黄鳝ghrelin基因的克隆及分子特征分析

Ghrelin是联系生殖和能量代谢的重要桥梁信号分子,通过克隆黄鳝(Monopterus albus)的ghrelin基因并对其基因结构和功能进行了初步分析;运用c DNA末端快速扩增技术获得了黄鳝ghrelin基因的c DNA序列和DNA序列全长。结果表明,黄鳝ghrelin基因c DNA全长552 bp(Gen Bank accession no.JX122807),包括115 bp的5'端非编码区、324 bp的完整开放阅读框以及113 bp的3'端非编码区;DNA序列全长1323 bp,由3个内含子和4个外显子构成,内含子剪切位点具有典型识别核苷酸GT/AG,3个内含子分别为594 bp、84 bp和93 bp,4个外显子长度分别为229 bp、78 bp、112 bp和133 bp。氨基酸序列分析显示,ghrelin基因推导的Ghrelin蛋白前体原(propreghrelin)序列由26 aa的信号肽、19 aa的成熟肽以及C端氨基酸残基等构成;其中,成熟肽第3位为丝氨酸(Ser3),是Ghrelin的酰基化位点;C端氨基酸残基序列极可能包括与Ghrelin成熟肽功能相互拮抗的肥胖抑制素(Obestatin)。氨基酸的同源性及进化关系分析表明,黄鳝与某些鲈形目鱼类的蛋白前体原存在高度相似性,且在进化上黄鳝与较高级的鲈形目、鲽形目鱼类聚为一支。ghrelin基因结构及其蛋白质某些氨基酸残基序列的高度保守,预示着Ghrelin在脊椎动物中有着重要的生理功能与类似的作用机制。     

草鱼HSP90基因cDNA序列克隆及其组织表达差异

根据斑马鱼HSP90(Heat shock protein)序列(NM_131328)设计并合成一对引物,提取草鱼肝脏组织总RNA,RT-PCR扩增获得草鱼HSP90基因cDNA部分序列596 bp,获得GenBank登陆号为FJ517554.将测序结果利用DNAman软件与其他几种已知序列的鱼进行比对,结果表明,草鱼HSP90与斑马鱼、鲤、鲋的同源性依次为90%、89%、92%.同时利用半定量(Semi-quantitative,SQ)RT-PCR技术检测HSP90在草鱼脂肪、肌肉、肠、脑、粘液、性腺、鳔、肝脏、心脏、脾脏、鳃、鳍12个组织的表达差异.结果表明,HSP90在草鱼除了鳍外的其他11个组织中均检测到表达,其中在心脏中表达最高,但与鳃、性腺、脑、脾脏中的表达无显著差异(P>0.05),在脂肪、粘液、鳔组织中的表达显著低于其他几种组织(P<0.05),在肝脏、肌肉与肠中的表达无显著差异(P>0.05).     

银鲫crh基因的克隆、组织表达谱及其对摄食的影响

为研究crh (Corticotropin-releasing hormone)基因对鱼类摄食的调控作用,首次克隆了银鲫(Carassius auratus gibelio) crh基因c DNA全长序列。运用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测crh基因m RNA在不同组织的表达及餐前、餐后和禁食对其表达的影响。结果显示,银鲫crh基因的c DNA序列全长为920 bp,其中,5’-UTR为53 bp,3’-UTR为378 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)为489 bp。推导银鲫crh基因的ORF区编码蛋白由162个氨基酸组成,其中,含有11个氨基酸的保守区,24个氨基酸的信号肽,41个氨基酸的成熟肽。氨基酸序列的多重比较分析显示,银鲫crh基因与金鱼(Carassiusauratus)的同源性为99%,与鲤(Cyprinuscarpio)的同源性为96%。荧光定量PCR表达分析显示,银鲫crh基因在下丘脑中的表达量最高,其次是端脑和心脏。crh基因的表达量在餐前与餐后没有显著变化(P0.05),在禁食第5天、第7天出现极显著降低(P0.01),而在复投喂后第9天、第11天出现极显著升高(P0.01)。以上结果显示,crh基因在银鲫摄食调控方面可能扮演着重要角色。     

