新疆南疆地区牛乳头瘤病毒1型L1基因克隆及原核表达

本研究以构建牛乳头瘤病毒1型L1基因原核表达系统pET32a-L1及表达牛乳头瘤病毒1型L1蛋白为目的,为进一步制备基因工程疫苗奠定基础.从牛体表赘生瘤组织中提取DNA,PCR扩增L1基因片段,克隆至pGM-T载体.测序成功后将目的片段和表达载体经双酶切连接于表达载体pET32a中,并构建重组质粒pET32a-L1.重...     

PPRV中国新疆南疆株F基因遗传演化分析

【目的】分析中国新疆南疆2014年PPRV毒株来源,为中国新疆南疆PPR防控提供理论依据。【方法】调查中国新疆南疆阿克苏地区某羊场发病羊发病情况、临床症状观察及病理学检查,实验室进行PPRV F基因RT-PCR和F基因测序,进一步对PPRV F基因序列分析。【结果】毒株与国内PPRV毒株F基因核苷酸同源性最高的是中国新疆China/XJYL/2013毒株,与国外的毒株F基因核苷酸同源性最高的是印度Izatnagar/94毒株及Izatnagar-94毒株;此次毒株与国内PPRV毒株F蛋白氨基酸同源性最高的是中国新疆China/XJYL/2013毒株,与国外的PPRV毒株F蛋白氨基酸同源性最高的是印度Izatnagar/94毒株。PPRV毒株F基因进化树分析显示:PPRV毒株与北京PPRV毒株进化关系最近,与中国新疆伊犁PPRV毒株同属一个分支,与国外印度及孟加拉国毒株的进化关系较近。【结论】2014年中国新疆南疆存在PPR疫情,该疫情毒株与此次疫情前后国内的PPR毒株及印度PPR毒株进化关系较近。     

广西黄牛乳头状瘤病毒的鉴定及其基因组序列分析

[目的]明确广西黄牛是否存在牛乳头状瘤病毒(Bovine papillomavirus,BPV)感染,为今后制定科学的防控措施提供参考依据.[方法]从广西隆安县某黄牛养殖场青年黄牛的皮肤上采集瘤状物病料,在临床观察和组织病理学观察的基础上,采用PCR对其进行鉴定和基因型分型,再根据鉴型结果设计5对特异性引物对BPV基因组进行扩增及测序分析.[结果]黄牛皮肤瘤状物的病理组织切片观察发现,表皮与真皮增生,表皮细胞角质化和空泡化,细胞呈梭形或星形.从瘤状物中分离获得1株毒株,其与BPV-1型的同源性达99.0%,命名为BPV-GX-LA150909.BPV-GX-LA150909毒株基因组全长7946 bp,GenBank登录号为MF435918,包含早期基因区(E区)、晚期基因区(L区)和非编码区(NCR区)3个区域.BPV-GX-LA150909毒株无论是其基因组还是L1基因,均与BPV-1型的同源性最高,尤其与贵州株BPV-1 GZLZ的同源性分别为99.9%和99.7%,且在系统发育进化树上也是与BPV-1 GZLZ的遗传距离较近.BPV-GX-LA150909毒株的L1蛋白具有潜在的B细胞抗原表位,含有17个O-糖基化位点和1个N-糖基化位点.[结论]广西黄牛群中已存在BPV-1型感染,且与国内外BPV-1型的同源性较高,说明BPV跨地区传播是不可忽视的问题.     

新疆南疆猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株分型鉴定

了解新疆南疆PRRSV毒株类型,为新疆南疆PRRS防制疫苗的选择和防制措施的制定提供理论依据。本实验利用可同时扩增PRRSV欧洲型和美洲型毒株的ORF7基因特异性引物,进行RT-PCR、克隆、测序及序列分析。结果显示:本研究获得的14个ORF7基因片段不存在类似欧洲型代表株LV的9个核苷酸缺失,进化树显示均与国内外的美洲型代表株在同一分支内,其中XJNJ-5-2和XJNJ-5-3株与高致病性代表株JXA1在同一个小的分支内。结论为本实验未检测到欧洲型毒株,获得了14个美洲型毒株,其中有2株属于高致病性毒株。利用新疆南疆PRRSV分子流行病学调查结果,对新疆南疆PRRS的防制具有现实意义。     

