基于CODEHOP克隆杉木种子14-3-3基因片段

对于未测序的物种,利用常规的引物设计很难扩增出蛋白质组获得的蛋白质基因。利用CODEHOP设计杉木种子14-3-3蛋白质的简并引物来进行反转录PCR,从杉木未成熟的种子中扩增出1 000 bp左右的产物。将PCR产物构建p MD-19Vector载体上并转化JM109菌感受态细胞中,菌落PCR扩增测序。结果显示,利用CODEHOP方法设计简并引物扩增的目标片段的大小及序列与预期的一致。这将为杉木其他蛋白质基因的克隆和研究提供参考。     

CODEHOP在线简并引物设计与杉木4CL基因片段克隆

利用CODEHOP设计4CL酶的简并引物,利用设计的3对简并引物进行RT—PCR,从杉木幼茎中克隆到2个长度分别为502bp和536bp的PCR产物,产物经pMD18-T载体克隆转化至DH5α大肠杆菌中,序列通过Blastx检索与Genbank进行同源性比对后,发现2片段都与其它植物的4-CL基因具有较高的氨基酸序列同源性。研究表明,该程序设计的简并引物可信性强,阳性率高。该基因的成功克隆将为研究杉木木质素的合成提供科学依据。     

杉木CCoAOMT基因部分cDNA克隆与序列分析

利用CODEHOP设汁CCoAOMT基因的简并引物,通过RT-PCR的方法,从杉木茎段中克隆到1个长度为614 bp的PCR产物,产物经pMD18-T载体克隆转化至DH5α大肠杆菌中,序列通过同源性比对后显示该片段与其它植物的CCoAOMT基因具有较高的同源性.利用生物信息学方法分析发现,该序列在112～651 bp片段上有一个开放性阅读框,该序列编码的是一个酸性蛋白,亲水性较弱.疏水性较强;信号肽序列为第23位至第45位,二级结构以α-螺旋(40.62%)与不规则盘绕(45.31%)为主,没有发现β转角区域.     

7个杏李品种S基因型的鉴定

为给杏李的品种配置和遗传育种提供了理论基础,利用特异性PCR扩增、DNA测序和生物信息学方法鉴定了恐龙蛋等7个杏李品种的S基因型.S基因的PCR扩增结果表明,Ph引物对风味皇后、味帝、味王、风味玫瑰、味厚、恐龙蛋6个品种扩增出1条850bp左右片段;Pe引物对风味皇后、味王、风味玫瑰、味厚、味馨5个品种扩增出1条1100bp左右片段;Pb引物对味帝和恐龙蛋扩增出900bp左右片段;P2引物对味馨扩增出850bp左右的片段.对PCR产物克隆后测序,并通过BLAST比对和生物信息学分析表明,风味皇后、味王、风味玫瑰和味厚4个品种的2个PCR产物分别与Se-RNase和Sh-RNase基因的相似性达100%,味帝和恐龙蛋的2个产物分别与Sb-RNase和Sh-RNase基因的相似性达100%,味馨的2个PCR产物与Se-RNase和S2-RNase基因的相似性达100%;结合PCR分析和序列生物信息学分析确定了味王等7个杏李品种的S基因型：风味皇后、味王、风味玫瑰和味厚等4个品种的S基因型相同,为SeSh;味帝和恐龙蛋的S基因型相同,为SbSh;味馨的S基因型为SeS2.     

马尾松苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与序列分析

苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia lyase,PAL)是苯丙烷类代谢的关键酶,催化苯丙氨酸转化为肉桂酸,促进黄酮、木质素等次生代谢产物的合成。根据其他植物PAL基因的DNA保守序列设计的简并引物,经过PCR扩增,得到1条864 bp的特异性片段,编码288个氨基酸。通过分析其序列和编码的氨基酸序列,发现其与其他物种的PAL基因高度同源,证实为马尾松PAL基因的核心序列。所得序列已经登陆在NCBI的Genbank中,序列号为GQ142010。     

