以质粒载体构建土壤宏基因组文库的研究

从土壤中提取土壤总DNA,切割成一定长度的DNA片段并连接到载体上,然后转化宿主菌,形成一个重组DNA文库即宏基因组（metagenome）文库.目前对宏基因组的研究在国际上是土壤微生物学研究的前沿领域和热点.文库构建后可以根据宿主细菌获得的功能筛选相应的克隆;也可以用已知的探针分离目的基因片段,加上表达调控元件后获取活性产物,所以通过宏基因组文库可以规避微生物培养的限制而寻找新的功能基因或者直接筛选活性物质;在早期宏基因组还被用来研究土壤微生物的遗传多样性.因此构建宏基因组文库是研究微生物分子生态学和开发微生物资源的强有力工具.本研究从土壤中直接分离DNA,部分酶切后分别回收2～6kb和6～9kb片段,然后分别与pUC19质粒载体连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α构建了土壤宏基因组文库,实验中比较了不同DNA片段长度和不同的转化方法对文库构建的影响.     

宏基因组漆酶基因片段的克隆与分析

漆酶(Laccase,EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶,能够有效降解木质素物质,在环境碳素循环中占有重要的地位。近年来以环境宏基因组DNA为模板,设计简并引物及PCR扩增方法研究环境微生物基因来监测环境微生物已成为土壤微生物多样性研究的新方法[1]。如Luis等[2]通过对森林土壤微生物中漆酶基因的研究来监测该地区的微生物多样性;Lyons等[3]通过对高盐度沼泽地土壤微生物中漆酶基因的研究来监测该地区的微生物多样性;张桂敏等[4]通过对土壤微生物中木聚糖酶基因的研究来监测该地区的微生物多样性。但是,国内尚无研究环境微生物漆酶基因多样性及监测环境微生物功能的报道。同时漆酶在化工染料     

宏基因组文库中的组成型启动子在大肠杆菌中的克隆

启动子是决定基因表达水平的重要因素之一。组成型表达启动子被认为是工业上表达重要蛋白质的理想启动子。本研究利用蔗糖为唯一碳源的基本培养基对榨糖废水浸润的土壤微生物宏基因组文库进行筛选,获得两个阳性克隆。对其中一个克隆的柯斯质粒进行亚克隆,利用在线启动子预测和序列比对工具对其中一个亚克隆子进行分析,获得一个启动子序列。然后,利用PCR方法将该启动子和地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶基因一起克隆到T载体上。结果表明该启动子在不加诱导剂的条件下能够在大肠杆菌中启动外源基因的高效表达。本研究结果为在生物领域中组成型启动子的应用研究提供了基础。     

基于宏基因组茉莉花植株土壤细菌多样性研究

土壤微生物多样性是反映土壤质量的重要指标,本研究利用16S r RNA高通量测序技术对茉莉花(Jasminum sambac Ait)植株土壤细菌组成进行测定,分析不同月份的细菌群落结构差异,探究细菌多样性与土壤理化性质关系。研究结果表明,茉莉花植株土壤中细菌多样性丰富,包括41个门、98个纲、225个目、427个科和799个属,其中变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)是土壤样品中细菌物种丰度较高的6个门类。五个月份土壤中变形菌门均是丰度最高(22.0%~28.4%)的门类,酸杆菌门在6月份土壤中的丰度最低(11.7%),表明该月份土壤质量最好。10月份土壤样本细菌多样性指数Shannon指数最高(6.9264)、Simpson指数最小(0.002901),表明该月份土壤细菌群落多样性最高,说明低温有利于提高土壤微生物多样性。聚类和主成分分析结果表明,7、8和9月份三个月份土壤的细菌群落构成相似度高,而6月或10月与其他月份群落构成差异大。冗余分析和热图分析结果表明,土壤p H值、有机质、总氮、碱解氮、总磷、速效磷、总钾和速效钾对微生物群落组成有显著影响,其中土壤p H值、总磷和速效钾为最主要的影响因子;而且,厚壁菌门、放线菌门和绿弯菌门与土壤p H值、有机质、总氮、碱解氮、总磷和总钾呈正相关。本研究结果将为茉莉花的花期田间管理和土壤生态平衡保持提供理论参考。     