草鱼AdipoR1-B基因克隆、组织分布及其表达的营养调控

为探讨Adipo R1-B在鱼类糖类和脂质代谢中的作用,本实验采用RACE方法获得了草鱼Adipo R1-B的全长c DNA序列(登录号:KP733846),利用生物信息学技术对该基因及其所编码蛋白的结构特征进行了分析;采用实时定量PCR技术,检测了Adipo R1-B在19个不同组织中的表达特性以及高糖(45%)、高脂(8%)和高糖高脂饲喂对草鱼肝脏中该基因表达的影响。结果显示,草鱼Adipo R1-B c DNA全长2186 bp,其中开放读码框为1122 bp,编码373个氨基酸;跨膜结构分析表明草鱼Adipo R1-B为典型的7次跨膜蛋白;同源性分析结果显示,草鱼Adipo R1-B与其他物种的Adipo R1-B高度同源(氨基酸相似度78%以上),并与斑马鱼Adipo R1-B的进化关系最近;组织分布结果显示,Adipo R1-B在草鱼肝脏中表达量最高,中枢神经系统和红肌次之;此外,高脂和高糖高脂饲喂均能够显著提高草鱼肝脏中Adipo R1-B的表达水平。因此,草鱼肝脏中Adipo R1-B的表达水平受到日粮中脂类水平的调控,推测该受体可能在调节鱼类脂质代谢中发挥重要作用。     

草鱼C1qC基因的克隆及表达分析

为了研究C1qC基因在草鱼(Ctenopharyngodon idella)免疫过程中所起的作用,利用RT-PCR和RACE方法克隆获得了C1qC基因cDNA全长序列,经序列分析表明,所克隆的C1qC cDNA全长为916 bp,包括开放阅读框(open reading frame,ORF)735 bp,5′端非编码区(untranslated region,UTR)89 bp和3′端非编码区(UTR)92 bp。735 bp的ORF共编码244个氨基酸,相对分子量为26 162.5 U。同源性分析表明,草鱼与斑马鱼(Danio rerio)的相似度最高,达到71%。经草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)诱导后,草鱼C1qC基因在鳃、皮肤、肌肉、肝、中肾、心脏、头肾等组织中的mRNA表达水平均显著上调。在草鱼胚胎发育的各个阶段都能检测到C1qC mRNA的表达,说明该基因可能在草鱼胚胎和鱼苗的免疫反应和早期发育中起重要作用。本研究将为今后在草鱼免疫功能方面深入研究C1qC基因提供基础资料。     

草鱼PPARα和PPARγ基因的克隆与组织表达差异

根据GenBank上登录的过氧化物酶体增殖物激活受体s(Peroxisome proliferator activated receptor,PPARs)基因序列设计2对引物,提取草鱼肝脏组织总RNA,经RT-PCR扩增获得了PPARα 624bp和PPARγ438 bp.并利用半定量RT-PCR分析T草鱼PPARα和...     

草鱼Mx蛋白基因的克隆与原核表达

根据已报道的Mx蛋白cDNA序列设计合成特异引物，应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，从草鱼呼肠孤病毒(GCRV)诱导的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝脏总RNA中扩增获得Mx蛋白cDNA，回收纯化后克隆到pGEM-T Easy Vector系统的T载体上。重组子的序列分析表明：所克隆的Mx蛋白cDNA长722bp，编码240个氨基酸，包括1个三联GTP结合区域和1个发动蛋白(dynamin)族特征的序列。与已知鱼类Mx蛋白基因序列比较表明，草鱼Mx蛋白基因序列与其它鱼类Mx基因相应序列具有较高的同源性，其中与斑马鱼Mx蛋白E型基因碱基序列比较同源性最高，为87．1％。将此基因改造后定向克隆至原核表达质粒pBV220，构建成重组草鱼Mx蛋白基因表达质粒pBVgcMx，并在大肠杆菌中获得高效表达，重组草鱼Mx蛋白的表达量占菌体总蛋白的26．6％。Q-sephrose FF层析柱分离纯化的重组草鱼Mx蛋白纯度达95．6％。     

