溶藻弧菌生物膜研究进展

溶藻弧菌是一种海洋和海洋生物中普遍存在的致病菌,能够感染人类和多种水产品.细菌粘附在介质表面,分泌胞外基质将自身包裹其中从而形成生物膜,具有极高的抗药性和免疫逃逸能力,人类许多细菌感染均与生物膜有关.就溶藻弧菌生物膜进行综述,为相关研究提供理论参考.     

五味子和黄精对副溶血弧菌及其生物膜的体外抑制作用

采用琼脂扩散法,分别测定五味子(Shisandra chinensis)、黄精(Polygonatum sibiricum)对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的体外抑菌作用;选用倍比稀释法确定五味子、黄精对副溶血弧菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC);采用改良微孔板法(MTT)评价两种中草药液对溶藻弧菌生物膜形成的影响。结果表明,两种中草药都有不同程度的抑制副溶血弧菌的作用,五味子对副溶血弧菌的抑菌圈直径为18.67(±0.2)mm,MIC为1.56 mg/m L,MBC为3.125 mg/m L;黄精的抑菌圈直径为11.26(±0.6)mm,MIC和MBC分别为1.56、3.125 mg/m L。当药物浓度达到3.125 mg/m L以上时,五味子和黄精对副溶血弧菌生物膜的形成有极显著抑制作用。     

大黄和公丁香对致病性哈氏弧菌及其生物膜的体外抑制作用

[目的]观察大黄（Rheum officinale）和公丁香（Flos caryophylli对哈氏弧菌（Vibrio harveyi）及其生物膜（Biofilm）的体外抑制作用.[方法]采用琼脂扩散法测定大黄和公丁香对哈氏弧菌的体外抑菌作用;采用倍比稀释法测定大黄和公丁香对哈氏弧菌最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）;采用MTT法评价2种中草药液对哈氏弧菌生物膜形成的影响.[结果]大黄对哈氏弧菌的抑菌圈直径为（15.31±0.4）mm,MIC和MBC均为7.813 mg/m1;公丁香对哈氏弧菌的抑菌圈直径为（11.53±0.6）mm,MIC和MBC分别为15.625和62.5 mg/ml;2种中草药液浓度分别在7.81和0.97 mg/ml以上时对生物膜的形成有极显著抑制作用（P＜0.01）.[结论]大黄和公丁香对哈氏弧菌及其生物膜均有明显抑制作用,其中大黄的作用比公丁香更强.     

黄姑鱼源溶藻弧菌的分离鉴定

2013年8月,罗源湾鸟屿海区网箱养殖黄姑鱼发生死亡事件。病鱼体表无明显异常,肝脏有点状出血,肾、脾略微重大,胃肿大明显,肠空。采用生理生化指标鉴定及16S rDNA系列同源性分析和系统发育树构建等方法,对从病鱼脾脏分离获得的优势菌株进行了鉴定。其生理生化指标符合溶藻弧菌特点,GenBank中同源序列比对结果显示,该菌与溶藻弧菌的16S rDNA序列同源性高达99.0%,系统进化树中与溶藻弧菌自然聚为一支。药敏实验结果表明:该菌对恩诺沙星等5种抗生素敏感。     

广州市售水产品副溶血弧菌和溶藻弧菌的耐药性评估

[目的]研究广州市售水产品中副溶血弧菌和溶藻弧菌的耐药性情况。[方法]采用Kirby-Bauer纸片扩散法检测从水产品中分离的87株副溶血弧菌和118株溶藻弧菌对水产养殖业中常用的18种抗生素的耐药情况。[结果]水产品中的副溶血弧菌和溶藻弧菌均对万古霉素、克林霉素以及青霉素类抗生素有明显抗性,多重耐药比例达100%,溶藻弧菌的多重耐受现象较为突出。[结论]广州市售水产品中的副溶血弧菌和溶藻弧菌具有多种抗生素抗性,且多重耐药情况突出。     

溶藻弧菌对水产动物致病性及其防治的研究进展

溶藻弧菌是一种常见的海洋伺机性病原体,是引起人类、水生动物细菌性疾病的重要病原之一。与其它病原微生物一样,弧菌的致病性与其产生的多种毒力因子息息相关,毒力基因是产生各种毒力因子的物质基础。本文对溶藻弧菌的病原学、致病机理及其防治等方面的最新研究成果进行了综述。     

溶藻弧菌疫苗对牙鲆免疫效果的研究

利用福尔马林灭活法制备了溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)疫苗,腹腔注射接种牙鲆(Paralichthys olivaceus),在以牙鲆血清为抗原制备兔抗鱼血清多克隆抗体的基础上,采用ELISA方法检测了接种疫苗后鱼血清中特异性抗体的变化;此外通过攻毒实验测定了疫苗对牙鲆的保护率。ELISA检测结果表明在接种疫苗后第7d抗体效价为1:64,在免疫后第7~8周达到最高抗体效价1:2048;攻毒实验结果显示受免鱼对溶藻弧菌的免疫保护率为73.3%,且溶藻弧菌疫苗对鳗弧菌(Vibrio anguillarium)、副溶血弧菌(Vibrio prarhaemolyticus)也具有一定的免疫保护性,其免疫保护率分别为56.25%、64.71%。     

