鸡IFIT5对J亚群禽白血病病毒在DF-1细胞内复制的影响

【目的】制备鸡干扰素诱导蛋白含三角形四肽重复5(IFIT5)多克隆抗体,以探究IFIT5对J型禽白血病病毒(ALV-J)在鸡胚成纤维细胞(DF-1)内复制的影响。【方法】以感染ALV-J的鸡脾脏组织细胞提取的RNA反转录获得的cDNA作为模板,对IFIT5基因进行PCR扩增,利用重组酶将纯化后的PCR产物和线性化载体进行连接,构建重组质粒pET-28a-IFIT5和pcDNA5-flag-IFIT5并测序。将测序正确的重组质粒pET-28a-IFIT5转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行诱导表达,表达的融合蛋白His-IFIT5纯化后免疫6周龄BALB/c雌鼠制备多克隆抗体,通过Western blotting鉴定抗体的特异性,利用间接ELISA测定抗体的效价。将测序正确的重组质粒pcDNA5-flag-IFIT5转染DF-1细胞,24 h后接种ALV-J,通过Western blotting检测DF-1细胞中过表达IFIT5对ALV-J复制的影响。【结果】试验成功扩增到大小为1 440 bp的IFIT5基因,并成功构建重组质粒pET-28a-IFIT5和pcDNA5-flag-IFIT...     

快、慢羽鸡抗ALV-J天然免疫差异的研究

研究旨在探索快、慢羽鸡对禽白血病感染的天然免疫反应差异。试验采用J亚群禽白血病病毒（ALV-J）SCAU-HN06株接种快羽鸡和慢羽鸡，从接种病毒后第1天开始，每隔1天采样至第15天，采用实时荧光定量和ELISA检测快、慢羽鸡干扰素α(IFN-α)、白细胞介素12(IL-12)、肿瘤坏死因子（TNF-α）及抗病毒基因的表达情况。结果显示：慢羽鸡较快羽鸡极显著易感ALV-J(P<0.01)；接种病毒后env基因的相对表达量在快羽鸡体内上升较慢羽鸡缓慢，表达峰值较慢羽鸡小；慢羽鸡接种病毒第1天IFN-α、TNF-α和IL-12蛋白表达量高于快羽鸡，随后IFN-α、TNF-α、IL-10和IL-12的蛋白表达量呈降低趋势，第11天表达量降低不显著（P>0.05）；快羽鸡在接种病毒后第1天IFN-α、TNF-α和IL-12蛋白表达量升高，第13天极显著降低（P<0.01）；快羽鸡抗病毒基因OAS、PKR、MX表达量显著或极显著高于慢羽组且强度强（P<0.05或P<0.01）。综上所述，慢羽鸡免疫系统比快羽鸡更早被ALV-J突破，慢羽鸡抗ALV-J的天然免疫反应比快...     

禽白血病病毒J亚群自然感染商品蛋鸡致瘤性新特征

2009年8月,山东省邹城市某海兰褐蛋鸡群,160日龄发病,死亡率为7％.患鸡经大体剖检、病理组织学、PCR和免疫组织化学等检测,确诊为禽白血病病毒J亚群(ALV-J)感染.病理组织学检测发现,病鸡单独患血管瘤,或髓细胞瘤和纤维肉瘤多发性出现,由ALV-J自然感染引起同一鸡体出现髓细胞瘤和纤维肉瘤尚属国内外首次报道.肝脏研磨接种DF-1细胞培养7d后传3代,细胞无病变,ELISA检测感染细胞上清ALV p27抗原阳性,进一步确诊此鸡群为ALV感染.对病变严重的鸡进行病毒分离及ALV-J gp85基因同源性比较显示与原型株HPRS-103的同源性最高,达94.1％.本研究丰富了ALV-J感染的临床诊断依据,并为ALV-J在我国蛋鸡群中多潜能致瘤机制的研究提供了科学基础.     

