鸡IL—1βcDNA片段的克隆及序列分析

本文以鸡外周血单个核细胞总ＲＮＡ为模板,据已报道的８种哺乳动物ＩＬ－１β核酸序列保守区设计合成１对引物,反转录合成ｃＤＮＡ链,经ＰＣＲ扩增,回收扩增后ＤＮＡ片段,用ｋｌｅｏｎｏｗ酶处理,与Ｐ＾ｕｃ１９／ＳｍａＩ连接构成重组质粒,转化宿主菌大肠杆菌ＪＭ１０９,筛选出含有插入片段的重组质粒,用ＰＣＲ及酶切分析鉴定,结果表明获得了带有鸡了ＩＬ－１β片段的ｃＤＮＡ克隆,再经序列分析测定,得知此片段长为２７     

不同储存条件对木聚糖酶和β-葡聚糖酶活性的影响

采用DNS（3，5-二硝基水杨酸）法对在不同储存条件下储存的4种酶制剂（分别为A酶，B酶，C酶，D酶）中的β-葡聚糖酶和木聚糖酶的活力进行了测定。结果表明，经过不同时间和温度储存的酶制剂，其活力均有不同程度的损失。通过测定找到β-葡聚糖和木聚糖酶酶制剂的最佳储存条件。     

小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体α亚基cDNA片段的克隆和序列分析

利用简并引物，采用PCR等分子生物学技术，对小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR)α亚基的cDNA片段进行克隆，并对序列进行分析。测序结果显示，扩增的目的基因片段包含了nAChRα亚基的3种亚型（分别命名为Pxαl，Pxα2，Pxα3）。都具有典型的α亚基的结构；2个相邻的半胱氨酸，由2个半胱氨酸之间二硫键形成包含15个氨基酸的胞外环，与烟碱和α银环蛇毒素结合有关的氨基酸残基，克隆的基因片段在氨基酸序列上和其他昆虫nAChRα亚基基因之间有高达65%-99%的同源性，表明克隆的cDNA片段是小菜蛾nAChRα亚基基因的部分序列。     

灰飞虱β3-微管蛋白cDNA的克隆及序列分析

抽提灰飞虱RNA，利用RT—PCR技术，克隆了灰飞虱体内β3-微管蛋白基因部分序列。进一步通过3’-和5’-RACE获得了全长。序列分析表明，该基因(LSTUB3)长1859bp，编码的蛋白含454个氨基酸，分子量约为51kDa；类似于其他昆虫的β-微管蛋白，LSTUB3含有2个氨基酸保守区：NNWAKGHY和RKAFLHWYTGEGMDEMEFTEF。另外，LSTUB3还具有1个由6个氨基酸组成的β3-微管蛋白特征性的插入序列：CASRGG。结合已发表的其他昆虫该基因的序列，构建了分子系统树，系统分析表明：LSTUB3与其他昆虫的该基因序列有较高的同源性，达85．7％以上。     

利用生防真菌孢子粉生产中的废米生产饲用β-葡聚糖酶和木聚糖酶的黑曲霉固相发酵条件优化

    为资源化利用生防真菌高纯度孢子粉在生产过程中产生的大量废米,将废米粉按比例混入麦麸作为基础物料,接种黑曲霉固相发酵生产饲用β-葡聚糖酶和木聚糖酶,得到麸米比7∶3的最佳配料;纯麦麸发酵3 d后2种酶的产量为353.8、343.8U·g-1干曲.在对发酵时间、配料含水量、补充氮源、微量元素、拌料水的表面活性剂浓度及pH值等单因素分别优化试验的基础上,选取对产酶影响较大的金属离子类型、硫酸铵添加量、拌料水的吐温80浓度和pH进行4因素3水平9处理的正交试验,获得的最优组合为麸米比7∶3的配料中加入0.1%KH2PO4和1% (NH4)2SO4,拌料水为0.3%吐温80和pH 5.经3次重复试验验证,用最优组合配料接种后在25 ℃下发酵54h,β-葡聚糖酶和木聚糖酶产量(±SD)分别达到(716.1±9.2)、(453.0±62.5)U·g-1干曲,远高于优化前相同麸米比配料的酶产量.这一结果为建立环境友好型真菌杀虫剂生产线提供了有用的配套技术,使饲用酶制剂生产节约麦麸30%.     

团花树木葡聚糖转葡糖苷酶cDNA克隆及序列分析

以团花树形成层组织中大量表达的RNA为材料,通过反转录、保守区域PCR、3′RACE和染色体步移等技术获得了团花树AcXET的全长cDNA序列,共1396bp。核苷酸序列分析表明:该序列含有1个960bp的开放阅读框,编码1个由320个氨基酸组成的蛋白质。该基因编码蛋白与已报道的其他植物的XET蛋白有较高的同源性,且含有XET的活性催化位点EIDFE。     

