107速生杨遗传转化中最适培养基的筛选

以107速生杨为试材,以氯化钠(NaCl)和卡那霉素(Kan)作为筛选指标进行遗传转化中最适培养基的筛选研究。对比转基因材料和对照材料的分化率和长势,并对转基因材料进行PCR检测,最终确定最适于遗传转化筛选的培养基。结果为氯化钠(NaCl)不能用作筛选指标,卡那霉素是最适筛选指标,我们得到的最适筛选培养基是加入100mg/L卡那霉素的分化培养基。     

亚洲百合遗传转化受体系统的建立

以亚洲百合"精粹"(Lilium Asiatic 'Elite')的鳞片、再生形成的叶片和鳞片叶为外植体,进行了不定芽的诱导分化、试管苗小鳞茎诱导、卡那霉素抗性筛选等研究,建立了亚洲百合遗传转化受体系统.结果表明:鳞片诱导最佳分化培养基为MS 6-BA 2.0 mg/L NAA 0.2 mg/L,试管苗小鳞茎诱导培养基为MS IBA 0.5 mg/L 70 g/L蔗糖,试管苗叶片分化培养基为MS TDZ 1.0 mg/L NAA 0.2 mg/L,试管苗鳞片叶分化培养基为MS 6-BA 2.0 mg/L 2,4-D 0.1 mg/L.抗生素敏感性试验表明,百合叶片的卡那霉素选择压为80 mg/L,鳞片叶为115 mg/L.     

小麦光腥黑粉菌转化子最适固体培养基的筛选

为了筛选小麦光腥黑粉菌转化子最适培养基, 以提高小麦光腥黑粉菌转化子生长速度, 选取了3个菌落形态不同的转化子(ZHZ-1, ZHZ-2, ZHZ-3)进行培养试验?用6 mm打孔器打取菌饼, 将菌饼置于9种培养基上16℃避光培养?观察?测量小麦光腥黑粉菌转化子的菌丝生长情况?菌落直径等主要指标, 结果表明, 9种培养基中, 3种转化子都是在完全培养基(complete medium, CM)上生长状况最好, 菌丝生长速度最快?ZHZ-1转化子在CM培养基上菌落圆形, 有褶皱, 产生大量白色菌丝, 生长速度快?ZHZ-2转化子菌落圆形, 产生大量白色菌丝, 生长速度快?ZHZ-3转化子菌落云纹状, 有褶皱, 产生大量白色菌丝, 生长速度快?     

小麦成熟胚培养条件的优化及高效基因型筛选

为了提高小麦成熟胚的分化率、研究小麦成熟胚的组培特性及筛选出高效再生的小麦品种,选取了36个小麦品种为供试材料,研究了不同愈伤诱导时间对成熟胚组培特性的影响、在分化培养基中添加不同浓度KT对成熟胚分化的影响,以及愈伤组织进行不同时间干燥处理后对愈伤分化的影响;并对30个参试品种中具有高效再生率的基因型进行了筛选。结果表明,出愈率随诱导时间呈正向变化,但分化率则表现先增加后降低的变化趋势,且在12 d左右可以达到较为理想的分化效果;当KT浓度为0．5 mg·L-1时分化效果最好;转入分化培养基之前对愈伤进行8～12 h干燥处理可显著提高分化率;在供试的30个地方品种中,有15个小麦品种的分化率达到30％以上,其中泰山1389、淮麦20及泛麦5号的分化率依次达到41．5％、41．2％及39．6％。因此,在小麦成熟胚培养过程中愈伤诱导12 d,转接至分化培养基前干燥处理8～12 h及分化培养基中添加0．5 mg·L-1 KT可以达到较为理想的愈伤分化数。本研究从不同地方品种中筛选出的一些高效再生的小麦品种可以作为遗传转化的受体材料。     