E3泛素连接酶FBXL8对A亚群禽白血病病毒复制的影响

【目的】制备鸡E3泛素连接酶FBXL8多克隆抗体,探究鸡源FBXL8对A亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup A,ALV-A)在鸡胚成纤维细胞(DF-1)内复制的影响。【方法】以DF-1细胞cDNA为模板,通过PCR扩增FBXL8基因,构建鸡源FBXL8原核表达重组质粒pET-28a-FBXL8,将其转化大肠杆菌表达菌株RIL进行诱导表达及纯化,将表达产物His-FBXL8免疫10月龄新西兰大白兔制备多克隆抗体,利用Western blotting和间接ELISA分别检测抗体特异性及效价;针对已公布的FBXL8基因序列设计过表达引物及靶向FBXL8基因的干扰序列,构建过表达质粒psi-flag-FBXL8及干扰质粒pLKO.1-FBXL8-shRNA,使用Western blotting检测其表达效果。将构建成功的过表达质粒和干扰质粒转染DF-1细胞,24 h后感染ALV-A,通过半定量PCR、Western blotting分别检测ALV-A的结构蛋白P27、GP85表达水平。【结果】PCR成功扩增出大小为1 182 bp的FBXL8基因片段,...     

gga-miR-21过表达细胞株对传染性法氏囊病病毒复制的影响

为研究microRNA(gga-miR-21)对传染性法氏囊病病毒(IBDV)复制的影响,本研究利用PCR方法从鸡的肝细胞基因组中扩增细胞pri-gga-miR-21,克隆于慢病毒表达质粒pL-EGFP中构建重组质粒pL-miR-21。将pL-miR-21与3个包装质粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染293FT细胞,制备含gga-miR-21基因的重组慢病毒VL+miR-21。将VL+miR-21感染DF-1细胞,经杀稻瘟菌素筛选获得过表达gga-miR-21的细胞株DF-miR-21,采用定量RT-PCR(qRT-PCR)检测表明,gga-miR-21的表达量比正常DF-1细胞提高60%。将IBDV接种于DF-miR-21细胞,在96 h后,其病毒滴度(104.75TCID50/0.1 mL)显著低于正常DF-1细胞的病毒滴度(108.75TCID50/0.1 mL)。采用生物信息学方法和双荧光素酶报告系统分析验证,在IBDV基因组VP1基因中存在gga-miR-21的结合靶点。将IBDV感染DF-miR-21细胞,采用western blot分析,VP1蛋白的表达量比正常DF-1细胞显著降低;用qRT-PCR分析,VP1 mRNA水平与正常DF-1细胞没有明显差异。本实验结果表明:细胞gga-miR-21可以抑制IBDV的复制,其分子作用机理是在VP1基因翻译水平上实现的。     

E3泛素连接酶RNF185对A亚群禽白血病病毒体外复制的影响

【目的】环指蛋白185(ring finger protein 185,RNF185)是Ring家族E3泛素连接酶的一员。试验旨在探明鸡源RNF185对A亚群禽白血病病毒(Avian leukemia virus subgroup A,ALV-A)体外复制的影响,为进一步研究鸡源RNF185对ALV-A致病性的影响和介导的致瘤机制提供参考。【方法】参考GenBank中已公布的鸡RNF185基因(登录号：NP＿001007841)序列分别设计RNF185过表达引物和RNF185单链shRNA,通过PCR扩增RNF185基因及合成双链shRNA,将其分别克隆至真核表达载体psi-flag和干扰载体pLKO.1-GFP,并使用PCR、双酶切和测序等方法验证重组质粒。使用Western blotting验证重组质粒的表达和干扰效果,并使用CCK-8试剂盒检测重组质粒对DF-1细胞活性的影响。在RNF185过表达和干扰后的DF-1细胞中分别接种10⁴半数组织感染剂量(TCID₅₀)ALV-A(rHB2015012)病毒液,于接种完成后3、4和5 d收取...     