草鱼Ⅰ型胶原蛋白α1基因cDNA全序列克隆、组织分布及其生物信息学分析

利用PCR和RACE方法首次克隆了编码草鱼肌肉Ⅰ型胶原蛋白的α1基因(COL1A1)的cDNA全长序列,为5772bp,其开放阅读框为4347bp,编码1448个氨基酸。BLAST同源性分析结果显示,草鱼COL1A1基因的氨基酸序列与斑马鱼、金鱼同源性较高,分别为93.90%和93.60%,呈现出较高的保守性。系统进化树分析表明,该基因与斑马鱼、金鱼处于同一支,亲缘性最近。生物信息学分析显示,草鱼COL1A1蛋白质的相对分子质量为137.2ku,理论等电点是5.44,为α螺旋β折叠三重螺旋结构蛋白。有18段三重螺旋重复域,22段低复杂度域,17个功能域。COL1A1蛋白有33～69,1249～1355两个绑定钙的区域和62～104一个绑定锌的区域。利用半定量RT-PCR方法检测的组织表达结果表明,COL1A1基因在草鱼肌肉、肠道、肝胰脏、鳃、皮肤、鳍条、肾脏和脾脏8个组织中均有表达,其中在皮肤、鳃、肾脏、鳍条组织中的mRNA表达量高于其他4个组织(P<0.05)。     

异齿裂腹鱼CCK基因的cDNA克隆及其摄食功能

旨在研究异齿裂腹鱼(Schizothorax o’connori)缩胆囊素(cholecystokinin, CCK)基因的摄食功能。本研究克隆得到了异齿裂腹鱼CCK基因的cDNA全长,通过生物信息学分析发现其属于CCK-1亚型。异齿裂腹鱼CCK的cDNA全长为773bp,其中开放阅读框(ORF)为372bp,可以编码123个氨基酸。异齿裂腹鱼CCK由1个信号肽和1个典型的CCK-8肽保守结构域组成,为亲水性蛋白,但没有跨膜结构。运用实时荧光定量PCR(Real-timePCR)检测异齿裂腹鱼CCK基因在组织中的分布情况,以及餐前餐后和禁食复喂对其表达量的影响。结果表明,异齿裂腹鱼CCK在各组织中均有表达,其中在脑中表达量最高,在肠道、心脏、肝、脾、肾、皮肤、鳃、眼和鳔中表达量相对较高,在肌肉中表达量最低。餐后CCK基因的表达量显著升高,禁食使异齿裂腹鱼CCK基因的表达量显著下降,而复喂使CCK基因的表达量显著上升,表明CCK基因既是异齿裂腹鱼的餐后饱感信号因子,又是长期调控摄食因子。本研究为异齿裂腹鱼的人工饲养和品种保护等提供了理论依据。     

草鱼HSP70基因cDNA部分序列克隆及其组织表达差异

根据鲤热休克蛋白70(Heat shock protein,HSP70)序列(AY120894)设计并合成一对引物,以草鱼(Cteno-pharyngodon idella)肝胰脏组织总RNA为模板,RT-PCR扩增获得草鱼HSP70基因cDNA部分序列,并进行了组织表达差异性研究。结果显示:所获为序列为480 bp,获得GeneBank登陆号为FJ483832。序列测序结果显示,HSP70扩增序列与鲤、斑马鱼、鲋的同源性为:93%、91%、93%。另外,所获序列HSP70在草鱼脂肪、肌肉、肠、脑、粘液、性腺、鳔、肝胰脏、心脏、脾脏、鳃、鳍12个组织的表达存在差异,HSP70在草鱼这12个组织中均检测到表达,其中在鳍中表达最高,极显著高于其他组织(P<0.01);在鳔中表达次之,且与脑、心脏、性腺中表达差异不显著;在粘液中表达最低。     

基因重组草鱼生长激素(r-gGH)对草鱼鱼种生长的促进作用

家蚕多角体病毒表达系统在家蚕体内表达基因重组的草鱼生长激素(r-gGH),具有与天然草鱼生长激素(GH)相似的免疫原性和生物活性。为了节省基因工程研究中的下游工作 (基因产物的分离和提纯),本研究将含有r-gGH的家蚕直接作为饵料源,冻干并磨碎后拌在饵料中投喂草鱼鱼种,通过养殖实验及生化测定分析对比r-gGH促进草鱼鱼种生长的剂量依存关系,筛选活性强的处理剂量和处理时间,期望为鱼类养殖生产提供一种较为经济、来源容易、方法简易而又切实可行的促进鱼种生长并且可以大规模应用的方式。实验结果表明,投喂含有r-gGH的家蚕,有相当一部分被鱼体消化道吸收,进入血液循环。投喂2 h和6 h 后,草鱼鱼种的血清GH水平均显著高于对照组(投喂基本饲料)和投喂正常家蚕组;每天投喂和隔2天投喂,均使草鱼鱼种的血清GH水平显著升高,并对草鱼鱼种生长都有明显的促进作用。短期(3 d)和长期(42 d)投喂含有r-gGH 的家蚕,无论是低剂量(10 mg·g^-1饲料)还是高剂量(20 mg·g^-1饲料),均极其显著地提高草鱼鱼种的血清GH水平;长期(42 d)投喂亦对草鱼鱼种的生长有显著的促进作用,鱼体的相对体重增长率、相对体长增长率、食物转化率和肥满度显著增加。     