木质层孔菌产木聚糖酶和β-葡聚糖酶的研究

研究了木质层孔菌不同发酵条件对木聚糖酶、β-葡聚糖酶性能的影响,并对其酶作用特性进行了研究结果表明:木质层孔菌产木聚糖酶最适碳源为麸皮,氮源为蛋白胨,最适发酵温度为25℃;而产β-葡聚糖酶最适碳源为木糖,氮源为酵母膏,最适发酵温度为28℃。就产酶时间而言,在发酵前60 h菌株均不产生β-葡聚糖酶和木聚糖酶,在72 h才有微量的酶产生,到192～240 h两种酶均达到产酶高峰,并以216h产酶最高;两种酶的最佳缓冲液均为柠檬酸缓冲液,木聚糖酶的最适作用pH值5.0,最适反应温度为50℃,而β-葡聚糖酶最适作用pH值4.6,最适反应温度为60℃。     

利用RACE方法克隆小麦β-1,3-葡聚糖酶基因的全长cDNA

【目的】研究小麦抗条锈菌的分子机制,在受条锈菌侵染的非亲和组合小麦叶片中克隆一个新的β-1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA。【方法】采用RT-PCR、cDNA末端快速扩增技术(RACE),在感染小麦条锈菌的小麦(水源11)叶片中进行-β1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA的扩增。【结果】得到了一个1338 bp-β1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA,Genbank上注册号为DQ090946,测序结果和序列生物信息学分析结果表明,其与-β1,3-葡聚糖酶基因gi3757681和gi6782375的同源性分别为94.3%和92.1%。该全长cDNA具有完整的编码框,编码334个氨基酸,Genbank上注册号为AAY96422,与-β1,3-葡聚糖酶CAA77085和AAA32958的同源性分别为95.8%和86.7%。【结论】初步推断此全长cDNA是小麦中编码-β1,3-葡聚糖酶的一个新基因。     

香蕉果实expansin cDNA克隆及序列分析

提取成熟香蕉果肉的RNA并分离mRNA，以mRNA反转录合成cDNA，以该cDNA为模板，设计expansin的简并引物，进行RT-PCR(退火温度为50℃)，得到的扩增产物纯化后与pGEM-T-Easy载体连接，转化大肠杆菌，任意挑选2个阳性克隆，进行序列分析，结果得到2个序列相同的expansin的cDNA基因片段，命名为MA-Exp3(以示与已登录的香蕉MA-Expl和MA-Exp2的区别)，MA-Exp3中存在expansin基因的保守区域，即8个半胱氨酸残基和3个色氨酸残基，它编码177个氨基酸，与MA-Exp1的核苷酸同源性为74．2％，氨基酸同源性为86．4％。     

紫花苜蓿几丁质酶Class Ⅰ基因cDNA全长克隆及序列分析

依据NCBI中已登录的截形首蓿(Medicago truncatula)几丁质酶基因的一段EST序列(GenBank登录号:AF167323)设计引物,以紫花苜蓿(Medicago sativa L.)为试验材料,利用RACE技术进行cDNA全长克隆.利用生物信息学软件对该序列进行分析得知:该基因全长1 132bp,其...     

黑曲霉β—葡萄糖苷酶的活力测定和酶学性质

以Ｐ－ＮＰＧ为底物,为通过底物浓度、反应温度、反应时间、反应ＰＨ的考察,确定了黑曲霉β－葡萄糖苷酶酶酶活的最佳测定条件;并对该酶的ＰＨ稳定性、热稳定性、米氏常数等进行了研究     

水貂生长激素cDNA的克隆与序列分析

从水貂脑垂体中分离提取总RNA，经过RT—PCR分别扩增出水貂生长激素前体肽和成熟肽cDNA。PCR产物经凝胶回收纯化，克隆到栽体pGEM—T，然后转化感受态细胞DH5α。在含X—gal、IPTG的LB(Amp^ )平板上筛选阳性克隆，提取质粒作限制性酶切鉴定后，对目的片段进行测序。结果表明，RT—PCR扩增出的2个cDNA片段碱基数分别为713bp和780bp，用DNAsis2．5软件进行分析表明，此扩增序列与GenBank中发表的水貂生长激素cDNA100％相同。前体肽编码区由651bp组成，编码216个氨基酸，包括长度为29个氨基酸的信号肽；成熟肽的开放阅读框全长564bp，编码187个氨基酸，分子量约为21kDa。通过Blast比对，分析了与人、马、牛、猪、山羊、绵羊、猫、狗、大鼠和小鼠生长激素核苷酸序列的同源性。     

转几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因烟草的研究

为选育出高抗真菌病害的烟草新品种，利用叶盘法，通过农杆菌介导，将来自芥菜和橡胶的抗真菌蛋白基因几丁质酶基因和β－1，3－葡聚糖酶基因转入烟草品种K326和红花大金元，在含卡那霉素的MS培养基（MS＋NAA0.1mg/L 6-BA1.0mg/L为芽诱导培养基，根诱导培养基为不含激素的MS）上进行不定芽和根诱导，共获耐卡那霉素再生苗101株，经PCR扩增检测，TB－1等57株呈阳性，即已在功导入外源目的基因，初步接种炭疽病菌和黑胫病菌结果表明，转基因植株后代具有良好的抗病能力。     