溶藻弧菌疫苗对黑鲷的免疫效果研究

用溶藻弧菌1.1587制备全细胞、全细胞 弗氏完全佐剂(FCA)、脂多糖(LPS)3种疫苗,疫苗经腹腔对黑鲷进行免疫注射,分别在第7、14、28、56 d采鱼血,检测抗体效价、白细胞吞噬活力、溶菌酶活力、SOD活力和抗菌活力;第28 d用5.5×108 cfu/mL的溶藻弧菌悬液进行攻毒试验来比较疫苗的免疫效果. 结果表明:抗体凝集效价在28 d达到最高值,免疫组2显著高于免疫组1和免疫组3(P《0.05);白细胞吞噬百分数和吞噬指数28 d达到最高值,3个免疫组都显著高于对照组(P《0.05);免疫组1和免疫组2溶菌酶活力在28 d达到最高值,显著高于对照组(P《0.05);SOD活力在28 d达到最高值,免疫组1和免疫组2显著高于对照组(P《0.05). 3种疫苗对黑鲷攻毒后20 d的免疫保护率分别为71.4%、85.7%、71.4%. 全细胞-FCA疫苗对黑鲷的免疫效果最好.     

两个溶藻弧菌胞外多糖合成基因簇的生物信息学分析

溶藻弧菌是我国南方海水养殖最重要的病原菌之一。胞外多糖(EPSs)是细菌产生的一类具有复杂结构的多糖类物质,影响其致病性和环境适应力。基因组分析发现溶藻弧菌ZJ-51存在4个与胞外多糖合成有关的基因簇,笔者对其中2个基因簇CPS1357和CPS4543进行了生物信息学分析和实验验证。结果表明,基因簇CPS4543编码3个多糖外膜转运体系的同源蛋白Wza-Wzb-Wzc,而CPS1357编码的17个蛋白与多糖合成、转运以及调控有关。但通过染色实验、菌落形态观察和运动性分析证实这2个基因簇的缺失并不影响EPSs的合成、生物膜的形成、菌落形态及运动性。这可能是这2个基因簇在当前测试条件下受到抑制或需要特殊的环境因子诱导表达,对溶藻弧菌EPSs合成调控机制的研究,能更好地了解该病原菌在环境中的适应性。     

溶藻弧菌感染对剑尾鱼HSP70基因表达的影响

用溶藻弧菌Vibrio alginolyticus感染剑尾鱼Xiphophorus helleri,取感染后第0、2、5、8、11 d的活鱼及感染后第2 d濒死鱼,采用半定量RT-PCR方法分别检测HSP70基因在肝胰脏、脾脏、头肾和心脏组织中的表达。结果表明:正常条件下,HSP70在检测的剑尾鱼组织中均不表达;在用溶藻弧菌感染第8 d的剑尾鱼肝胰脏内,HSP70基因被诱导强烈表达,HSP70/β-actin的值为1.80±0.03;在感染第2、5 d的剑尾鱼头肾内,HSP70基因被诱导表达,第8 d HSP70基因强烈表达,感染濒死鱼头肾内也检测到HSP70基因的强烈表达,HSP70/β-actin的值分别为0.35±0.02、0.15±0.01、2.00±0.06和0.95±0.05;在剑尾鱼被感染第2、5、8 d,在脾脏内均检测到HSP70基因的表达,感染濒死鱼脾脏内也检测到HSP70基因的强烈表达,HSP70/β-actin的值分别为0.30±0.02、0.15±0.01、0.45±0.03和1.55±0.04;仅在感染濒死鱼的心脏中检测到HSP70基因的表达,HSP70/β-actin的值为0.30±0.02;到第11 d HSP70基因表达消失。     

溶藻弧菌对华贵栉孔扇贝体内几种酶活性的影响

对华贵栉孔扇贝（Chlamys nobilis）注射不同密度的溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）,于注射后6,12,18,48,72h测定体内过氧化氢酶（CAT）、超氧化物岐化酶（SOD）、碱性磷酸酶（ALP）和酸性磷酸酶（ACP）的活力。结果表明：5×107cell.mL-1,5×108cell.mL-1组血淋巴中CAT活性均有升高趋势,其中5×108cell.mL-1组在18h极显著增加（P≤0.01）,24h显著增加（P≤0.05）。5×108cell.mL-1组SOD活性最初表现为抑制,在12h和18h显著低于对照组（P≤0.05）,24h后明显升高,5×107cell.mL-1组与对照组相比差异不明显。肝脏中ALP活性在18h与对照组相比,5×108cell.mL-1组极显著升高（P≤0.01）,5×107cell.mL-1组显著升高（P≤0.05）。注射后ACP活性有明显升高的趋势,5×108cell.mL-1组在12h和18h显著高于对照组（P≤0.05）,且在注射后24h5×107cell.mL-1,5×108cell.mL-1组活性均达到最高。     