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)成纤维细胞生长因子8的cDNA克隆及特征分析

以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)为实验对象,利用RACE技术克隆了草鱼成纤维细胞成长因子8(Fibro-blast Growth Factor8,FGF8)cDNA序列。实验结果显示,草鱼FGF8 cDNA序列长度为887 bp,其中5′-非翻译区长100 bp,3′-非翻译区长157 bp,开放阅读框(ORF)633 bp,编码210个氨基酸的前体蛋白,包含22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽。利用已知的FGF8序列绘制系统发育树,发现草鱼与两种鲤科鱼(班马鱼、墨西哥脂鲤)聚为一簇,显示亲缘关系很近,而与其它脊椎动物如两栖类、鸟类、哺乳类的亲缘关系则相对较远,这与形态分类学的结果一致。此外,还通过生物信息学分析,揭示了草鱼FGF8的分子结构特征。     

草鱼鱼种对胆碱需要量的研究

用不含胆碱的饲料饲养草鱼鱼种，草鱼鱼种生长减慢，饲料效率降低，肝脏脂肪浸润，血浆总脂，甘油三脂，胆固醇和磷脂含量降低，随着饲料中胆碱含量的添加，草鱼生长和饲料效率改善，肝脏脂肪含量降低，血浆总脂、甘油三脂、胆固醇，磷脂含量回升。当饲料中胆碱添加量达到０．３％以上时，草鱼生长率最高，肝脏脂肪含量，血浆总脂、甘油三脂，胆固醇，磷脂与摄食天然饲料（浮萍）的草鱼基本相同。在本研究条件下，建议草鱼鱼种饲料中     

草鱼胰岛素样生长因子_基因克隆及序列分析

采用逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法,从草鱼肝脏的总ＲＮＡ中扩增出胰岛素样生长因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）基因序列,定向克隆至质粒pUC18,测宇了该基因序列,推导期编码的蛋白序列,克隆的cDNA序列编码包括Ｂ,Ｃ,Ａ,Ｄ和Ｅ五个区域的１７个氨基酸,与鲤ＩＧＦ－Ｉ成熟肽比较,核酸序列和氨基酸序列的同源性分别为９３．８％和９７．１％,E区域分析结果表明,所克隆的草鱼ＩＧＦ－Ｉ序列属于ＩＧＦ－ＩＥa-2亚型。     

草鱼肠道芽孢杆菌的鉴定及产酶能力分析

从100 g左右的健康草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肠道中分离出3株疑似芽孢杆菌(Bacillus)菌株(G1、G2、G3),并通过对其进行生理生化特征、16S rDNA全序列和产酶能力的分析,筛选出1株高产酶能力的益生菌株。结果显示:G1、G2和G3菌株与枯草芽孢杆菌在16S rDNA序列相似性≥99%的水平上聚为同一分支,结合形态观察和生理生化特征,最终鉴定G1、G2和G3菌株均为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);以水解圈直径/菌落直径比值评定了G1、G2和G3菌株的产纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶的能力,其中G1菌株产纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶能力(比值分别为2.9、2.2和3.3)均高于G2、G3菌株,具有作为益生菌的潜力。     

氨对草鱼生长的危害

氨对草鱼生长的危害朱耘，吴圣杰，华丹（中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，无锡２１４０８１）关键词氨，草鱼，生长ＴＨＥＨＡＲＭＦＵＬＥＦＦＥＣＴＯＦＴＨＥＡＭＭＯＮＩＡＯＮＴＨＥＧＲＯＷＴＨＯＦＧＲＡＳＳＣＡＲＰ（ＣＴＥＮＯＰＨＡＲＹＮＧＯＤＯＮＩＤ...     