新疆南疆微小牛蜱Bm91基因的克隆及鉴定

试验参照GenBank登录的微小牛蜱Bm91基因序列,设计了可以扩增Bm91基因完整阅读框的引物,对新疆南疆微小牛蜱进行总RNA提取、RT-PCR、克隆、测序和序列分析。结果表明:获得的Bm91基因长1 833 bp,与GenBank中登录号为U62809和HM622263的微小牛蜱Bm91基因核苷酸同源性为98%和97%,且为一个完整的开放阅读框。新疆南疆微小牛蜱Bm91基因的正确获得,为基因工程疫苗候选抗原的获得和中国抗微小牛蜱疫苗的制备奠定基础。     

猪细小病毒SY-99株非结构蛋白NS1基因的克隆与原核表达

 根据猪细小病毒 (porcineparvovirus ,PPV)NADL 2株非结构蛋白基因NS1序列设计引物 ,扩增出了PPVSY 99株的NS1基因 ,将其克隆到原核表达载体pET2 8a中 ,得到重组质粒SYNS1/pET2 8a。将SYNS1/pET2 8a转化到大肠杆菌BL2 1(DE3)中 ,经IPTG诱导 ,使PPVNS1基因获得了表达 ,运用ELISA和Westernblotting证实了表达产物的特异性。经表达产物细胞定位分析 ,表达的NS1蛋白是以包涵体的形式存在于大肠杆菌中。通过改变诱导时间或诱导剂IPTG的浓度 ,确定了表达NS1蛋白的最佳诱导条件 :IPTG终浓度为 0 .6mmol·L-1,诱导时间为 3h ,在大肠杆菌中最高表达含量为 17.8%。亲和层析后 ,得到了纯化的NS1蛋白 ,在Westernblotting检测中 ,纯化蛋白大大降低了反应背景。表达的NS1蛋白可作为免疫诊断试剂来检测PPV的发生 ,而且还可用于鉴别灭活疫苗免疫猪和自然感染猪     

猪流行性腹泻病毒湖北株的分离鉴定及其s1基因进化分析

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是猪的肠道传染病病原,主要引起仔猪呕吐、腹泻和脱水,对一周龄内的哺乳仔猪危害最为严重,死亡率可达50%~100%。利用Vero86细胞从湖北某猪场腹泻仔猪小肠病料中分离到一株病毒,经RT-PCR检测、序列比对后确定其为PEDV,命名为HB201503株。设计PEDV s1基因的全长扩增引物,获得该株病毒的s1基因全长序列并进行了进化分析,结果表明该毒株与近年来在Gen Bank登陆的PEDV s1基因核苷酸序列相似性在91.4%~99.2%,与疫苗株CV777相似性较低,仅为91.8%。通过s1基因进化树分析表明HB201503以及近几年国内分离毒株主要集中在第I个亚群,且HB201503株与KM406183(2014,四川)和KM609206(2015,江苏)同源性较高。此外,s1蛋白氨基酸序列比对显示,HB201503与近几年分离毒株及疫苗株CV777均在55-74、157-163位氨基酸出现了连续4个以上氨基酸的缺失或替换,而且HB201503株与CV777及近几年分离毒株相比,还在270-283位氨基酸上出现了1个氨基酸的缺失和10个氨基酸的替换。     

牛乳头瘤病毒2型L1基因真核表达载体的构建及真核表达

为在真核细胞中表达牛乳头瘤病毒2型(BPV2)衣壳蛋白L1基因。采用PCR方法从奶牛皮肤肿瘤病料中扩增BPV2沙湾分离株L1基因,克隆入pMD18-T载体中,测序后进行序列分析。以pcDNA 3.1(+)为真核表达载体构建重组表达质粒,转染入BHK-21细胞,通过间接荧光免疫试验检测BPV2-L1蛋白的表达。本研究成功构建pcDNA3.1(+)-BPV2-L1重组真核表达质粒,证实能表达出BPV2-L1蛋白,为BPV2DNA疫苗的研发提供了前期基础。     

雏番鸭胰腺型鸭1型甲肝病毒分离鉴定及VP1基因分析

采集自胰腺发黄或出血的雏番鸭病料经RT-PCR检测为鸭1型甲肝病毒阳性后,接种11日龄非免疫番鸭胚获得一株病毒(命名为MPZJ1206)。该株病毒在不同温度下均不凝集鸡、鸭和绵羊红细胞;鸭胚中和试验表明蚀斑纯化毒可被经典的鸭1型甲肝病毒高免血清特异性所中和。该株病毒对7日龄雏番鸭的致死率为38.5%,病死鸭剖检病变与临床发病鸭相同,且从病死鸭脏器中回收分离到的病毒经鉴定仍为鸭1型甲肝病毒。应用鸭1型甲肝病毒VP1基因特异性引物从该株病毒克隆获得的714bp的基因片段,与经典鸭1型甲肝病毒分离株Du/CH/LGD/111239VP1基因的同源性最高,为99.1%,经遗传进化分析表明该株病毒属鸭1型甲肝病毒谱系。以上结果表明,雏番鸭胰腺炎是由鸭1型甲肝病毒感染所致,这一新病型明显不同于经典的鸭1型甲肝病毒感染引起的肝脏出血,鉴于此,建议将本试验分离株命名为胰腺型鸭1型甲肝病毒。     