干扰UBE2N对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响

为了探究泛素结合酶2N(ubiquitin-conjugating enzyme 2N, UBE2N)对牛骨骼肌卫星细胞(skeletal muscle satellite cells, MSCs)增殖和分化的影响,试验采用天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室冻存的牛MSCs建立成肌分化模型,设计UBE2N的siRNA(si-UBE2N)构建UBE2N的干扰模型,转染牛MSCs,并以转染si-NC作为对照;采用qRT-PCR和Western-blot方法分别检测转染后对UBE2N基因和蛋白表达的干扰效果;采用5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色法检测si-UBE2N对牛MSCs增殖的影响;在荧光倒置显微镜下观察分化期(DM期)牛MSCs的肌管形成状态,通过qRT-PCR和Western-blot方法分别检测MSCs中肌细胞生成素(MyoG)和肌球重链蛋白(MyHC)基因和蛋白表达水平,分析转染si-UBE2N对牛MSCs分化的影响。结果表明：与对照组相比,转染si-UBE2N后UBE2N基因和蛋白相对表达量极显著降低(P<0.01)。干扰UBE2N后经EdU染色发现,牛...     

牛IRF7蛋白对牛病毒性腹泻病毒增殖影响的研究

为了探索牛干扰素转录调节因子7(IRF7)基因对牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)增殖的影响,试验通过慢病毒包装和RNA干扰等试验构建IRF7基因的干扰和过表达细胞模型,然后运用实时荧光定量PCR扩增和Western-blot验证过表达及干扰效果,最后用BVDV进行感染,通过E2蛋白的表达水平评估IRF7基因与BVDV增殖的关系。结果表明：BVDV感染IRF7基因过表达细胞模型12 h后,E2基因相对表达量显著降低(P<0.05),且随着时间的延长,E2蛋白表达水平逐渐降低;而BVDV感染IRF7基因干扰细胞模型8 h后,E2基因相对表达量显著升高(P<0.05),E2蛋白的表达水平在8 h后逐渐升高,即过表达IRF7基因能够使BVDV增殖水平降低,而干扰IRF7基因的表达则能够使BVDV的增殖水平增加。说明牛IRF7蛋白对牛BVDV的增殖具有抑制作用。     

GADD45β蛋白抑制ALV-J在DF-1细胞中的复制

生长阻滞和DNA损伤诱生蛋白45β（growth arrest and DNA damage 45β，GADD45β）参与多种细胞信号通路，在病毒感染过程中发挥重要作用，但在禽白血病病毒（avian leukosis virus，ALV）感染中研究较少。本研究中，用J亚群禽白血病病毒（ALV-J）感染DF-1细胞，通过荧光定量PCR和Western blot检测GADD45β表达水平。此外，在过表达GADD45β和干扰GADD45β的情况下，通过Western blot、间接免疫荧光试验和ELISA检测GADD45β对ALV-J复制的影响。结果表明，ALV-J感染DF-1细胞能显著上调GADD45β表达水平（P<0.05）。过表达GADD45β后，ALV-J的蛋白表达水平显著降低（P<0.05），荧光信号强度也明显低于对照组。然而，干扰GADD45β后，ALV-J的复制水平显著上调（P<0.05），说明GADD45β可以抑制ALV-J病毒复制。本研究首次发现GADD45β具有抑制ALV-J病毒复制的功能，为抗ALV-J的研究提供了新的思路和理论基础。     

黄芪多糖对玉米赤霉烯酮诱导鸡胸腺细胞凋亡的保护作用

为了探讨黄芪多糖(Astragalus polysaccharides, APS)对玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEA)诱导的鸡胸腺细胞凋亡的影响,试验以鸡原代胸腺细胞为材料,采用MTT法检测APS对鸡胸腺细胞的安全浓度;选取50,100,200,400μg/mL APS分别与ZEA同时处理胸腺细胞48 h,并设置细胞对照和ZEA模型对照,MTT法检测细胞存活率;应用实时荧光定量PCR法检测内质网应激和细胞凋亡相关基因mRNA的表达。结果表明：APS对鸡胸腺细胞的安全浓度为50～400μg/mL;与细胞对照比较,ZEA模型对照能极显著降低细胞存活率(P<0.01),且GRP78、ATF6、ATF4、Caspase-3、Bax基因mRNA相对表达量极显著升高(P<0.01),Bcl-2基因mRNA相对表达量极显著下降(P<0.01);与ZEA模型对照比较,不同浓度APS+ZEA能显著或极显著提高细胞存活率(P<0.05或P<0.01),且GRP78、ATF6、ATF4、Caspase-3、Bax基因mRNA相对表达量极显著下降(P<0.01...     