紫花苜蓿下胚轴愈伤组织诱导及再生植株的研究

以培养4～5d的紫花苜蓿无菌苗的下胚轴为材料,改良SH(SH大量元素+MS微量元素+MS铁盐+UM有机)+水解酪蛋白(CH)2000 mg/L为基本培养基,对紫花苜蓿愈伤组织诱导和植株再生进行了研究。愈伤组织诱导和继代培养基分别为2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L及2,4-D 0.05 mg/L+BA0.5 mg/L+蔗糖30 g/L,将获得的愈伤组织转入正交设计的培养基上进行筛选,得到了愈伤组织分化率相对较高的培养基配方:基本培养基+KT 0.4 mg/L+蔗糖20 g/L,其分化率为73.0%。获得的再生芽在生根培养基上(1/2MSO)培养约10d便能获得具有根和叶的再生植株。本试验结果为下一步将来自蓝藻的Na⁺/H⁺ an-tiporter基因转入苜蓿,获得转基因耐盐苜蓿奠定了基础。     

马铃薯转GhABF2转录因子苗耐盐性研究

以转GhABF2转录因子马铃薯试管苗为材料,进行苗期耐盐性研究,以期了解该作物对逆境的适应性。实验结果表明:在不同浓度NaCl胁迫条件下,转GhABF2基因株系材料(T1、T2)与对照未转基因材料(WT)植株的干鲜重、生理生化指标的变化趋势基本一致,就各性状值的变化来看,转基因植株表现出了明显的抗逆性。随着NaCl胁迫浓度的增加,与对照非转基因植物WT相比,转GhABF2基因材料T1、T2的生物量显著增加;WT、T1、T2的叶绿素含量均随着盐浓度的增加而降低;可溶性糖、丙二醛、脯氨酸,SOD酶活性、POD酶活性均随着盐胁迫浓度的增加而升高;可溶性蛋白含量随着胁迫程度的加重略有下降,但变化趋势不显著。从植株的生长状态、生理生化等性状指标方面来看,转基因植株比对照非转基因植株表现出了更强的抗逆性。     

解淀粉芽胞杆菌DP03-4发酵条件研究

前期在苹果心室拮抗菌中筛选出一株解淀粉芽胞杆菌DP03-4,该菌株在平板试验中对多种苹果病原菌表现明显拮抗作用,田间也表现较好的防治效果。本试验以菌体生长量和抑菌圈大小为指标,应用多因素正交试验和发酵条件单因素筛选对该菌株的培养基成分配比及培养条件进行优化。得到最适培养基配方为酵母浸粉 15 g,NaCl 2.5 g,葡萄糖10 g,H₂O 1000 mL;最适的培养条件为温度30℃~35℃,摇瓶装液量75 mL/250 mL,摇床转速210 r/min,初始pH值6,接种量4%。发酵条件优化后的发酵液较优化前LB发酵液菌体量提高43.7%,抑菌活性提高51.4%。为该菌株的进一步开发利用提供了基础数据。     

利用RNA介导的抗病性获得高度抗马铃薯Y病毒的转基因烟草

 以马铃薯Y病毒坏死株系(PVY^N)的RNA为模板,应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,扩增出长度为801 bp的非翻译的马铃薯Y病毒外壳蛋白基因。将扩增的片段克隆到pBSK的BamHI和KpnI之间并进行了序列测定。用BamHI和KpnI从重组克隆载体上切下该基因并插入到质粒pROKII内得到植物表达载体pPVYCP。通过根癌农杆菌(LBA4404)介导的方法转化烟草NC89,经卡那霉素抗性筛选、PCR和Southern blot检测,获得82株转基因植株。Northern blot和Western blot分析表明,转基因植株只在RNA水平上得到了表达。抗病性试验表明转基因植株之间抗性水平存在着差异,其中有7株是对PVY^N高度抗病性的植株。转基因植株抗病特异性试验初步表明,对PVY^N表现高度抗病的植株对PVY^O也具有高度抗病性。     

