小麦SSCP分子标记体系的优化

SSCP技术易受上样缓冲液、变性的时间及温度、电泳条件等诸多因素的影响。本研究对上样缓冲液、变性的时间及温度、电泳条件等影响因素进行了研究,结果显示:上样缓冲液中不添加甘油、用量为PCR产物体积的1.5～3倍、变性温度98℃、变性时间10～15min、电泳缓冲液为0.5×TBE,常温下恒功率80W(2.67W/cm)电泳2 h左右,单链DNA条带清晰,易于识别。     

16份石榴RAPD扩增产物的两种电泳方法检测及其序列特征

本实验以16个石榴品种为实验材料,筛选出10个重复性及多态性均较好的引物进行RAPD分析。分别采用琼脂糖凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳检测方法对PCR扩增结果进行检测并对其结果进行比较,结果显示,两种电泳方式均能得到较为清晰的扩增条带,且两种电泳方式获得的条带总数及多态性条带数均有所不同,琼脂糖凝胶电泳方法共检测出76条带,其中有43条为多态性谱带,多态性比率为56.4%;而在PAGE电泳方法共检测出123条谱带,多态性谱带数为87条,多态性比率为70.95%。PAGE电泳方法检测出的条带数约为琼脂糖凝胶电泳方法检测出条带数的1.5倍。基于两种电泳方法所得RAPD标记的多态性位点,利用NYSYS软件计算遗传相似系数,并构建遗传关系聚类图,分析结果显示,石榴遗传多样性丰富,两种电泳方法所得聚类结果大致相同,可以利用RAPD分子标记及两种电泳检测方法对不同数量的石榴进行分子水平的品种鉴定和遗传多样性的分析。同时通过对来自几个引物随机挑选的17个片段进行克隆,测序结果显示17个片段都是对应引物的RAPD扩增产物,其中有3条是编码蛋白的基因片段,表明了RAPD不仅扩增基因组上的非编码蛋白序列,同时也可以扩增编...     

苹果基因邻近未知序列的PCR扩增方法

利用已知基因序列设计3个巢式PCR引物p14、p15和p16,然后设计3'端为常见酶切位点、5'端为随机引物序列p17的9个酶切位点引物.用p14外引物与9个酶切位点引物进行第1轮PCR扩增,其中前5个反应采用较低的退火温度,目的是将酶切位点引物的5'端序列引入到PCR产物中,其余反应则以此PCR产物为模板采用较高的正常退火温度进行,目的是为了使整个酶切位点引物能稳定地结合到最初反应形成的产物上.为提高PCR产物的特异性和产量,用p15和p16引物分别与p17引物配对进行第2轮和第3轮PCR扩增,电泳检查发现PCR产物条带后进行纯化和测序.为保证序列的正确性,利用测得的DNA序列再设计新引物f3x,将f3x与p14(或p15)配对、直接用提取的DNA为模板进行PCR扩增和测序.利用此方法成功地获得了苹果FPPS基因邻近的启动子序列528bp和5'UTR序列142bp,并已在GenBank注册(登录号FJ263960),利用Blastn发现这是GenBank中首次发表苹果(Malus domestica Borkh.)法尼基焦磷酸合酶基因(FPPS)启动子序列.     

利用侧流核酸试纸条快速检测非洲猪瘟病毒

为满足基层普通实验室或养殖场等资源有限的实验室对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的检测需求,该研究开发了一种简单、快速、低成本的检测技术,可以用肉眼观察检测结果。研究将传统聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)与胶体金试纸条技术结合,开发一种低成本的侧流核酸测定试纸条(lateral flow nucleic acid assay,LFNAA)。该体系设计了独特的尾引物,避免了传统核酸试纸条的半抗原标记及抗体的使用。经过PCR扩增后产生一端带着单链寡核苷酸尾巴的双链DNA产物,能够与胶体金标记的寡核苷酸捕获探针结合,从而在试纸条上形成可以用肉眼观察的目标产物。该LFNAA试纸条能够在猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CFSV)、猪瘟病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪圆环病毒1型(Porcine circovirus 1,PCV1)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)、猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus virus,PPV)中特异的鉴定出ASFV的存在,其灵敏度与琼脂糖凝胶电泳的分析结果一致,均能达到103 copies/μL。因此,仅需要一台普通PCR仪,即可对ASFV进行快速灵敏的鉴定(<2 h),其低成本、操作简便的特点非常适合资源有限的实验室中非专业人员的操作。此外,该技术可进一步结合等温扩增技术,能够在食品安全和医学诊断中实现更快更简便的现场检测。     

睾丸特异蛋白Y基因(TSPY)对奶牛早期胚胎性别的鉴定

为方便性别鉴定方法在现场应用,利用睾丸特异蛋白基因(TSPY)建立了奶牛早期胚胎的非电泳性别鉴定方法.设计并合成了TSPY雄性特异和雌、雄共有基因引物,并利用已知性别的奶牛血液DNA为模板,初步建立了性别鉴定的PCR反应体系和非电泳的性别鉴定方法.灵敏度试验结果显示,雄性特异引物和共有基因引物对在模板10～60 Pg时,其性别鉴定的准确率为100%,提示TSPY基因具备鉴定胚胎性别的可能;同时采用非电泳法和环介导的等温扩增(LAMP)法鉴定6枚胚胎的性别,两者结果完全一致;用非电泳法检测TSPY基因鉴定了43枚胚胎的性别,对其中鉴定为雌性的21枚胚胎分别移植给自然发情后6～8天的受体,结果9头出生的犊牛均为母牛.结果表明.TSPY基因是一个很好的雄性特异标记,非电泳检测TSPY基因对奶牛早期胚胎性别的鉴定结果准确可靠.     

