山新杨转Bt+蜘蛛杀虫肽基因的分析

以山新杨(Populus davidiana Dode × P.bollena Lauche)为受体材料,在筛选遗传转化条件的基础上,利用农杆菌介导叶盘转化法进行了Bt+蜘蛛杀虫肽基因转化研究.结果表明:在叶片转化时,卡那霉素的临界质量浓度为10 mg/L;生根筛选培养时卡那霉素的临界质量浓度为15 mg/L;利用质量浓度为600 mg/L的头孢噻肟钠脱菌,对叶片生长和不定芽形成影响不大.山新杨遗传转化的工程菌菌液浓度以0.1～0.2(OD600)为最佳,其叶片分化率为73%～77%、抗性芽率为20%～23%;浸染时间以2～5 min为宜,其叶片分化率和抗性芽率最高.在共培养基中加入200 μmol/L的乙酰丁香酮,其叶片分化率和抗性芽率分别比对照提高1.43倍和2.61倍.对转化植株的PCR检测结果呈阳性,初步证明外源基因Bt+蜘蛛杀虫肽导入并整合进了山新杨基因组.     

农杆菌介导的Vf基因转化柱型苹果的研究

以柱型苹果"鲁加6号"为试材,研究了根癌农杆菌介导的Vf基因转化条件.研究结果表明,该转化的优化条件为:共培养时间为3 d;延迟培养阶段头孢霉素浓度为200 mg/L,时间为6 d;选择培养阶段,芽分化过程卡那霉素浓度为15mg/L,生根过程卡那霉素浓度为10mg/L.PCR检测结果初步表明,外源Vf基因已导入转化植株基因组中.     

新疆伽师瓜高效再生系统建立及抗真菌病基因转化

成熟子叶切块作为外殖体,经过组织培养获得再生植株。以MS作为基本培养基,取3日龄子叶块外殖体,选用MS 6-BA1.5 mg/L IAA0.3 mg/L诱导丛生芽,最高诱导率可达78%。而且分化再生过程,6-BA的浓度逐渐降低。在生根培养时,用MS 0.3 mg/L NAA诱导生根率较高,根系粗壮。在建立甜瓜高效再生体系的基础上,用根癌农杆菌介导法将几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因导入新疆甜瓜中,经卡那霉素的抗性筛选,获得转化的再生植株。用PCR反应及Southern-blot检测,进一步研究了再生植株的基因整合与表达情况。经PCR扩增反应和Southern-blot检测均得到了与阳性对照一致的特异性带,可初步证明外源基因已整合到了甜瓜基因组中。     

多抗转基因马铃薯植株的获得及农杆菌介导试管薯遗传转化体系优化

以马铃薯品种陇薯11号试管薯为受体材料，通过农杆菌介导法，将PVX、PVS、PVY和PLRV 4种病毒CP融合基因导入马铃薯，并对影响遗传转化的因素进行了优化。结果表明，薯片分化和生根阶段的选择压分别为Kan 50、75 mg/L，薯片分化和生根阶段有效抑菌浓度分别为Cb 500、200 mg/L，农杆菌活化时间为4.5 h、侵染时间为7 min、共培养时间为2 d时利于遗传转化。通过该体系将4种病毒CP融合基因导入马铃薯，获得了具卡那霉素抗性的转化植株，经PCR检测，外源基因已导入马铃薯基因组中。     

农杆菌介导的紫穗槐茎段愈伤组织遗传转化研究

采用农杆菌介导法对紫穗槐茎段诱导的愈伤组织进行遗传转化研究。确定了卡那霉素临界耐受浓度为40mg/L。菌液浓度与侵染时间的正交试验结果表明:侵染菌液OD600为0.8、侵染时间为30min时转化效率最高,达17.95%。GUS染色检测分析表明:含pBI121-GUS质粒DNA农杆菌侵染转化的愈伤组织其抗性不定芽和再生植株根和叶均呈蓝色。转化植株叶PCR检测结果表明外源GUS基因已整合到紫穗槐基因组中。以上结果表明建立了以茎段诱导愈伤组织为转化受体、农杆菌介导的紫穗槐高效遗传转化体系。为了验证其可重复性,又进行了pBI121-GFP基因的转化,T0代再生植株PCR检测整合率达85%,在488nm蓝光源激发下转化株的顶芽产生绿色荧光,说明转入的基因在35S启动子下过量表达。此遗传转化体系可应用于转基因育种。     