燕山地区叶底珠萌发期耐盐性综合评价

对河北燕山地区30份叶底珠材料种子萌发期进行耐盐性综合评价，以期为叶底珠的耐盐筛选提供理论依据，同时为盐渍化地区生态修复及园林植物的选择提供参考。在人工气候箱内用200mmol/L NaCl溶液进行盐胁迫，以蒸馏水培养为对照，对30份叶底珠材料种子萌发期的相对发芽率、相对发芽势、相对发芽指数、相对盐害率、相对胚根长、相对鲜重进行测定与计算，通过隶属函数分析和聚类分析进行综合评价，筛选耐盐材料。结果表明：盐胁迫下叶底珠种子的发芽率、发芽势、发芽指数、胚根长、鲜重等指标均受到不同程度的抑制，30份叶底珠材料种子萌发期的耐盐性有明显差异；在6个鉴定指标中，相对盐害率、发芽率与叶底珠萌发期的耐盐性关系最为密切；根据隶属函数分析和聚类分析，可将燕山地区30份叶底珠材料划分为高度耐盐型(6个)、耐盐型(5个)、中度耐盐型(3个)、盐敏感型(8个)和高敏感型(8个)5类。200mmol/L NaCl溶液可作为叶底珠种子萌发期耐盐性鉴定的适宜盐浓度；发芽率可作为叶底珠种子萌发期耐盐性快速鉴定或初步筛选的鉴定指标；隶属函数法对叶底珠种子萌发期耐盐性综合评价具有较好的应用价值。     

链霉菌S10遗传操作系统的优化

链霉菌StreptomycespratensisS10是分离自番茄叶霉病异常菌落上的一株生防菌,具有良好的生防应用价值。建立高效稳定的遗传操作系统对该生防菌进行基因定向改造、提高基因表达水平及深入研究其生防分子机制具有重要意义。本试验以具有安普霉素抗性基因标记的温敏型质粒pKC1139为载体,大肠杆菌Escherichia coli ET12567(pUZ8002)为供体菌,链霉菌S10为受体菌,通过接合转移的方法对其遗传操作系统进行优化。结果表明,选择高氏一号培养基为链霉菌S10接合转移的最适培养基,孢子50℃热激10 min,最适供受体比为1:100,安普霉素添加的最适浓度为25μg/mL,接合转移16 h后覆盖抗生素,添加MgCl2终浓度为15 mmol/L时接合转移效率最高,达到8.3×10-7。利用该遗传转化系统成功得到了一个调控基因的双交换突变株。获得链霉菌S10稳定高效的遗传操作系统,为进一步构建高产菌株和研究抑菌活性物质合成机理奠定了基础。     

薰衣草基因转化直接分化受体系统的建立

以法国孟士德薰衣草(Lavandula angustifolia cv. Munstead)的下胚轴和子叶为研究材料,通过高频再生系统的建立和抗生素敏感性实验,建立了薰衣草基因转化的直接分化受体系统.结果表明:下胚轴的不定芽分化能力比子叶更强,在IAA 0.1 mg·L-1 6-BA 1.0 mg·L-1条件下,10 d苗龄的下胚轴的出愈率和不定芽分化率分别为96.7%和36.7%;所得组培苗在1/2 MS基本培养基上生根率可达95%以上;确定了下胚轴适宜的抗生素筛选浓度,潮霉素的筛选浓度为10 mg·L-1,头孢霉素浓度为200 mg·L-1时即可有效抑制农杆菌的生长,同时又不会对薰衣草不定芽分化产生明显的伤害作用.     

双价多肽抗生素转基因马铃薯的培育

为了提高马铃薯对细菌性病害的抗性,以来源于膜翅目昆虫的新多肽抗生素Apidaecin为目的基因,以多肽抗生素Shiva-Ⅰ为对照,对多肽抗生素在马铃薯抗青枯病基因工程中的应用进行了研究。采用农杆菌介导的方法,用含有Apidaecin Shiva-Ⅰ双价基因的植物表达载体pBinPRSIHbI对马铃薯栽培品种米拉、中-5-1、Favorata和尼勒克进行了遗传转化试验,共获得卡那抗性再生植株31个,获得了最佳的植株再生分化体系和遗传转化条件。PCR检测及RT-PCR分析表明,目的基因已成功地整合到转基因植株的染色体上并在转基因马铃薯中进行了转录。     

艾丁湖极端嗜碱菌碱性纤维素酶的初步研究

从吐鲁番艾丁湖地区64种土样中筛选到一株能产细胞外嗜碱性纤维素酶的极端嗜碱菌A04,细胞杆状,革兰氏染色阴性.该菌在含CMC培养基中产生细胞外纤维素酶,产酶的最适pH和NaCl浓度分别为9.5和0.5%.酶反应最适温度为40℃,在pH9.5条件下产生较高的碱性纤维素酶.     