牛干扰素-tau基因的原核表达及生物功能鉴定

本试验采用PCR方法直接从牛早期胚胎细胞液中扩增牛干扰素-tau （bIFN-τ）基因（含信号肽基因序列）,并克隆到pGEM-T载体中,筛选阳性克隆,将含信号肽和不含信号肽的bIFN-τ 片断分别克隆到原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒,进行IPTG诱导表达,表达产物进行变性、复性和纯化,最后通过抗病毒活性检测和对体外培养的牛子宫内膜上皮细胞形态变化的影响,鉴定其生物学功能。结果表明,不提取胚胎基因组DNA,以胚胎的裂解液为模板,可以从少量（5枚）牛囊胚中直接扩增得到bIFN-τ基因,与Genbank报道的序列相比,核苷酸和氨基酸的同源性分别达99％和97％;SDS-PAGE电泳检测,不含信号肽的bIFN-τ基因与表达载体形成的重组质粒,在约20kD处出现特异性条带,与目标蛋白分子量一致;病毒抑制法测定rbIFN-τ的抗病毒活性单位为1×104IU/mg,在牛子宫内膜上皮细胞培养液中添加rbIFN-τ作用24 h后,细胞体积增大,细胞内出现明显的囊泡状结构,表明本研究获得的rbIFN-τ具有一定的生物活性。     

苹果基因邻近未知序列的PCR扩增与测序方法

本文提出的方法是首先利用已知基因序列设计三个巢式PCR引物p14、p15和p16,然后设计3’端为常见酶切位点、5’端为随机引物序列p17的9个酶切位点引物,用p14外引物与9个酶切位点引物进行第一轮PCR扩增,其中前5个反应的退火温度较低可以将酶切位点引物的5’端序列引入到PCR产物中,其余反应则以此PCR产物为模板采用较高的正常退火温度进行,退火温度较高是为了使整个酶切位点引物能稳定地结合到最初反应形成的产物上。为提高PCR产物的特异性和产量,用p15和p16引物分别与p17引物配对进行第二轮和第三轮PCR扩增,电泳检查发现PCR产物条带后进行纯化和测序。为保证序列的正确性,利用测得的DNA序列再设计新引物f3x与p14(或p15)配对,直接用提取的DNA为模板进行PCR扩增和测序。利用此方法成功地获得了苹果FPPS基因邻近的启动子序列528bp和5’UTR序列142bp,并已在GenBank注册（登录号FJ263960）。利用Blastn发现这是GenBank中首次发表苹果FPPS基因启动子序列。这说明用该方法获取基因邻近的未知序列是可行的。     

转基因水稻DNA样品浓度以及存放条件对PCR定性检测的影响

通过在不同模板DNA浓度(0.2～16 ng/μL)、不同转基因含量(0.05%～50%W/W)以及不同模板存放温度(22℃、4℃和-20℃)和存放时间(1、2、3周和1,3个月)条件下进行转基因水稻外源成分的定性PCR检测,发现当模板浓度在0.4 ng/μL以上时所有引物均能扩增出目标片段,对于转基因含量为1.0%和0.1%的混合样品,能稳定检测出转基因成分所需的DNA最低浓度分别为1和2～4 ng/μL.模板DNA的不同温度存放条件对检测没有明显影响,长时间存放后PCR扩增产物条带亮度有所减弱.     

产纤维素酶菌群的筛选及其酶学特性研究

从常年堆放的腐质豆秆中分离到1组产纤维素酶菌群MO,并在50℃、pH8.0条件下培养,90h时达到最高酶活,活性为1.3611IU。该酶最适反应温度为60℃,pH为7.0,在60℃以下和pH3~8范围内具有良好的热稳定性和pH稳定性。在最适反应条件下,该酶的最高活性可达2.13IU。通过生长动力学研究了菌群内部不同生长阶段pH、酶活和失重率的相互关系,并通过非变性电泳对酶谱进行初步研究,得到7条活性条带,说明MO中具有多种产酶菌株。     

聚丙烯酰胺凝胶电泳的一种辅助辨型方法

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是实验室常用的基本鉴定方法之一。但由于做胶方式以及各实验室仪器设备良莠不齐，经过一系列纷繁复杂的操作，电泳结果未必尽如人意。其中凝胶带型的判断就是一个较为困惑的问题，一般的聚丙烯酰胺胶跑出的条带总体上都有弧度，越是靠近凝胶两侧越是严重。在本实验中，我们设计了一种较为简单易行的方案，即将难以区分的条带样品做成混合样marker来辅助辨型，通过调整电压和凝胶浓度来达到区分条带的目的。我们用该方案可以将相差0～3bp大小的条带区分开来。