野生白芨再生体系的建立及抗性筛选

建立白芨的再生体系和优化抗性筛选的最佳条件,为野生白芨高效遗传转化体系的建立奠定基础。以野生白芨种子为外植体,研究野生白芨种子在萌发、愈伤组织诱导、丛生芽分化和增殖以及不定根诱导的最佳培养基,并利用梯度筛选出其对卡那霉素(Kan)和氨苄青霉素(Amp)的抗性。种子萌发最佳培养基为1/2MS+0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+100 g/L马铃薯;不定芽分化最佳培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+8 mg/L硝酸银+50 g/L马铃薯,诱导率高达95%;诱导生根最佳培养基为1/2MS+0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+100g/L马铃薯。100 mg/L Kan和100 mg/L Amp为野生白芨遗传转化的最佳筛选压;培养过程中添加外源有机物可以有效地促进愈伤组织和不定芽的分化与增殖。建立了野生白芨种子的再生体系,发现了野生白芨种子的第3条发育途径——愈伤组织分化途径,并筛选出了适宜于野生白芨遗传转化体系的Kan和Amp筛选压。     

黄瓜高效遗传转化体系的建立及银杏抗菌肽转化

建立黄瓜的高效再生和遗传转化体系,并进行银杏抗菌肽GK-2的遗传转化。研究结果表明,MS6(MS+0.005 mg/L TDZ+0.20 mg/L IAA)培养基适于黄瓜愈伤组织的形成和不定芽分化,7 d即可分化出不定芽,出愈率和分化率分别高达100%和86.67%。进一步用带有银杏抗菌肽GK-2目的基因的农杆菌转化黄瓜,筛选出了侵染时间20 min、共培养时间3 d以及卡那霉素抗性筛选质量浓度为100 mg/L的最佳转化体系。利用该体系转化黄瓜,获得的转化植株阳性率高达17.9%,并对黄瓜枯萎病表现出明显的抗性。     

农杆菌介导的薹菜遗传转化体系研究

以薹菜子叶-子叶柄为外植体,研究了根癌农杆菌介导的遗传转化技术。用含GUS和NPTⅡ基因的农杆菌侵染子叶-子叶柄,获得了具有卡那霉素抗性的再生植株。再生植株经GUS组织染色,证实外源基因转化到植物基因组中。卡那霉素敏感性测定结果表明,当培养基中含卡那霉素（Km）15 mg/L时,非转化再生植株全部白化。转基因抗性芽筛选的适宜的卡那霉素浓度为10 mg/L。     

不同抗生素及除草剂Basta对大葱愈伤组织分化的影响

为了建立优良的大葱遗传转化体系,以卡那霉素(Kana)、潮霉素(Hyg)以及除草剂Basta(Bar基因)作为抗性选择剂,研究其对大葱愈伤组织分化的影响。结果表明:大葱愈伤组织分化对Kana不敏感,Kana不适宜作为大葱遗传转化中抗性选择标记,Hyg适宜的选择浓度为50 mg/L,除草剂Basta适宜的选择浓度为0. 10 mg/L。     

优选盆栽小菊高效再生及转化体系的建立

为筛选最适盆栽小菊品种,建立再生转化体系,以11个盆栽小菊品种无菌苗叶片为外植体,比较不同植物生长调节剂配比和抗生素对叶片愈伤组织诱导、不定芽分化及生根等过程的影响。结果表明,11个品种中再生率最高的为微风深红,其最适分化培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA,再生率为95.0%;叶片分化对卡那霉素和潮霉素的抗性选择压分别为15、10 mg/L;对植株生根的抗性选择压分别为10、8 mg/L;羧苄青霉素抑菌浓度最适范围为200～400 mg/L。本研究建立了盆栽小菊叶片外植体的高效再生及转化体系,为今后菊花的转基因工作奠定良好的基础。     

胡萝卜遗传转化体系的建立

以新黑田五寸胡萝卜下胚轴为外植体,研究对胡萝卜抗性植株的影响因素及目的基因的整合情况,建立了较为完善的转化体系。实验结果表明:以胡萝卜下胚轴为材料,用苗龄7d,共培养2d,浸染15min的体系,Kan抗性芽的分化频率可达52%。获得抗性愈伤培养基:B5+0.1mg/L2,4-D+0.2mg/LKT+75mg/LKan+500mg/LCef,抗性芽诱导培养基:B5+100mg/LKan+500mg/LCef;抗性植株生根培养基:B5+0.1mg/LIBA+75mg/LKan+300mg/L:Cef;对转基因植株进行了PCR分子学检测,初步证明外源基因已整合到胡萝卜基因组中。     

