紫花苜蓿bZIP转录因子MsbZIP1的克隆、表达特性和遗传转化分析

bZIP（Basic leucine zipper）是植物中一类非常重要的转录因子,参与植物从生长发育到抗性调控的多个生物学过程。为了了解紫花苜蓿（Medicago sativa）中bZIP转录因子的特性,解析紫花苜蓿MsbZIP1基因的生物学功能,从而阐述MsbZIP1基因响应紫花苜蓿抗逆调控机制,本研究利用RACE技术从紫花苜蓿中获得1个MsbZIP1基因的全长cDNA,该序列全长1 176 bp,编码361个氨基酸,预测分子量为42.3 kD,等电点为6.5。分析发现,该蛋白含有bZIP家族典型的BRLZ碱性结构域和亮氨酸拉链,属于bZIP家族蛋白。进化树分析表明,该蛋白属于bZIP转录因子C亚族,与拟南芥（Arabidopsis thaliana）的AtbZIP63具有很高的同源性,推测可能具有与该类蛋白相似的功能。qRT-PCR分析表明,MsbZIP1基因对干旱、高盐、高温、低温,以及脱落酸（Abscisic acid,ABA）和生长素（Auxin,IAA）处理都有不同程度的响应,推测该基因可能参与调控紫花苜蓿多种非生物胁迫。本试验通过构建表达载体PCAMBIA3301-MsbZIP1,以农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥,经后代筛选、扩繁和分子检测,得到7株超表达的转基因拟南芥。本研究第一次分离了紫花苜蓿C亚族bZIP转录因子,初步确定紫花苜蓿MsbZIP1基因响应多种逆境胁迫的反应,并获得了阳性转基因材料,并为进一步探索该类转录因子在紫花苜蓿抗逆性调控中的作用奠定了基础。     

紫花苜蓿CCoAOMT基因家族的鉴定、进化及表达分析

紫花苜蓿是全世界广泛栽培的优质牧草.木质素与紫花苜蓿抗性密切相关,但木质素难以被牲畜消化,严重影响了紫花苜蓿的营养价值,所以培育低木质素的紫花苜蓿具有重要意义.咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶(CCoAOMT)是木质素合成途径中的关键酶,本研究利用生物信息学方法对紫花苜蓿基因组中的CCoAOMT基因家族成员进行鉴定,并对其基因结构、染色体定位、系统发育、基因表达等方面进行了研究.结果表明,在紫花苜蓿基因组中共鉴定到44个MsCCoAOMT基因,其中36个(82％)MsCCoAOMT基因都含有5个外显子,分布于16条染色体上,存在明显的串联重复现象;通过系统发育树分析,MsCCoAOMT基因家族可分为5类;通过MEME软件对MsCCoAOMT蛋白motif进行预测发现了10个比较保守的motif.qRT-PCR表达分析表明部分MsCCoAOMT基因的表达具有组织特异性.研究结果对紫花苜蓿低木质素遗传改良具有潜在的理论指导意义和实际参考价值.     

鸭茅bZIP基因家族鉴定及非生物胁迫表达模式

冷季型牧草鸭茅(Dactylis glomerata)在生长过程中会受到各种逆境胁迫的影响。bZIP转录因子参与多种生物学过程,尤其在植物抵御生物和非生物胁迫过程中发挥关键作用。本研究利用生物信息学和实时荧光定量(qRTPCR)的方法,对鸭茅bZIP基因家族进行全基因组鉴定和分析并探究其表达模式。共鉴定出103个DgbZIP基因并将其划分为11个亚家族。对于同一亚族内成员而言,它们的保守序列和基因结构具有一定的相似性,并预测到许多与胁迫密切联系的顺式作用元件。研究结果表明,在热和干旱胁迫处理后A、C、S亚族成员较强烈地响应胁迫并参与表达调控。本研究为进一步揭示鸭茅bZIP基因响应逆境胁迫的分子机制提供了参考。     

紫花苜蓿响应低温胁迫转录因子的鉴定及表达分析

研究证明,转录因子广泛参与植物的生长发育过程并响应多种生物/非生物胁迫信号途径。低温胁迫可导致紫花苜蓿(Medicao sativa)减产、越冬率降低以及生产年限缩短。利用新一代高通量转录组测序技术,本研究对4℃低温胁迫下紫花苜蓿中响应低温胁迫的转录因子基因进行了鉴定,并对其表达情况进行分析,结果表明,转录组测序共获得78 925条Unigene序列和3 448个差异表达基因。其中,从3 448个差异表达基因中共鉴定出43个转录因子家族,共251个基因被显著地诱导表达。不同转录因子家族基因受低温胁迫诱导表达不同。本研究有助于在整体水平加深了解紫花苜蓿转录因子表达特性,为进一步研究这些响应低温胁迫的转录因子的功能提供参考。     