空心莲子草乙酸乙酯部位体内外抗H9N2亚型禽流感病毒活性的研究

【目的】探究空心莲子草乙酸乙酯部位(ethyl acetate extract from Alternanthera philoxeroides,AETAC)体内外抗H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 subtype Avian influenza virus, AIV-H9N2)活性及其作用机制。【方法】利用CCK-8法检测不同浓度AETAC作用不同时间对鸡胚成纤维细胞(DF-1)的抑制作用,通过预防感染、影响复制、阻止吸附及直接杀灭4种方式作用后检测AETAC对DF-1细胞的毒性,选择体外最佳抗AIV-H9N2作用方式。尿囊腔接种不同浓度AETAC确定其对鸡胚的最大安全浓度;将AETAC以3种不同给药方式作用于AIV-H9N2感染后鸡胚,选择体内最佳给药方式。经尿囊腔同时接种AETAC和AIV-H9N2,统计各组鸡胚存活数,测定血凝效价,并观察胚胎的发育情况和鸡胚法氏囊病理组织变化。【结果】在一定范围内,随着AETAC浓度升高或作用时间延长,AETAC对DF-1细胞的抑制率升高。与空白对照组相比,4种抗AIV-H9N2作用方式下,病毒对照组和药物组细胞存活率均显著降低(P<0....     

J亚群禽白血病病毒与禽网状内皮增生症病毒共感染对肉鸡生长和免疫功能的抑制作用

1日龄网鸡感染J亚群禽白血病病毒(ALV-J)以及共感染禽网状内皮增生症病毒(REV)后,肉鸡生长发育明显受阻,体重增重明显下降(P＜0.05),法氏囊、胸腺明显萎缩(P＜0.05),在用新城疫疫苗免疫后,感染组血清中新城疫抗体效价显著低于对照组(P＜0.05);在ALV-J和REV共感染后,这种抑制作用更为明显(P＜0.01).ALV J单独感染后,鸡对传染性法氏囊病病毒(IBDV)弱毒疫苗免疫后的抗体反应与对照组没有明显差别,但ALV-J与REV的共感染可明显延缓鸡对IBDV弱毒疫苗免疫的抗体反应.     

鸡巨噬细胞CCL4抗禽白血病病毒作用及其机制初探

为了探究CCL4基因抗J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的作用机制,观察了CCL4基因在ALV-J感染鸡巨噬细胞(HD11)不同时间(6,12,24,36,48 h)后的表达规律,分别构建CCL4、ALV-J env、ALV-J GP85和ALV-J GP37真核表达载体并转染HD11细胞,通过RT-qPCR检测CCL4...     

二甲双胍对鸡巨噬细胞HD11天然免疫相关基因表达影响及其抗禽白血病病毒能力分析

本研究旨在探讨二甲双胍(metformin)处理对鸡巨噬细胞HD11天然免疫相关基因表达及禽白血病病毒(Avian leukosisvirus,ALV)复制水平的影响。用2mmol/L二甲双胍处理鸡巨噬细胞HD11,处理48h后收集细胞,荧光定量PCR(RT-qPCR)检测天然免疫基因和内源性反转录病毒的表达。另外,将J亚群禽白血病病毒(J subgroup Avian leukosis virus,ALV-J)(MOI=5)接种于细胞板中,病毒感染细胞24 h后进行二甲双胍处理, 48 h后收集HD11细胞和上清分别进行RT-qPCR检测和ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)检测。结果表明,二甲双胍显著上调HD11细胞天然免疫相关基因TLR3(P<0.01)、IFIH1(P<0.01)、IRF7(P<0.01)、STAT1(P<0.05)、IFN-α(P<0.01)、IFN-β(P<0.01)表达水平,并激活了鸡内源性反转录病毒的表达,抑制ALV-J复制水平。综上,二甲双胍可激活鸡巨噬细胞的天然免疫反应,从而提高鸡抗禽白血病病毒的能力。本研究在体外实验中验证二甲双胍具有抑制ALV增殖的作用,对家禽业的疾病防控有一定的应用价值。     