大黄鱼溶藻弧菌外膜蛋白ISCOMs的免疫效果初步研究

以溶藻弧菌外膜蛋白为模式抗原,制备其ISCOMs,免疫大黄鱼,进行安全和免疫力试验测定,结果显示溶藻弧菌外膜蛋白ISCOMs安全、纯净;免疫组菌体凝集效价比对照组高,但免疫组个体间有差异,而免疫组的血清ELISA抗体水平明显高于对照组;攻毒试验组（O．3×10^7个·尾^-1）存活率可达100％,对照组（0．3×10^7个·尾^-1）存活率为20％;试验表明溶藻弧菌外膜蛋白ISCOMs安全,免疫大黄鱼后可产生免疫保护力。     

溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统vscC基因缺失株的构建

[目的]构建未引入任何遗传标记物的溶藻弧菌vscC基因框内缺失突变株。[方法]首先以溶藻弧菌ZJ51-O基因组DNA为模板,用重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)扩增法构建体外vscC基因缺失片段;扩增产物经酶切后连接至自杀质粒pDM4,再转化入大肠杆菌SY327进行克隆,筛选阳性克隆子并进行PCR分析鉴定;提取阳性克隆子的自杀重组质粒pDM4-△vscC,用热休克法将其转入到大肠杆菌S17-1中,再经接合生殖的方式将自杀重组质粒导入溶藻弧菌ZJ51-O菌株中,利用抗生素筛选策略与蔗糖反向筛选系统,挑选疑似目的突变菌株,最后利用PCR鉴定与测序分析进行确证。[结果]溶藻弧菌ZJ51-O的vscC基因框内缺失突变株构建成功。[结论]该研究为进一步研究vscC基因的功能和T3SS在溶藻弧菌致病过程中所起的作用奠定基础,同时也为溶藻弧菌的其他基因突变株的构建和研究提供了参考和试验经验。     

溶藻弧菌在海水长期饥饿胁迫下的活性分析及菌落相变特征

选取3株具有相变特征的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)ZJ-51、E324和E381进行海水长期饥饿培养,测试每毫升可培养细菌数量变化,光学显微镜下菌落相变特征,扫描电子显微镜菌体形态观察与饥饿胁迫前后菌株对卤虫(Artemia salina)的毒力对比。结果发现,饥饿培养的细菌活性可分为3个时期:1~5 d为上升期,每毫升海水中可培养细菌数增加并达到最高,菌落表型无显著变化;中期为下降期(5~40 d),细菌数量急剧下降,部分菌体的运动环皱缩;41 d后进入平台期,各菌株在海水中的数量保持在103~104cfu·m L-1,经500 d培养,可培养细菌数仍高达103cfu·m L-1,平板上出现一种极小的菌落。扫描电镜发现,130 d饥饿胁迫后多数细胞变为圆球状,部分形成超长的长杆状,或产生成团的絮状物。卤虫致死效应结果显示,多数菌株在饥饿胁迫500 d后的致死率约下降50%。以上结果为解释溶藻弧菌在寡营养海水中的生存策略提供了重要线索。     

绿海龟源溶藻弧菌的分离鉴定及药敏分析

【目的】腐皮病是绿海龟(Chelonia mydas)龟苗培育中的常见病,传染性极强,发病率和死亡率高。为确定病因及治疗方法,从病龟鳍状肢的腐皮组织中分离病原菌。【方法】从症状明显的稚龟四肢病灶中分离纯化得到疑似病原菌,编号CMRT91026,开展形态特征、生理生化特性、16SrRNA鉴定和系统发育树构建及相关药物敏感试验。【结果】该菌能在TCBS培养基上生长,菌落呈黄色,为革兰氏阴性短杆菌;在1%NaCl葡萄糖磷酸盐胨水、蔗糖、甘露糖和赖氨酸脱羧酶上的生化特性均显示阳性,并且在3%～10%NaCl胨水均能生长;与NCBI上的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)同源性达100%。药敏结果显示,该菌对恩诺沙星、萘啶酸、左氧氟沙星、米诺环素、头孢吡肟和头孢曲松敏感;对多西环素、氟苯尼考、妥布霉素、大观霉素、诺氟沙星和氨曲南呈中介;对新霉素、复方新诺明、阿莫西林、庆大霉素、丁胺卡那霉素等15种药物有耐药性。【结论】该菌株鉴定为溶藻弧菌,对喹诺酮类药物(如恩诺沙星)、四环素类药物(如米诺环素)及头孢类(如头孢曲松)等药物较为敏感。试验结果为绿海龟稚龟溶藻弧菌病的诊断及病害防控提供了一定参考。