牛分枝杆菌广西分离株ESAT-6基因鉴定及遗传进化分析

根据GenBank中牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis,M.bovis）的ESAT-6基因序列（No：BX248347）设计1对引物,PCR扩增获得2株牛分枝杆菌广西分离株（mt359、mt370）,纯化产物与pMD18-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α,对经双酶切和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序及同源性比较分析。结果表明,牛分枝杆菌广西分离株mt359、mt370与GenBank中已发表的6株毒株（5株结核分枝杆菌和1株牛分枝杆菌）的核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性均为100.0%,与牛分枝杆菌标准株C680001的核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性均为96.6%。说明致病性牛分枝杆菌的ESAT-6基因十分保守,不存在种间差异。     

一株牛流行热病毒的分离与鉴定

牛流行热病毒(BFFV)是引发世界范围内牛流行热最主要病原之一,给奶牛业的发展造成严重危害。本研究通过RT-PCR对疑似牛流行热奶牛抗凝血样品进行检测,选取阳性样品颅内接种3日龄乳鼠,7日后乳鼠死亡,鼠脑组织通过PCR扩增出BFFV目的条带,乳鼠颅内重复接种3次,乳鼠发病死亡时间明显提前。选取阳性脑组织接种BHK-21细胞,盲传3代后出现明显细胞病变,特异性引物扩增获得目的条带,测序结果与牛流行热病毒序列一致,表明成功分离到一株牛流行热病毒。     

猪圆环病毒2型贵州株ORF1基因的生物信息学分析

为了解猪圆环病毒2型贵州株(PCV2-GZ)ORF1基因的生物学特性,针对ORF1基因设计1对特异性引物,取PCV2阳性病料DNA为模板进行PCR扩增,克隆测序后进行生物信息学分析。结果表明:PCV2-GZ ORF1基因序列与GenBank登录的14株PCV2(06-06274,CC1,HUB-5,HUN-11,JX-1,LN-3,P710-1,PCV2HERD D,SC-10,SVP-321,SX-1,VOS 2689006,ZJ-38,N1)相应序列核苷酸的同源性为96.8%~99.7%,与国内HUB-5和ZJ-38的同源性最高,均为99.7%;PCV2-GZ编码的Rep蛋白与P710-1、HUB-5、SC-10、ZJ-38株的氨基酸序列同源性较高,均为99.4%。PCV2-GZ Rep蛋白可形成优势抗原表位,且不存在跨膜结构和信号肽,推测可进行PCV2 ORF1基因的全基因表达。     

牛病毒性腹泻病毒山东株的分离与鉴定

牛病毒性腹泻病毒是牛病毒性腹泻-黏膜病的重要病原体,该病毒病是极为复杂、呈多临床类型表现的传染病,给世界养牛业造成了巨大的经济损失。本研究从疑似牛病毒性腹泻-黏膜病的粪便中分离得到一株病毒能使MDBK细胞产生细胞病变,经RT-PCR检测及扩增产物测序进一步证实,该病毒为牛病毒性腹泻-黏膜病病毒,TCID50测定该病毒的滴度为107.15TCID50/ml。该病毒株的分离鉴定为牛病毒性腹泻病毒疫苗的研制奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒地方株的分离与鉴定

从河南省不同地区规模化肉牛场牛病毒性腹泻 (BVD)疑似病例中采集病料 ,将处理好的 6份病料接种MDBK细胞 ,并盲传 4代 ,得到了 2株可产生细胞病变的病毒。 2株病毒的TCID50 分别为 10 - 5.59和 10 - 5.51;琼脂扩散试验表明 ,2株病毒均能与牛病毒性腹泻病毒 (BVDV)OregonC2 4 标准阳性血清反应 ,出现沉淀线 ;中和试验表明 ,2株病毒均能被BVDV标准阳性血清中和 ,中和指数分别为 10 3.30 和 10 3.16 ;电镜观察到圆形 ,直径为 4 0～ 6 0nm ,有囊膜 ,囊膜表面有突起的病毒粒子 ,与BVDV颗粒基本一致。因此 ,确定分离的 2株病毒均为BVDV ,分别将其命名为HN - 1株和HN - 2株。     