J亚群禽白血病病毒TCID_(50)不同测定方法的比较

为比较不同方法在测定J亚群禽白血病病毒(ALV-J)组织细胞半数感染量(TCID50)上的差异,将ALV-J传染性克隆r NX0101株同一病毒保存液以10倍梯度稀释后按照常规方法分别接种已长满DF-1细胞和鸡胚成纤维细胞(CEF)的96孔板,维持7 d后取所有细胞培养上清以ALV-p27抗原检测试剂盒检测p27抗原,细胞固定后以ALV-J特异性单克隆抗体JE9进行间接免疫荧光(IFA)检测,确定病毒感染孔后按照Reed-Muench法分别计算两种方法在两种细胞上的TCID50。结果显示,ELISA法测定该病毒在DF-1细胞和CEF细胞上的TCID50分别为10-5.4TCID50/0.1 m L和10-4.666TCID50/0.1 m L,而IFA法测定该病毒在DF-1和CEF细胞上的TCID50分别为10-6.333TCID50/0.1 m L和10-5.2TCID50/0.1 m L。结果表明,IFA比ELISA具有更高的灵敏度,并且ALV-J在DF-1细胞上复制能力比CEF更强,在DF-1细胞上测定ALV-J的TCID50更为科学。     

J亚型禽白血病病毒水平传播的试验

为探讨J亚型禽白血病病毒(ALV-J)的水平传播情况,选取0日龄60只抗原阴性鸡和20只抗原阳性鸡混合饲养,接触7 d、15 d、25 d、35 d、45 d、55 d、65 d、75 d、90 d后检测阴性鸡的泄殖腔ALV-p27和血清ALV-J抗体,并于65 d采集阴性鸡血浆接种DF-1细胞进行外源性ALV和J亚群分离鉴定。结果显示,阴性鸡与阳性鸡混合饲养15 d,泄殖腔中开始检测到ALV-p27抗原,65 d阳性率最高达50.00%;ELISA和RT-PCR方法检测到细胞培养液中外源性ALV阳性率分别为60.00%和56.67%;RT-PCR和IFA方法检测到细胞培养液中ALV-J抗原阳性率分别为56.67%和63.33%;65 d阴性鸡血清中ALV-J抗体阳性率达63.33%。表明阴性鸡与阳性鸡直接接触混合饲养,通过水平传播被感染外源性ALV-J的几率相当高。     

香猪睾丸间质细胞TAS1R3基因干扰后对自噬相关因子的影响

旨在探究TAS1R3基因通过mTOR对从江香猪自噬相关基因表达的影响。本试验选择30日龄健康雄性从江香猪3头，采集睾丸组织并培养出睾丸间质细胞。将构建成功的干扰载体和空载体转染至细胞中，利用qRT-PCR检测其对TAS1R3基因表达影响，运用qRT-PCR和Western blot检测TAS1R3基因干扰后对味觉受体第一家族一号受体(TAS1R1)、细胞外信号调节激酶1(ERK1)、细胞外信号调节激酶2(ERK2)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、BECN1和微管相关蛋白1轻链3β(MAP1LC3B)表达的影响。结果表明，当TAS1R3基因被干扰后，相较于shRNA-NC对照组，TAS1R1、ERK1、ERK2、mTOR基因mRNA表达量均极显著降低(P<0.01),自噬因子BECN1和MAP1LC3B表达量极显著升高(P<0.01)。Western blot结果表明当TAS1R3基因被干扰后，与shRNA-NC对照组相比，蛋白T1R3、T1R1、p-mTOR、p-S6K1、p-ERK12均极显著降低(P<0.01),而自噬蛋白Beclin 1表达量极显著升高(P<...     