大豆子叶节对卡那霉素的敏感性研究

[目的]研究大豆子叶节对卡那霉素的敏感性,以期为大豆的遗传转化和抗性筛选提供试验依据。[方法]选用3个不同基因型大豆为试验材料,以黄化率和分化率为指标,研究了不同浓度的卡那霉素对大豆子叶节分化和丛生芽生根的影响。[结果]不同基因型大豆对卡那霉素的敏感性不同,子叶节分化的卡那霉素临界筛选浓度为:垦农18为40 mg/L、绥农14和垦农4为60 mg/L;丛生芽生根的卡那霉素临界筛选浓度为:垦农18为15 mg/L、绥农14和垦农4为20 mg/L。[结论]该研究结果为大豆的遗传转化和抗性筛选奠定了基础。     

农杆菌介导的花魔芋遗传转化体系的优化

[目的]探讨魔芋愈伤组织培养基、不同转化条件(菌液浓度、侵染时间、预培养时间及共培养时间)及转化植株的筛选条件(抗生素浓度和乙酰丁香酮(AS)浓度)等因素对转化效率的影响。[方法]采用卡那霉素抗性基因为选择标记,对农杆菌介导的花魔芋遗传转化体系进行优化。[结果]在预培养2 d,用OD600为0.6的菌液侵染30 min、共培养3 d,卡那霉素100 mg/L,羧苄青霉素250 mg/L,AS浓度100μmol/L的条件下能有效提高转化效率。再生花魔芋植株经GUS染色及PCR检测,结果表明外源目的基因已经整合到花魔芋基因组中。[结论]为魔芋抗病品种的转基因培育,丰富其种质资源,寻找抗病新途径提供理论依据和试验基础。     

抗蚜虫转基因枸杞的初步研究

选用对蚜虫具有明显抗性的基因－雪花莲外源凝集素酶基因，用宁杞1号的幼叶、幼茎、幼根与携带质粒的农杆菌共培养后，将其转移到含有6－BA0．5MG/l NAA 1mg/L 60mg/L卡那霉素的MS培养基中诱导愈伤组织，10－15d后将诱导产生的愈伤组织转移到含有6－BA0．5mg/L NAA0.01mg/L 60mg/L卡那霉素的MS分化培养基中，培养20－30d，在侵染外植体的愈伤组织上出现小芽，当芽长到1．5－2cm时将其切下转入6－BA0．01mg/L NAA0.2mg/L 30mg/L卡那霉素的MS生根培养基中进一步筛选并使转化体生根，获得完整的抗蚜虫转基因枸杞。将获得的完整植株进行PCR分析检测，发现雪花莲外源凝集素酶基因已经整合到枸杞植株染色体上，片段大约在500Pb，其转化率为65．1％。     

本生烟草组培再生及遗传转化的研究

[目的]获得本生烟草转胰高血糖素样肽-1基因植株。[方法]以本生烟草无菌苗叶片为外植体材料,建立本生烟草再生系统,通过农杆菌叶盘法浸染进行遗传转化,获得本生烟草转胰高血糖素样肽-1基因植株。[结果]通过多重比对和重复,确定本生烟草叶片最适分化培养基为MS＋1.5mg/L6-BA＋0.1mg/LNAA,生根培养基为MS＋0.1mg/LIBA;经由卡那霉素浓度梯度试验,确定选择压力为5mg/L卡那霉素;对经卡那霉素筛选获得的抗性芽进行GUS组织化学检测,获得阳性信号。[结论]初步证实外源基因胰高血糖素样肽-1已整合到本生烟草基因组中。     

番茄遗传转化体系的建立及LC和GFP标记基因的表达

本研究以小型番茄(miniature Lycopersicon esculentum Mill.)Micro-Tom为试材,建立其以子叶、下胚轴为外植体的高效、稳定再生体系及遗传转化体系。结果表明,以子叶、下胚轴为外植体时,诱导愈伤组织和芽分化的适宜培养基均为MS 6-BA2.0mg/L IAA0.2mg/L,芽分化率均可高达92%。两种外植体适宜的生根培养基均为MS NAA0.1mg/L。同时,通过根癌农杆菌介导法,建立了Micro-Tom的遗传转化体系。而乙酰丁香酮能大大提高根癌农杆菌转化番茄的效率,当AS=180μm/L时,芽分化率为52.8%;OD600=0.14是转化的最佳菌液浓度;子叶外植体与农杆菌共培养后,经过诱导,根的再生,获得了抗性苗,利用绿色荧光蛋白(GFP)检测和整株表型为紫色(Lc)基因的表达,初步证明外源基因已经整合到Micro-Tom中,为番茄激活标签体系的建立奠定了基础。     