中国东北地区3株日本脑炎病毒株的分离鉴定及基因分型

从黑龙江省某3个猪场采集疑似为日本脑炎病毒感染的病、死猪的脏器以及全血,进行病毒的细胞培养,蚀斑纯化,间接免疫荧光试验,电镜下观察病毒粒子的形态,及RT—PCR检测。结果显示,盲传三代后,出现明显的细胞病变（CPE＋～CPE＋＋＋）;荧光显微镜下细胞胞质内呈现不同强度的绿色荧光信号;电镜下的病毒粒子为40-60nm的球型粒子;PCR检测为日本脑炎病毒阳性。通过对3株分离株腑扩增序列比较,此3株分离株为基因Ⅲ型。     

PCV-2新疆南疆株ORF2基因序列分析

[目的]明确新疆南疆地区养殖猪群中是否存在PCV-2感染及感染的PCV-2ORF2基因特征.[方法]根据GenBank登录的PCV-2基因序列,设计合成1对引物,针对新疆南疆地区疑似PCV-2感染病例进行ORF2基因PCR扩增、电泳分析、胶回收、测序及序列分析.[结果]PCV-2-XJ株ORF2基因长为702 bp,编码233个氨基酸,与国内外参考毒株核苷酸同源性为89.7;～96.6;,与国内外参考毒株氨基酸同源性为87.6;～95.7;,与中国大多数毒株在一个进化分支内,氨基酸序列一些区域或位点发生了变异.[结论]新疆南疆存在猪感染PCV-2,PCV-2-XJ株ORF2基因序列与中国目前存在的多数毒株相近.     

中国东北地区3株日本脑炎病毒株的分离鉴定及基因分型

从黑龙江省某3个猪场采集疑似为日本脑炎病毒感染的病、死猪的脏器以及全血,进行病毒的细胞培养,蚀斑纯化,间接免疫荧光试验,电镜下观察病毒粒子的形态,及RT-PCR检测。结果显示,盲传三代后,出现明显的细胞病变(CPE+~CPE+++);荧光显微镜下细胞胞质内呈现不同强度的绿色荧光信号;电镜下的病毒粒子为40~60nm的球型粒子;PCR检测为日本脑炎病毒阳性。通过对3株分离株Prm扩增序列比较,此3株分离株为基因Ⅲ型。     

1株鹅细小病毒的分离鉴定及致病特性、VP基因特征分析

为了解鹅细小病毒(GPV)在河北省的流行情况及分子遗传特征,对临床发病承德白鹅疑似小鹅瘟病料进行病毒分离鉴定及致病性、VP基因特征研究。结果显示,从病料中分离到1株GPV;人工感染6日龄雏鹅,感染后96 h全部死亡,临床症状和剖检变化与发病鹅相似;将测序序列拼接后得到VP基因片段,长度为2 475 bp,包含VP1、VP2、VP3等3个开放阅读框,根据遗传进化分析和同源性分析结果发现,分离到的GPV(HB株)处于Ⅰb亚洲群;HB株与GPV各毒株VP基因相似性在96.6%～99.7%,其中与SHFX1201、Y株的氨基酸相似性最高,达99.7%。以上结果表明,HB株与国内分离GPV毒株之间差异较小,在分子生物学上证明了GPV只有1个血清型的观点。     

鹅副粘病毒LS-1株的分离鉴定及F基因分析

从山东省梁山县疑似鹅副粘病毒感染的病死鹅中分离到1株LS-1病毒株,经血凝和血凝抑制试验,证实该毒株为禽1型副粘病毒.毒力测定结果表明,该病毒对鸡胚平均致死时间(MDT)为39.5 h;1日龄无特定病原体(SPF)鸡脑内接种分离病毒的致病指数(ICPI)为1.76;6周龄SPF鸡静脉接种致病指数(IVPI)为2.42.序列测定结果表明LS-1株F基因核苷酸长度为1 653 bp,编码为551个氨基酸,有6个糖基化位点,其裂解位点的氨基酸序列为112-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Phe-117,与已公布的强毒株裂解位点的氨基酸序列相符.同源性分析表明,该毒株F基因与目前已公布的鹅副粘病毒F基因核苷酸同源性在87.0%~98.4%之间,推导的氨基酸序列同源性在87.0%~98.5%之间.