泛素相关修饰蛋白SUMO-2对RAW264.7细胞内布鲁氏菌16M存活的影响

为探究泛素相关修饰蛋白SUMO-2对布鲁氏菌16M的影响，本试验构建了SUMO-2基因干扰和过表达小鼠巨噬细胞RAW264.7模型，并用布鲁氏菌16M进行侵染。参照GenBank中SUMO-2基因序列设计特异性干扰片段和过表达引物，克隆成功后连接至相应的慢病毒载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，选取阳性克隆菌提取质粒转染HEK-293FT细胞，将重组的慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7，利用布鲁氏菌16M分别侵染构建成功的干扰和过表达细胞模型。通过实时荧光定量PCR检测SUMO-2 mRNA的转录水平，Western blotting检测SUMO-2蛋白的表达，ELISA检测IFN-γ和TNF-α水平，菌落计数来确定布鲁氏菌在细胞中的存活能力。结果显示，与对照组相比，干扰组SUMO-2 mRNA水平极显著降低（P<0.01），过表达组SUMO-2 mRNA水平极显著升高（P<0.01），成功构建了SUMO-2干扰和过表达细胞模型。Western blotting结果显示，布鲁氏菌16M感染能以时间依赖的方式下调SUMO-2蛋白的表达。经菌落计数后发现，SUMO-2过表达后布鲁氏菌的数量极显著减少（P<0.01），抑制布鲁氏菌16M的细胞内繁殖。而SUMO-2干扰后布鲁氏菌的数量显著或极显著增加（P<0.05；P<0.01），促进布鲁氏菌16M的细胞内繁殖。同时，经SUMO-2过表达后，IFN-γ和TNF-α水平极显著升高（P<0.01）。经SUMO-2干扰后，TNF-α水平显著降低（P<0.05），IFN-γ水平极显著降低（P<0.01），SUMO-2在RAW264.7细胞中的表达变化也影响IFN-γ和TNF-α的产生。综上所述，SUMO-2蛋白在布鲁氏菌胞内存活中起着重要作用，可能有助于阐明布鲁氏菌感染的致病机制。     

3个江西地方鸡品种的禽白血病病毒病原学调查

对来自江西3个地方鸡品种(崇仁麻鸡、余干乌骨鸡、东乡绿壳蛋鸡)进行禽白血病病毒(ALV)病原学调查。将所采集的血浆接种DF-1细胞,经ALV p27抗原ELISA检测,结果显示这3个江西地方鸡品种均有外源性ALV感染,经鉴定得到4株J亚群禽白血病病毒(ALV-J)。基于gp85序列分析表明这4个分离株与ALV-J英国原型株HPRS-103 gp85基因核苷酸序列相似性最高(平均为94.6%),而与A、B、C、E亚群ALVgp85基因的核苷酸相似性仅在50.6%~54.5%之间。这是江西地方鸡品种分离和鉴定ALV-J的初次报道,对于我国江西省地方鸡品种的禽白血病净化具有参考价值。     

猪RPL36A基因对PK15细胞增殖过程的影响

【目的】探究核糖体蛋白L36A(ribosomal protein L36A,RPL36A)基因对PK15细胞增殖过程的影响,为解析马身猪和大白猪生长速度差异的生理机制奠定基础。【方法】采用脂质体法将RPL36A基因干扰和过表达载体转染至PK15细胞中,通过实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测RPL36A基因表达效率及细胞增殖标志基因(PCNA、Ki67、Cyclin B、CDK4)的表达变化,并通过划痕试验、CCK-8和EdU法检测细胞增殖情况。【结果】过表达RPL36A基因后,PK15细胞中PCNA、Ki67、CDK4基因mRNA表达量均极显著升高(P<0.01),Cyclin B基因mRNA表达量显著升高(P<0.05);PCNA蛋白表达量显著升高(P<0.05);PK15细胞在48 h的细胞数量极显著高于空载组(P<0.01),细胞增殖速度升高;阳性细胞数极显著升高(P<0.01)。干扰RPL36A基因后,PK15细胞中PCNA、Cyclin B基因mRNA表达量均极显著降低(P<0.01),Ki67、CDK4基因mR...