草鱼蛋白质和脂肪代谢对饥饿胁迫的响应

实验选取平均体质量(31.86±1.47) g的草鱼, 随机分为2个实验组, 对照组(CG)和饥饿组(SG), 每组3个平行, 饥饿处理15、30、45和60 d, 测定饥饿对鱼体的生长、肌肉生化组成、血液生化指标以及蛋白质代谢的影响。结果表明: 饥饿组肥满度、脏体比、肝体比显著低于对照组。随着饥饿时间的延长, 草鱼肌肉中的水分含量逐渐增加, 脂肪和蛋白质含量呈现降低趋势, 脂肪含量在4个时期没有明显的差异(P>0.05), 水分和蛋白质含量分别呈现差异性增加和降低的趋势。血清总蛋白在饥饿15 d时与对照组没有明显的差异(P>0.05), 其后3个时期对照组显著高于饥饿组(P<0.05), 但饥饿组后3个时期趋于稳定。随着饥饿时间的延长, 白蛋白、总胆固醇和甘油三脂含量在4个时期与对照组都有明显变化(P<0.05), 饥饿组呈现先降低后升高再降低的波浪形变化。丙氨酸氨基转移酶活性在15、60 d时与对照组没有明显的变化(P>0.05), 在30 d时先降低, 45 d时显著升高(P<0.05)。随着饥饿时间的延长, 与对照组相比RNA︰DNA在肌肉中没有明显的差异(P>0.05), 在肝胰脏中与对照组呈现显著性差异, 随着时间的延长饥饿组呈现先降低后增高的趋势。谷氨酸脱氢酶活性在肌肉中于饥饿15 d时与对照组没有明显差异(P<0.05), 其后比对照组显著增加, 随着时间的延长饥饿组谷氨酸脱氢酶活性呈现上升的趋势; 在15、45 d时与对照组没有明显的变化(P>0.05), 在30、45 d时显著升高(P<0.05)。肝胰脏中谷氨酸脱氢酶活性在4个时期比对照组有显著的增加; 与肌肉相比, 肝胰脏和血清中谷氨酸脱氢酶活性是一种有效的反应蛋白质代谢的指标。草鱼对体内贮能物质(蛋白质和脂肪)的动用并不是简单地与饥饿时间呈线性相关, 而是出现周期性和阶段性起伏的变化。     

基于稳定同位素的草鱼推水养殖系统食物网的研究

推水养殖系统是集循环养殖、高效集污、生物净化及自动控制等技术为一体的生产方式。但该系统营养物质归趋尚未明晰,造成饵料资源浪费和养殖调控失策。该研究以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)推水养殖系统为实验组,以普通池塘养殖系统为对照组,利用稳定同位素[碳(δ13C)、氮(δ15N)]技术研究两种养殖系统生物食物组成和系统食物网结构。结果表明,草鱼推水养殖系统各生物组分δ13C介于(-25.76±0.23)‰^-22.26±0.20‰,普通池塘系统δ13C介于(-25.83±0.24)‰^-22.38±0.15‰;推水养殖系统各生物组分δ15N介于(6.73±0.08)‰^12.34±0.11‰,普通池塘系统δ15N介于(6.73±0.08)‰^12.14±0.11‰。稳定同位素混合模型分析结果显示,两组系统中草鱼饲料和底泥碎屑是消费者的主要食物来源。其中,草鱼的主要食物来源是草鱼饲料,鳙(Aristichthys nobilis)的主要食物来源是草鱼饲料、大型浮游动物,鲫(Carassius auratus)的主要食物来源是底泥碎屑,底泥碎屑的主要来源是草鱼饲料。推水养殖系统草鱼饲料对草鱼的食物组成贡献率高于普通池塘系统。因此,采用推水养殖模式,可促进养殖生物对饲料的摄食,提高饲料利用效率。     

草鱼肾细胞中双氟沙星代谢酶的酶动学

细胞色素P450s(CYPs)主要参与动物体内药物代谢。水产养殖中不合理的联合用药常会导致治疗失败,这通常与CYP活性的诱导有关。然而,关于鱼类CYP的诱导却知之甚少。为获得有关CYP诱导的信息,实验采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)的方法测定了草鱼肾细胞(CIK)中CYPs的特异性诱导剂对双氟沙星(DIF)的代谢作用及酶动学分析。对照组和β-萘黄酮(BNF)诱导组的酶动学方程分别为1/V=0.1375×1/[S]+0.003和1/V=0.0245×1/[S]+0.0013。DIF与经BNF处理的CIK共孵育后,其代谢量增加了1倍,酶动学参数Clint和Vmax值分别增加了7倍和2倍。BNF是CYP1A的特异性诱导剂,因此,CYP1A可能参与了DIF的代谢。