唐菖蒲2种主要病毒的多重RT-PCR检测

根据黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)和烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)外壳蛋白基因序列分别设计特异性引物对,运用单重RT-PCR检测到病毒并筛选出适合多重RT-PCR的引物对。以唐菖蒲18S rRNA为内参照,建立同时检测CMV和TMV的多重RT-PCR方法。此方法可从带病样品中扩增出CMV(629bp)和TMV(423bp)2条特异片段。测序结果表明:CMV扩增产物与其他植物分离物核苷酸的同源性为93%～97%,TMV扩增产物与其他分离物核苷酸的同源性可达99%。     

银杏苯丙氨酸解氨酶基因的克隆和序列分析

根据其他植物PAL基因的DNA序列的保守区域，设计了一对简并引物，经PCR扩增，得到一条862 bp的特异性扩增带。将PCR扩增产物构建到T-载体并测序，获得了862 bp DNA序列。通过分析所得的862 bp DNA序列及其编码的氨基酸序列，与其他植物PAL基因的DNA序列和蛋白质序列分别进行比较，证实了所得序列为银杏PAL基因的部分序列。Gbpal1已经被Genebank收录，序列号为AY578145。Southern杂交结果表明银杏PAL是一个多基因家族。     

诺丽Actin基因片段克隆及实时荧光定量PCR方法的建立

为了解决诺丽实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测中无内参基因的现状,根据其他植物Actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以诺丽果实总RNA反转录成c DNA为模板,进行PCR扩增,扩增出的基因片段克隆到p MD-18T载体,阳性克隆经PCR鉴定后测序。序列结果表明:该片段长393 bp,编码131个氨基酸;所得序列与麦蓝菜actin 1有最高的一致性(96%)和相似性(98%)。q RT-PCR结果表明,诺丽Actin基因在诺丽的各个组织、果实不同发育时期都能稳定表达,且表达水平基本一致,适合在诺丽基因表达研究中作为内参基因。     

油桐LEAFY同源基因片段的克隆与分析

根据不同植物LEAFY（LFY）同源基因序列的保守区,设计合成1对简并引物,利用该引物通过PCR技术从油桐基因组DNA中分离出1条长约1050bp的LFY同源基因（TUNGlfy）片段,克隆到pMD18-T载体,以期为进一步研究LFY基因表达特性及其与油桐成花生物学的关系打下基础.进行测序和生物信息学分析的结果表明,该片段长1059bp,在中间有1个长639bp的内含子,前面的外显子长294bp,后面的长126bp,共编码135个氨基酸,拼接位点与其它植物的LFY同源基因一致;其推导蛋白质序列与其它植物LFY同源基因的相似性为88%～97%,其中与毛白杨的相似性最高,达到了97%,推测它们具有相似的功能.     

桃水孔蛋白基因克隆及序列分析

为给水孔蛋白(AQP)在低温对花芽发育和休眠调控中的作用研究奠定基础,以低温休眠的桃"满天红"花芽为试材,提取总RNA,根据其它植物AQP基因保守区设计简并引物,采用RT-PCR方法,扩增出3个编码长约147个氨基酸序列的水孔蛋白基因PpPIP1-1、PpPIP1-2和PpPIP2-1。同源性比对结果表明这些序列与其它物种AQP基因具有较高的同源性。这3个AQP基因的氨基酸序列均具有MIP家族的特征信号序列SGXHXNPAVT,还具有植物质膜水孔蛋白(PIP)家族的特征信号序列GGGANXXXXGY和TGI/TNPARSL/FGAAI/VI/VF/YN。经系统发育分析将这3个AQP基因分为2类,分属PIP蛋白的PIP1和PIP2亚家族成员。     

绣线菊丛枝病病原的分子鉴定

用植原体16S rRNA基因的通用引物,对表现黄化、丛枝、顶枯等症状的绣线菊DNA进行PCR扩增,得到了约1.2kb的特异性片段.测序结果证明其病原为植原体.RFLP和序列分析表明:该分离物属于翠菊黄化组的16SrⅠ -B亚组.与GenBank中其他植原体分离物序列比较,发现该分离物与16SrⅠ -B亚组中的西方翠菊黄化植原体(SAY)同源性高达99.6%.     

