至第30天时失去感官食用品质。但K值在4℃贮藏至第6天和-3℃贮藏至第20天超过临界值。4℃下鳙的TVB—N显著高于-3℃。在整个贮藏过程中TBA均未超过2．00mg·kg-1。的限量值,说明TBA不适合单独用于评价鳙的品质变化。pH分别在4℃贮藏至第4天和-3℃贮藏至第10天达到最低值,分别为6．81和6．76。与4℃相比,-3℃下鳙的汁液流失率和蒸煮损失率较高,这可能与-3℃微冻条件下鳙肉组织冰晶生成导致持水力下降有关。综合K值和感官指标的变化,4℃和-3℃下鳙的货架期分别为6d和20d,且-3℃贮藏能明显延长鳙的货架期。     

鳙鱼不同组织基因组DNA提取方法的探讨

分别采用试剂盒和常规苯酚/氯仿抽提法提取新鲜的鳙鱼肌肉、肝脏、尾鳍以及用乙醇保存的3种组织基因组DNA,并对其进行综合分析。结果表明,对3种组织的新鲜样品2种方法均能提取高质量的DNA,而用乙醇保存的3种组织,DNA样品质量最好的是尾鳍,其次是肌肉,肝脏最差;总的来看,试剂盒法提取的DNA纯度较好,但是浓度低,而苯酚法得到的DNA浓度高,质量好,且相对成本低。综合比较,苯酚/氯仿抽提法提取乙醇保存的尾鳍组织基因组DNA是一种行之有效的方法,可以在鱼类分子研究中推广应用。     

稳定同位素技术分析不同养殖方式下鳙饵料的贡献率

应用碳氮稳定同位素技术分析了不同养殖方式(A组:施肥;B组:施肥+1/2投饲;C组:施肥+投饲;D组:投饲)围隔中鳙(Aristichthys nobilis)肌肉碳氮稳定同位素变化情况,及其可能摄食饵料的贡献率。结果表明,A组鳙肌肉的δ13C和δ15N值分别为(–23.8±0.1)‰和(10.8±0.4)‰,显著高于B组、C组和D组的值(P0.05),后三者之间值没有显著差异。围隔中的食物源有浮游动物、颗粒有机物和饲料,它们的δ13C和δ15N值均低于消费者鳙的同位素值。3种食物在不同养殖方式下的贡献率不同,浮游动物是A组鳙的主要食物来源,平均贡献率为(65.6±3.2)%,饲料是另3个组鳙的主要食物来源,其中B组饲料的贡献率相对较大,达82.1%。说明投饲鳙后,鳙对饲料能够较好地吸收利用,但在池塘中同时培育天然饵料能有效提高饲料的贡献率,减少投饲量,降低残饵的污染。本研究旨为实践养殖中合理投饲鳙的管理技术提供理论依据。     

鳙异源雌核发育子代的形态学研究

本研究在已成功利用鳙(Aristichthys nobilis)(♀)×兴国红鲤(Cyprinus carpio Var.Xingguo)(♂)远缘杂交诱导鳙异源雌核发育的基础上,测定了鳙异源雌核发育子代及其母本鳙和父本兴国红鲤3组实验鱼的7项可量性状,计算其框架系数,并采用单因素方差分析、判别分析、主成分分析和聚类分析对三组鱼框架系数的差异和距离进行了分析。结果显示3组鱼多项框架系数间均具显著差异,雌核发育子代较母本表现为体型更高,头更长。判别分析能将3组鱼明显判别分为3个区域,其中雌核发育子代和兴国红鲤的判别准确率均为100%,母本鳙群体判别准确率为94.4%,总判别准确率为97.9%。主成分分析结果显示,可提取2个主成分,其中主成分1能解释64.504%的变异,主成分2能解释21.292%的变异,二者合并能解释85.796%的变异。聚类分析表明雌核发育子代形态学可量性状指标更接近于母本鳙,与父本兴国红鲤距离较远。本研究结果表明雌核发育后,鳙异源雌核发育子代主要可量性状与双亲产生显著差异,但更接近于母本。     