人溶菌酶基因cDNA的克隆和序列分析

根据GenBank中的人溶菌酶(hLYZ)mRNA序列设计引物,以人胎盘组织总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增出长度为0.85 kb的hLYZ cDNA序列,经过序列测定表明所克隆的片段与已发表的hLYZ cDNA序列的同源性为99%。推导的氨基酸序列经blastp分析与人溶菌酶蛋白质前体的同源性为97%,成熟肽的同源性为99%,为进一步构建人溶菌酶基因乳腺特异性表达载体奠定了基础。     

里氏木霉β-葡聚糖酶稳定性研究

研究了里木霉GXCβ－莆聚糖酶的稳定性。结果发现：β－葡聚糖酶粗酶液的稳定必于酶液,两者的耐热温度分别为70℃和60℃,其pH稳定范围都为3．0－5．0。Cu^2 ,Mn^2 和Fe^3 对酶有抑制作用,Zn^2 和Co^2 有激活作用,其他离子Ca^2 ,Mg^2 ,Fe^2 和K^ 在不同浓度条件下对β－葡聚糖酶有不同的作用。胰蛋白酶和胃蛋白酶对β－葡聚糖酶活力无显著影响。     

鸡IL-1βcDNA片段的克隆及序列分析

本文以鸡外周血单个核细胞总 Ｒ Ｎ Ａ 为模板,据已报道的８ 种哺乳动物 Ｉ Ｌ—１β核酸序列保守区设计合成１ 对引物,反转录合成ｃ Ｄ Ｎ Ａ 链,经 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增,回收扩增后的 Ｄ Ｎ Ａ 片段,用ｋｌｅｎｏｗ 酶处理,与 Ｐｕ ｃ１ ９ ／ Ｓｍ ａ Ｉ 连接构成重组质粒,转化宿主菌大肠杆菌 Ｊ Ｍ１ ０ ９ ,筛选出含有插入片段的重组质粒,用 Ｐ Ｃ Ｒ 及酶切分析鉴定,结果表明获得了带有鸡 Ｉ Ｌ－ １β片段的ｃ Ｄ Ｎ Ａ 克隆;再经序列分析测定,得知此片段长为２７０ｂｐ ,与人及小鼠 Ｉ Ｌ—１β基因核苷酸序列同源性分别为４５ ％ 和３０ ％ 。     

绵羊intelectin基因cDNA克隆与序列分析

【研究目的】克隆并分析绵羊intelectin基因;【方法】十二指肠粘膜组织提取总RNA,分别以上游电子克隆的拼接体和下游保守区为模板设计引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD-19T载体连接后转化E.coli JM109,筛选阳性克隆并测序;【结果】克隆的绵羊intelectin基因与牛、猪、人、大鼠的同源性分别为93%、87%、83%、79%,预测的氨基酸序列包含FBG结构域。【结论】成功克隆了绵羊intelectin-2基因,并注册GenBank(Accession.EF624459)。     

小鼠蛋白激酶CK2β亚基cDNA的克隆与序列分析

目的：构建小鼠蛋白激酶CK2β亚基cDNA重组表达质粒，以便深入进行CK2结构与功能的研究。方法：通过反转录PCR从NIH3T3小鼠成纤维细胞中获得小鼠蛋白激酶CK2β亚基编码区cDNA，PCR扩增酶为高保真DNA聚合酶。将NdeⅠ/HindⅢ彻底双酶切PCR产物定向连接到牛小肠碱性磷酸酶去5′端磷酸的同样彻底NdeⅠ/HindⅢ双酶切的表达载体pT7—7中，转化感受态大肠杆菌DH5α获得转化子，用0．8％琼脂糖凝胶电泳初步筛选转化予，将阳性克隆进行单和双酶切分析鉴定。随机挑选两个阳性克隆进行DNA测序。结果：转化子的阳性筛选率为100％，限制性酶切分析结果表明插入片段和重组质拉的大小与理论推测值相符。DNA测序结果表明：两个重组小鼠CK2β亚基克隆中的插入片段序列均与两种已报道的小鼠CK2β亚基cDNA编码区序列分别存在一个碱基差异，但我们报道的这2个差异碱基与大鼠、兔、猪和人CK2β亚基cDNA的编码区相应碱基序列一致。结论：本实验克隆的小鼠蛋白温酶CK2β亚基cDNA编码区序列可能是正确的序列。     

沙田柚黄龙病病原β-操纵子DNA片段的克隆与序列分析

采集表现斑驳症状的沙田柚叶片,根据柑桔黄龙病特异保守区域β-操纵子序列设计引物,通过对其病叶脉总DNA进行PCR扩增、扩增产物纯化、与pMD18-T Vector连接、转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH 5a菌株、筛选阳性克隆重组子、重组子测序,并将测序结果与柑桔黄龙病病原β-操纵子部分DNA相应序列进行比较.结果表明,引起沙田柚斑驳症状的病原与亚洲柑桔黄龙病原(Liberobacter asiaticum)相应序列的同源率为99%,而与非洲柑桔黄龙病病原的同源率仅为79.9%.因此,从分子水平上证明沙田柚斑驳症状是由黄龙病病原侵染所致,该病原属于亚洲种中的一个成员.