杨树木质素合成酶hct基因的克隆及核苷酸序列分析

根据毛果杨全序列（AC185363.2）中唯一具有转移酶功能的保守区设计引物,以正在分化的2年生欧美杨107次生木质部总RNA为模板经RT-PCR扩增出hct基因片段,与pMD20-T载体连接,重组质粒经特异引物扩增、限制性内切酶酶切和测序鉴定。结果表明,扩增片段长度为709bp,包含一个708bp的开放阅读框,与毛果杨全序列及HCT2（EU603314）的同源性均为98%,编码的氨基酸序列与毛果杨HCT2氨基酸（ACC63883.1）的同源性为98%,断定我们克隆的cDNA为hct,属于转移酶超家族,GenBank登录号为FM202091,该重组质粒命名为pMD20-T-hct。     

PCR法克隆紫穗槐4-香豆酸:CoA连接酶全长cDNA

4 香豆酸 :CoA连接酶 (4CL)是木质素生物合成过程中重要的酶 .该文利用简并寡核苷酸PCR法结合cDNA末端快速扩增PCR法直接获得了紫穗槐 4CLAcDNA全长序列 ,避免了复杂的构建、筛选cDNA文库的过程 .先用简并PCR得到了 4CLA1片段 ,又据此片段设计反向嵌套引物 ,用RACE方法获得未知的 5′和 3′端序列 .所获得的全长 4CLAcDNA ,编码 5 40个氨基酸 .氨基酸序列同源性分析表明4CLA是典型的 4CL蛋白 ,含有预计的AMP binding位点、催化反应区和保守的Cys .     

版纳龙竹CONSTANS同源基因的克隆与序列分析

以版纳龙竹基因组DNA为模板,采用前人基于水稻CO同源基因Hd1序列的保守区所设计的特异引物COS1和COA1,运用PCR方法扩增出一条1 520 bp的DNA片段,并克隆到pGEM-T载体。测序和序列分析结果显示:该片段含有1个590 bp的内含子,编码区930 bp共编码310个氨基酸;该基因被命名为DxCO1,其DNA序列在G enB ank中的注册号为GQ358925。在G enB ank中进行同源性检索的结果显示:其核苷酸序列与其它禾本科植物CO同源基因的氨基酸序列同源性高达81%~91%;推测的DxCO1蛋白质序列与其它种子植物CO同源基因蛋白质序列的系统发育分析结果显示:DxCO1与小麦Hd1-like等5个基因聚成了一个强烈支持的分支;另外,在该片段推测的蛋白质序列的氨基端含有一个类似锌指蛋白的B-box(Cx2Cx8Cx7Cx2Cx4Hx8H)结构域,羧基端含有一个CCT(CO,CO-like,TOC1)结构域。序列和结构的高度同源性表明:DxCO1是版纳龙竹的1个CO-like基因,可能对其开花调控有着重要作用。     

柑桔酸性转化酶基因家族成员的克隆及特性分析

分析植物液泡和细胞壁酸性转化酶基因的保守区序列 ,设计 2对PCR引物 ,以温州蜜柑基因组DNA为模板 ,采用PCR方法扩增出长分别为 74 1bp(A)和 5 2 4bp(B)的 2个DNA片段 ,克隆入pUCm T载体测序 ,序列已在GenBank中登记 (登记号分别为AY0 2 94 81和AF332 881)。在GenBank中进行同源性检索 ,结果表明片段A编码的氨基酸与植物液泡酸性转化酶同源性较高 ,与胡萝卜、马铃薯和番茄同源性分别为 79%、79%和 78%。片段B编码的氨基酸序列与草莓、拟南芥和豌豆细胞壁转化酶同源性分别为 78%、78%和 77%。推测A和B分别定位于液泡和细胞壁。运用Clustalx和Bioedit软件包对已获得的柑桔转化酶基因家族的 7个基因序列进行分析 ,结果表明 7个基因分属转化酶基因家族的 4种类型。推测A和B为 2个新成员 ,分别属于柑桔液泡酸性转化酶基因Ⅱ型(CUAI2 )和细胞壁酸性转化酶基因Ⅱ型 (CUCWI)。Southern杂交结果表明 ,CUCWI和CSCWI 2个探针有时会出现较弱的杂交干扰信号 ,可采用CSCWI与CUCWI同源性较低的另一段序列制作探针进行杂交 ,也可通过缩短杂交时间、提高杂交和洗膜的温度以及降低洗膜SSC的浓度等措施来降低 ;其它成员之间无干扰信号产生     