Microsatellite–centromere mapping in bighead carp ( Aristichthys nobilis) using gynogenetic diploid families

Gene–centromere mapping using half‐tetrad analysis is a powerful tool for understanding chromosomal behaviour and determining the position of centromeres in relation to genes or markers in fish. In this study, eight gynogenetic diploid families induced by inhibiting of the second meiotic division were genotyped at 66 microsatellite loci for microsatellite–centromere (M‐C) mapping in bighead carp ( Aristichthys nobilis). The absence of paternal alleles verified the success of gynogenetic development in all gynogenetic families. All loci were consistent with Mendelian segregation in control families. The estimated recombination frequency (y) ranged from 0.057 to 0.875 with an average of 0.477 ± 0.222. Seventeen loci (25.76%) showed high M‐C recombination frequencies of over 0.667. M‐C distances ranged from 2.85 to 43.75 cM under the assumption of complete interference. Thus, these loci are distributed from the centromeres to the telomeres of their respective chromosomes, while mainly in the intermediate region. Information on centromere mapping could serve as a starting point to consolidate the genetic linkage groups in bighead carp.     

鳙鱼初孵鱼苗的运输试验

本文作者在１９９２－１９９３年进行了５次鳊鱼初孵鱼苗（出膜后１－２６小时）的运输试验，都获得成功。鳙鱼初孵鱼苗在运输路程１２０公里、运输时间３－４小时的情况下，运输成活率达９５以上。     

鳙对光色和光强的选择性试验

为研究船闸过鱼技术,利用自制的葛州坝船闸模型装置研究了鳙(Aristichthys nobilis)对红、白、蓝、绿、黄5种光色和光强的选择性。鳙在红、蓝、绿、黄、白色光5个区域中出现的次数比例分别是(68.01±7.09)%、(3.24±2.04)%、(5.70±4.28)%、(7.76±2.19)%和(15.30±2.83)%,鳙表现出偏好红色光。在红色光区域,鳙出现次数比例随时间先减小后增大,在第60 min时出现最小值(46.17%),整个试验过程变化显著,变化值28.16%;在白色光区域,鳙出现次数比先增大后减小,最大值达28.83%,变化值16.83%;黄、绿色光2个区域鳙出现次数比随时间无明显变化,变化值4.66%;蓝色光区域鳙出现次数比呈上下波动趋势,但总体平稳,变化值为11.35%。鳙对绿色光、黄色光表现出明显的负趋光性,对红色光表现出正趋光性。鳙平均出现次数比与时间的关系:红色光下,在强光区随时间呈下降趋势,在暗区变化趋势与强光区相反;绿色光下,只有暗区总体呈下降趋势但变化不显著,其他区域基本不变;蓝色光下,在所有区域均表现出上下波动、整体平稳的变化趋势;黄色光下,在暗区先增大后减小,亮区和强光区均呈先减小后增大趋势;白色光下,在暗区先减小后增大,而强光区先增大后减小,亮区无显著变化。     

鲢、鳙蛋白酶、淀粉酶的研究

运用酶动力学方法研究了鲢、鳙的蛋白酶和淀粉酶的活性分布。鲢、鳙的蛋白酶活性在肝胰脏中最强,脾脏中也较强,而在胆汁中未测出。该酶活性在肠粘膜的第Ⅱ段最大,第Ⅰ段向第Ⅱ段递增,第Ⅱ段向肠后端递减,但第Ⅴ段的该酶活性比前段要高些。鲢的淀粉酶活性分布规律与上述情况相似,但鳙的淀粉酶活性在肠粘膜各段中由前向后呈递减趋势,并以第Ⅰ段为最大。在相同的器官组织中,鳙蛋白酶活性高于鲢,但差异不显著（Ｐ＞０．０５）,而淀粉酶活性则相反。这两种鱼的蛋白酶活性适宜ｐＨ为８．０～８．５,淀粉酶活性在ｐＨ７．５时最适。在鲢的肠内容物中发现有纤维素酶活性,但在肠粘膜中未检出该酶。