宏基因组中不依赖辅酶B12甘油脱水酶基因的筛选和表达

通过特定的引物,以土壤宏基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增获得3．3kb的DNA片段,该片段连接于pSE380载体构建重组质粒pSE380-dhaB12用于测序和表达。序列分析表明,该DNA片段编码的氨基酸序列与已报导的丁酸梭菌不依赖辅酶B12甘油脱水酶的相似性达99％。通过IPTG诱导,dhaB12基因在大肠杆菌中表达成功,SDS—PAGE分析表明有88kD和34kD两条蛋白质条带,在没有辅酶B12存在的情况下,所表达的酶具有明显的甘油脱水酶活性。     

金线莲根部内生菌多样性宏基因组的分析

金线莲(Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl)是中国传统中药,具有重要的药用价值,现代医学用来治疗糖尿病和癌症。金线莲作为兰科植物,与内生菌在长期的生长过程中建立起和谐的共生关系,内生菌产生多种次生代谢产物,帮助宿主植物抗菌防虫。现有实验条件下,环境中绝大多数的微生物不能培养,而宏基因组学是认识环境中不可培养微生物的重要手段。本研究对福建金线莲根部内生菌富集进行探索,提取混合内生菌样品宏基因组DNA,并对宏基因组DNA纯化,PCR扩增微生物16S r DNA片段,克隆至大肠杆菌(Escherichia coli)并测序。根据16S r DNA信息初步对富集的内生菌群落分析,内生菌主要是不可培养细菌(uncultured bacterium)、不可培养堆肥细菌(uncultured compost bacterium)、肠杆菌科(enterobacteriaceae)、类芽胞杆菌属(Paenibacillus sp.)、芽胞杆菌属(Bacillus sp.)和短芽胞杆菌属(Brevibacillus sp.)的微生物。本研究为挖掘金线莲内生菌资源提供基础资料。     

中国土壤微生物组数据平台的构建与实现

近年来,高通量测序等新技术的快速发展,为大规模、快速、准确、全面认识土壤微生物多样性提供了技术保障。国际上已经建成了一些具有影响力的土壤微生物组数据管理及分析平台,但大多数已有平台聚焦于提供数据存储、管理、访问、注释等基础性服务,难以满足土壤微生物研究需求。借助空间数据库技术、网络地理信息系统(WebGIS)技术,设计并构建了包含土壤及微生物数据集成、数据可视化、知识发现和区域空间制图等功能的中国土壤微生物组数据平台,该平台将进一步推动我国土壤微生物组数据的标准化整合,并为整合数据的充分挖掘利用提供支撑。     

土壤中耐铅微生物的筛选

通过在培养基中加入一定浓度的Pb(300mg／kg),从土壤中分离到12株耐Pb微生物菌株。其中细菌菌株为1～5号,放线菌为6～9号,真菌为10～12号。经过形态学观察、拮抗试验以及液体培养和土壤模拟试验中降低Pb效果测试,发现12株菌对有效态铅都有一定的降低作用。在液体培养中3号、4号、6号、7号、8号和10号菌株的降低效果最好,降低率超过70％,在土壤培养中3号和7号的降低作用最明显,降低率分别为63．8％和66％。     

烤烟不同生育期土壤酶及微生物活性的变化

在盆栽条件下研究了烤烟不同生长发育阶段土壤酶和微生物的变化规律.结果发现:随着烤烟的生长,过氧化氢酶活性、碱性磷酸酶活性、细菌数量以及砂壤土条件下的硝化细菌和解磷细菌都表现为先降后升再降的规律;硝酸还原酶活性、砂壤土条件下的氨化细菌和壤土下的解钾细菌数量表现为先升后降后期有所回升的规律;淀粉酶活性、真菌、放线菌、壤土条件下的解磷细菌和砂壤土下的解钾细菌数量表现先降后升.除碱性磷酸酶外,所测的土壤酶和微生物在烤烟不同生育阶段差异极显著.这说明在烤烟-土壤-土壤酶及微生物相互作用的系统中,土壤酶活性和微生物数量明显受到烤烟生长发育的影响.     