抗光肩星天牛苏云金芽胞杆菌Bt886菌株的分离及对毒蛋白编码基因的初步鉴定

从拟谷盗虫尸中分离到一株对鞘翅目害虫光肩星天牛幼虫毒杀作用明显的Bt菌株Bt886。幼虫死亡率高达 6 0 % ,存活者生长明显受到抑制。经过晶体形态特征和杀虫谱分析 ,初步确认该菌株属于cry3类。比较cry3类基因的保守序列 ,利用一对cry3特异引物成功地从Bt886菌株中克隆到了一段基因片段并克隆至pGEM -T载体上。测序分析发现该片段与cry3Aa1基因具有很高的同源性 ,确定来自毒蛋白编码基因。Southern杂交分析表明该基因位于该菌株的质粒上。     

大青杨纤维素合酶PuCesA6全长基因的获得及分析

为给大青杨纤维素方面的基因改良提供基础,以大青杨叶片总DNA为模板,根据已登录的欧洲颤杨PtrCesA6序列保守区段设计2对引物进行PCR扩增,将得到的2个片段克隆到pMD18-T载体中.测序后拼接2片段,结果显示,该基因全长5 760 bp,与欧洲颤杨的PtrCesA6全长cDNA的相似性为99%,证明克隆的序列为纤...     

赤桉FAD2基因全长cDNA的克隆与生物信息学分析

桉树是世界上重要的多功能树种,从桉叶中提取的桉叶油含有不饱和脂肪酸,对于桉叶油的药用活性和桉树的抗逆性具有重要的作用。为深入了解桉树的不饱和脂肪酸的生物合成途径和分子调控机理,本研究根据FAD2基因的保守区段设计兼并引物,从赤桉嫩叶中获得了一条FAD2基因的片段,并进一步利用RACE技术得到了此基因的全长cDNA,将其命名为EC-FAD2基因。通过生物信息学分析发现,该基因全长cDNA为1 472 bp,编码389个氨基酸,并且具有FAD2蛋白特有的保守序列和相关特征。经过比对分析,发现赤桉的FAD2蛋白与其他植物的FAD2蛋白具有较高的相似性。     

松材线虫病双基因检测方法的建立

采用松材线虫的核糖体DNA的内转录区序列及cathepsin L-like cysteine proteinase为目的片段设计2对引物,建立了可特异性检测松材线虫的双基因PCR检测法.利用这2对引物,松材线虫可扩增出大小分别为490 bp及264 bp的产物,而其他对照组均无扩增.此检测方法经过实际应用检验,灵敏度与...     

巨龙竹AINTEGUMENTA基因的克隆研究

为进一步探索臣龙竹速生与巨大的分子机理,研究其AINTEGUMENTA（ANT）基因功能,研究试验以巨龙竹cDNA第一链为模板,用简并引物、基因特异引物以及运用RACE技术首次克隆出巨龙竹ANT基因全长cDNA序列。其序列全长为1914bp,与水稻、玉米、小麦等植物同类基因序列相似性高达85％;并且含有一个837bp的开放阅读框,编码278个与水稻、拟南芥和烟草ANT蛋白氨基酸序列有着较高同源性的巨龙竹ANT前体蛋白氨基酸序列。