微弹轰击小麦幼胚愈伤组织的影响因素研究

【目的】优化小麦基因枪转化技术体系,为提高小麦基因枪转化效率提供参考。【方法】以小偃22为材料,采用基因枪法分析小麦幼胚愈伤组织诱导时间、微弹轰击金粉用量及筛选分化培养基类型对基因枪遗传转化频率的影响,并对转化植株进行了检测。【结果】在相同条件下,小麦幼胚经过9d的愈伤组织诱导时再生植株率最高,达到4.24%;同一条件下,金粉用量为60μg/枪的再生植株率最高,达到3.90%;使用1/2MS培养基添加NAA1.0mg/L和KT 1.0mg/L进行转化细胞筛选与分化的效果最好,再生植株率为3.72%;对转化抗性再生植株的特异PCR检测表明,目的基因已整合到小麦染色体组中。【结论】小麦幼胚通过9d的愈伤组织诱导,基因枪轰击金粉用量为60μg/枪,使用筛选分化培养基1/2MS+KT 1.0mg/L+NAA 1.0mg/L+双丙氨膦2.0mg/L+蔗糖30g/L+Ag 5.0g/L进行转化细胞的筛选与分化,可获得较高的抗性再生植株率。     

植物抗病基因snc1在超级杂交稻父本0293中的遗传转化

以超级杂交稻父本0293为材料,利用农杆菌介导基因转化法研究植物抗病基因snc1在超级杂交稻父本中的遗传转化。结果表明:0293成熟胚愈伤组织的最适诱导培养基为NMB诱导培养基,2,4–D和6–BA的最适质量浓度分别为3.0和0.2 mg/L;以LB液体培养的农杆菌转化能力最强,抽真空转化方式获得的抗性愈伤率较高,最适共培养时间为2 d;麦芽糖为抗性愈伤组织分化的最适碳源,NMB+KT 0.4 mg/L+6–BA 2.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+IAA 0.5 mg/L为较适合的分化培养基;通过优化农杆菌介导的遗传转化条件,共获得6株含目的基因snc1的转化植株。     

大叶女贞抗寒基因AmEBP1高效转化体系的研究

本研究以大叶女贞为受体材料,利用农杆菌浸染方法对沙冬青抗寒基因AmEBP1进行转化试验,通过对不同的受体材料浸染部位、菌液浓度和浸染时间对转化材料的死亡率%、分化率%、分化芽数(个)、芽苗长度(cm)以及芽苗颜色影响进行了分析,结果表明:转化材料为茎段,菌液浓度稀释为50%,浸染时间15 min;其中浸染部位是影响基因高效转化的最主要因素,菌液浓度和浸染时间的作用次之;方差分析进一步发现,浸染部位的三个水平对于外源基因在植物体内的转化显著差异,因此选择合适的浸染部位、适宜的菌液浓度和浸染时间能提高基因转化效率;经在50 mg/L浓度的卡那霉素培养基筛选培养,获得一批抗性植株,经PCR检测获得5株转化株系.     

甘菊遗传转化再生体系的建立

[目的] 建立高效稳定的甘菊再生体系,并确定卡那霉素和草丁膦的筛选压。[方法] 以甘菊无菌苗叶片为外植体,通过添加不同浓度的NAA和6-BA建立了甘菊遗传转化再生体系。[结果] 在5种芽诱导培养基中,MS3（MS＋NAA 0.1mg/L＋6-BA0.1mg/L）的再生频率最高,可达98%,其不定芽生根率可达100%。培养35d后,添加5和10mg/L卡那霉素的培养基上甘菊再生率为11.3%和10%,添加15和20mg/L卡那霉素的培养基上没有芽的分化;添加0.5mg/L草丁膦的培养基上甘菊再生率为8.7%,添加1mg/L草丁膦的培养基上没有芽的再生,添加1.5和2.0mg/L草丁膦的培养基上没有芽的分化。卡那霉素和草丁膦在甘菊遗传转化中的筛选浓度分别为8.0和0.8 mg/L。[结论] 该研究为进行甘菊转基因试验打下了基础。