转甜菜碱醛脱氢酶基因油菜的获得及其耐盐性研究

以9个甘蓝型油菜(Brassica nupas L.)材料为受体,分别以其子叶和下胚轴为外植体,利用农杆菌将来自山菠菜的BADH基因导入甘蓝型油菜,研究了转化植株的抗盐性.结果表明,依据对农杆菌侵染的反应,参试品种可划分为三种类型:抗性类型(resistant type,R);超敏感类型(supper susceptive type,SS)和中间类型(middle type,M).R型外植体切口易发生过敏反应导致失去再生能力;SS型外植体极易受农杆菌快速增殖影响,最终导致整体褐化死亡;只有M型外植体还保留部分再生能力,可产生少量不定芽.通过改进培养方式可提高外植体在农杆菌胁迫下的芽发生频率,在无菌滤纸上进行共培养,不仅能降低"玻璃化"现象,还能延长共培养时间,为外植体细胞的再分化提供了时间保障.分化培养基中加入3～6 mg/L AgNO3可减轻外植体褐化程度,提高不定芽分化率.PCR分析和BADH活性检测发现,有部分转化体BADH酶活性明显高于对照,表明转基因植株在盐胁迫下外源BADH基因已表达,转基因植株能够在0.5%NaCl培养基上正常生长,而对照在相同的培养基上生长缓慢且生根困难.     

转CarNAC1基因可提高棉花的抗旱性

以15份稳定遗传的转CarNAC1基因棉花及受体材料K62进行田间和室内试验,通过加权隶属函数法、主成分分析法及聚类分析等方法比较棉花光合指标、农艺性状、产量性状、纤维品质和生理指标的变化情况。结果表明:干旱胁迫后,转基因棉花品系气孔导度下降趋势及净光合速率显著高于受体材料K62;转基因棉花品系平均单铃重高于受体材料0.363~0.657 g;除丙二醛含量为转基因棉花品系低于受体材料K62外,转基因棉花品系的脯氨酸、可溶性糖含量及过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶活力均高于受体材料。基于农艺性状和产量性状指标主成分分析结果,将16个品系的9个指标综合为2个相互独立的综合指标,结合D值及聚类分析结果筛选出干旱胁迫后仍能保持相对较高产量的品系:ZK62-10、ZK62-6、ZK62-1。基于纤维品质指标主成分分析结果,将16个品系的7个指标综合为3个相互独立的综合指标,结合D值及聚类分析结果筛选出干旱胁迫后仍能保持相对较高纤维品质水平的品系:ZK62-6、ZK62-12、ZK62-15。可以得出以下结论:干旱胁迫下,转CarNAC1基因棉花品系的产量及品质均优于受体材料K62;转CarNAC1基因棉花品系可能通过降低气孔导度、增强渗透条件等方法提高棉花抗旱能力;筛选出综合抗旱能力最优的棉花品系ZK62-6。     

一种农杆菌介导稻瘟病菌的遗传转化

以农杆菌C58C1及携带潮霉素抗性的质粒pBIG2RHPH2为介导,以广泛不致病的野生型稻瘟病菌CY2为出发菌株,开展稻瘟病菌T-DNA插入转化条件的研究。农杆菌OD600为0.1条件下,乙酰丁香酮(AS)200μmol/L,用IM培养基(pH5.2)共培养。结果表明,在潮霉素、头孢噻肟钠和壮观霉素为200μg/mL,2mm滤纸条筛选培养,转化效率最高,平均可获得329.0个转化子/1×104个孢子。通过对转化子的继代稳定性和PCR检测,证明转化子均获得了T-DNA插入片段,且能稳定遗传。采用接种法,在不同遗传背景的44个抗稻瘟病的水稻近等基因系接种8000个转化子,获得20个致病突变体。     