烟草连作对稻田土壤微生物及酶的影响

对烟草连作不同年限的稻田土壤中微生物的数量、活度及酶活性进行了分析,结果表明:连作年限与土壤中的好气性细菌、厌气性细菌、放线菌及真菌的数量没有相关性,所测不同连作年限的土壤中微生物的数量也没有明显差异,说明烟草连作不会对土壤中主要微生物类群的数量造成明显的影响。烟草连作10年以上的土壤微生物活度有降低趋势,明显低于连作5年以下的,而烟草连作5年以下的土壤微生物活度没有明显差异。烟草连作不同年限的土壤纤维素酶、脲酶、蛋白酶及过氧化氢酶没有明显差异。     

CO_2浓度升高对土壤微生物及土壤酶影响的研究进展

概述了大气CO2浓度条件下,土壤微生物生物量C、土壤微生物区系、土壤细菌群落结构以及土壤酶的变化等方面的研究进展。并提出在CO2浓度升高条件下,根际微生物的优势种群的变化趋势和根系分泌物与根际微生物之间相互影响的研究是今后的研究趋向。     

苦瓜果实酵母双杂交文库构建及McRPF互作蛋白筛选

为研究苦瓜果实成熟的分子调控机制,以苦瓜自交系E12201-e1为材料,取不同成熟期苦瓜果肉组织等量混合,采用All-Direct方法构建酵母双杂交cDNA文库。经质量鉴定,该文库库容为1.25×10⁷ CFU,平均插入片段大于1 200 bp,阳性率为100%,文库质量较高,符合建库标准。同时,以苦瓜果实成熟关键调控因子McRPF为诱饵,构建诱饵表达载体pGBKT7-McRPF。经鉴定该诱饵蛋白无自激活活性。利用共转化法,从文库中筛选到29个初始阳性菌落,经过DNA测序和BLAST比对分析,最终筛选得到12个可能与McRPF互作的蛋白,为进一步探究McRPF调控苦瓜果实成熟的分子机制奠定了理论基础。     

瘤胃微生物Fosmid文库蛋白酶活性克隆的筛选与序列分析

在日粮蛋白质的降解过程中,蛋白酶是把蛋白质水解为肽或氨基酸的关键酶,由于受到纯培养技术的影响,瘤胃内产生蛋白酶活性的细菌和各种蛋白酶的遗传信息知之甚少。本实验旨在利用蛋白酶选择性培养基从瘤胃微生物 Fosmid 文库中筛选出含蛋白酶活性的克隆子,通过生物信息学分析获得这些克隆子的遗传信息。应用脱脂乳粉和大豆蛋白粉两种蛋白酶选择性培养基,从 30 000 个克隆中筛选得到 14 个具有蛋白酶活性的活性克隆。利用福林酚试剂法检测 14 个蛋白酶克隆子的酶活力,结果表明,每个克隆子分别具有不同的蛋白质分解能力。以酪蛋白为底物的克隆子酶活力介于 0.59~2.74 U/mg 之间,以大豆蛋白粉为底物的克隆子酶活力在 0.70~7.19 U/mg 之间,而且同一克隆对于不同的底物所表现的酶活力也不同。随机挑选 10 个活性克隆进行末端测序(GenBank 登录号:JY084410~JY084429),经 Blast 比对后发现,45%的基因序列与已知编码基因无法匹配,pro10F 末端序列与金属肽酶匹配度为 54%,属于肽酶 M13 家族,且该克隆蛋白酶最适 pH 值为 7.0,为下一步研究该克隆的酶学性质和序列特征分析提供了基础资料。     

玉米基因组Fosmid文库构建及类受体激酶基因(Psy1和Psy2)筛选

玉米(Zea mays L.)病害的发生和流行是限制玉米高产稳产的重要因素。玉米细菌性褐斑病是目前具有潜在危害性的病害之一,在抗性基因遗传规律和染色体定位研究方面取得一定进展,但在基因克隆、功能鉴定等研究上进展较为缓慢,利用构建的Fosmid文库克隆抗病候选基因是目前较为快捷和有效的方法之一。本研究以玉米细菌性褐斑病的抗病自交系F349为材料构建了玉米Fosmid文库,克隆总数约为3.7×105个,平均插入片段长度为32 kb,实现4.73倍的玉米基因组覆盖,筛选到任意基因或序列的概率达到了99.12%。基于该文库,利用不同引物组合进行了两个类受体蛋白激酶基因(Psy1和Psy2)的克隆筛选,得到14个阳性克隆,其中4个阳性克隆包含Psy2基因和Psy1基因部分片段;3个阳性克隆包含完整Psy1基因;对其中两个阳性克隆13-12F-23和32-4A-6的测序结果显示,Psy1基因的启动子和内含子分别被插入了10.0和13.5 kb的外源片段;13.5 kb的插入片段是LTR家族的huck反转录转座子,10.0 kb的插入片段是含有helitron转座元件的复杂转座子;扩增到了Psy1基因的cDNA全长,说明这两种类型反转录转座子的插入并未使基因失活。本研究为玉米基因的克隆和功能分析提供了一种可行的研究途径。     

阿维菌素对蔬菜地土壤微生物及土壤酶的生态毒理效应

研究了阿维菌素对蔬菜地土壤微生物和土壤酶的生态毒理效应.实验结果表明,阿维菌素在低浓度时（1～10 mg kg^-1）对土壤脲酶活性和脱氢酶活性有轻微的激活作用,而对土壤微生物呼吸强度没有明显的影响;在高浓度时（50～100 mg kg^-1）对土壤微生物呼吸强度、脲酶活性以及脱氢酶活性均有明显抑制作用;不同浓度阿维菌素在不同程度上均会造成土壤微生物生物量的减少和过氧化氢酶活性被强烈激活.     

盐胁迫对蔬菜地土壤微生物及土壤酶活的毒害效应

采用外源投加盐分培养室模拟方法,研究了不同强度盐胁迫对蔬菜地土壤微生物和土壤酶的生态毒理效应。结果表明,在盐胁迫试验强度条件下,蔬菜地土壤细菌种群遭遇盐胁迫后,生长受抑、数量减少,放线菌种群抗逆性强、数量上升,土壤真菌种群数量因细菌种群数量的减少而出现暂时性增长现象,但随胁迫时间延长也呈现毒害效应,数量下降,且低于对照;盐胁迫造成土壤微生物优势种群演替和微生态失衡,细菌比例降低,真菌比例上升;盐胁迫明显抑制土壤脲酶和蛋白酶活性,抑制程度与外加盐量呈正比,即盐胁迫强度越大,土壤蛋白酶和脲酶活性越低;而土壤转化酶和过氧化氢酶的活性在低盐胁迫强度（外加盐量为1g·kg-1）时略高于对照组,但随盐胁迫强度的加重,转化酶和过氧化氢酶活性相应降低,盐含量越高,酶活性越低;土壤盐胁迫强度与土壤脲酶、蛋白酶、转化酶和过氧化氢酶活性均呈高度线性负相关,其中蛋白酶和转化酶与盐胁迫程度的相关性高且稳定,0.930≤r≤0.993。     

海藻糖合酶基因的克隆及转化甘蔗的研究

从提子菌灰树花的菌丝体中提取总ＲＮＡ,并纯化出ｍＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增得到一长约２．２ｋｂ的片段,经测序,其全长２１９９ｂｐ,包括起始密码和终止密码;随后将此片段插入植物表达载体ｐＢＩ１２１的３５Ｓ启动子和ＮＯＳ终止子之间,构建了一植物表达载体（ｐＢＴ）,又将此片段加上ｕｂｉ－Ｌ启动子和ＮＯＳ终止子构建了另一植物表达载体（ｐＵＢＴ）,然后通过基因枪法分别用植物表达载体ｐＢＴ和ｐＵＢＴ转化甘蔗,     

大肠杆菌海藻糖磷酸合酶基因的克隆

根据报道的大肠杆菌（Escherichia coli)海藻糖－6－磷酸合酶基因（otsA)，设计引物，通过PCR技术从大肠杆菌XLI菌株的总DNA中扩增到一个1．4kb片段。经克隆、测序分析，该片段长1425bp并含一完整的开放读框（ORF）。在核苷酸水平上，该ORF与已报道的otsA基因具有99．86％的同源性。在氨基酸水平上，其推断性的编码产物蛋白与OtsA具有100％一致性。