烟草青枯病拮抗细菌芽孢杆菌AR03菌株摇瓶发酵条件的筛选

本实验室从土壤中筛选出一株对烟草青枯病有较强防治作用的芽孢杆菌AR03菌株。通过正交试验,对其发酵培养基进行优化,并且对发酵条件(起始pH值、装液量、接种量、温度、转速、最佳发酵时间)进行了研究。结果表明,不同的发酵培养基组分对菌体收获重量的影响相差较大,其中牛肉膏影响最大。本试验获得的最佳摇瓶发酵配方为(质量分数):牛肉膏0.9%、蛋白胨1.5%、葡萄糖1%、NaCl 0.5%。最适发酵条件为:发酵起始pH值为7.3,300ml的三角瓶装瓶量为60ml,接种量为8%,温度为31℃,转速为140r/min,发酵时间为36h。     

解淀粉芽胞杆菌Lx-11生物学特性研究

本文从分泌代谢物种类、最佳碳源、氮源、无机盐、微量元素、pH和温度方面研究了前期筛选获得的对水稻细菌性条斑病有良好防效的解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens Lx-11的生物学特性。试验结果表明,解淀粉芽胞杆菌Lx-11可产生蛋白酶、纤维素酶和嗜铁素;最适生长温度为28℃、最适pH为7.0、最佳碳源为蔗糖,最佳氮源为胰蛋白胨,微量元素甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)、VB2、VB6和肌醇均能促进Lx-11的生长,其中Gly促进作用明显;无机盐KH2PO3和NaCl能促进Lx-11的生长;生防菌Lx-11在32 h前处于对数生长期,32 h之后,菌体生长基本达到稳定。正交试验所得最优培养基组合为酵母膏1 g/L、蔗糖5 g/L、胰蛋白胨6 g/L、甘氨酸0.01 g/L和氯化钠0.15 g/L。     

莲腐败病菌遗传转化体系的构建

由共享镰刀菌Fusarium commune引起的莲腐败病是我国莲生产上的主要病害之一。本研究以强致病力菌株FCN23为供试菌株,通过PEG介导的遗传转化法研究了菌龄、酶解时间和渗透压稳定剂等对原生质体制备的影响。结果表明,分生孢子在YPD液体培养基培养24 h获得新鲜菌丝,在酶解时间为2.5 h,渗透压稳定剂为0.7 mol/L NaCl溶液时原生质体制备效率最高。进而将遗传霉素的抗性基因和绿色荧光蛋白基因转入莲腐败病菌原生质体中,获得了稳定表达的转化子,能够稳定遗传gfp基因,说明莲腐败病菌的遗传转化体系构建成功。该体系的建立为莲腐败病菌的侵染过程及基因功能研究奠定了基础。     

青海省樱桃叶斑病菌生物学特性及室内药剂毒力测定

为明确青海省樱桃叶斑病菌链格孢Alternaria alternata的生物学特性及筛选出对其防效最佳的药剂,本研究采用菌丝生长速率法和孢子计数法研究了不同培养条件对该病原菌菌丝生长和产孢量的影响,并用菌丝生长抑制率法对9种杀菌剂进行室内毒力测定。结果表明,菌丝生长和产孢的最适培养基分别为马铃薯蔗糖琼脂(PSA)培养基和马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基,最适温度为25℃, 最适氮源为蛋白胨,最适碳源分别为肌醇和乳糖,最适pH分别为6~8和6~7,24 h持续黑暗处理更有利于菌丝生长和产孢。9种化学药剂对病原菌均有不同程度的抑制作用,其中250 g/L嘧菌酯悬浮剂抑菌效果最好,EC50为1.258 mg/L。该研究结果可为青海省樱桃叶斑病的防治提供理论依据。