基于全长转录组测序的掌叶大黄bZIP基因家族鉴定分析

bZIP转录因子在调控植物生长发育、次生代谢产物合成以及胁迫响应中发挥着重要作用。本研究基于全长转录组测序分析,系统筛选掌叶大黄(Rheum palmatum) bZIP基因家族,分析其编码蛋白的理化性质、保守基序及系统进化等特性,利用RNA-seq进行基因组织表达分析和茉莉酸甲酯(MeJA)处理基因表达分析。结果表明,掌叶大黄bZIP基因家族有63个成员(RpbZIP1～RpbZIP63);根据其与拟南芥(Arabidopsis thaliana) bZIP系统发育关系被分为A～I和K、S等11个亚族;RpbZIPs基因主要编码不稳定的亲水蛋白,均定位于细胞核;RpbZIPs蛋白二级结构主要为α螺旋和无规卷曲。基于RNA-seq数据,筛选出掌叶大黄根及根茎中高表达且响应MeJA的RbZIP16、RpbZIP17、RpbZIP61等6个基因,qPCR验证了其中4个与转录组测序表达结果一致。本研究系统分析掌叶大黄bZIP基因家族,为后续进一步研究基因功能及大黄次生代谢转录调控机制提供了科学依据。     

猪TGF-β基因家族成员的鉴定、进化及表达分析

为了明确猪TGF-β基因家族的功能和进化关系,运用HMMER并结合BLAST对猪的TGF-β基因家族成员进行鉴定,运用多种生物信息学方法对序列进行分析,运用转录组数据分析TGF-β基因家族的组织表达规律,并对TGF-β基因家族进行功能富集分析。结果表明：猪TGF-β基因家族共有36个成员,编码蛋白质的氨基酸数量在153～719,相对分子质量在16.44～79.41 kDa,等电点在4.93～11.78,均为亲水性蛋白。二级结构以无规则卷曲为主,其次是α-螺旋。系统进化树分析表明TGF-β基因家族分为三大亚类,猪TGF-β基因家族成员与人和小鼠的TGF-β基因家族成员分别聚集,说明其进化关系较近。基因结构和结构域中同一类群的不同TGF-β基因家族成员具有较高的相似度。转录组数据显示大多数TGF-β基因家族成员在成年公猪和母猪27种不同组织和外周血单核细胞中均有表达,其中GDF1和TGFB2基因在成年猪所有组织中高表达。功能富集分析发现TGF-β基因家族参与众多的生物学过程和病理过程。研究结果为深入解析猪TGF-β基因家族的生物学功能奠定基础。     

全基因组水平紫花苜蓿TCP基因家族的鉴定及其在干旱胁迫下表达模式分析

紫花苜蓿是世界最重要的豆科牧草之一,干旱是影响其产量和地理分布的关键瓶颈。在紫花苜蓿响应干旱胁迫过程中,转录因子发挥着重要的调控作用。TCP（teosinte branchesd 1/cycloidea/pro-liferating cell factors）为植物特有的转录因子,在植物生长、发育、响应逆境胁迫中都具有重要的生物学功能。截至目前,该基因家族在紫花苜蓿中的分布以及响应干旱胁迫的生物学功能仍未见报道。因此,为进一步挖掘紫花苜蓿中响应干旱胁迫功能基因,本研究利用生物信息学方法在全基因组水平对TCP基因家族进行了鉴定,并对其系统进化、基因结构、染色体定位、共线性分析以及干旱胁迫下的表达模式进行了分析。结果表明,紫花苜蓿基因组中共鉴定出40个MsTCP基因,不均匀地分布于20条染色体上,其中包括17对旁系同源基因对,且都是基因片段复制事件。系统发育和保守结构域分析发现,MsTCP基因可以分为2个大分支和3个亚家族（PCF, CIN与CYC/TB1）,同一分支中的成员具有相同氨基酸数目的TCP结构域,同亚家族中的成员具有相似的保守基序与基因结构。此外,通过分析紫花苜蓿响应干旱转录组数据共鉴定出4个可能与紫花苜蓿响应干旱胁迫有关的MsTCP基因（MsTCP23,MsTCP27,MsTCP29,MsTCP33）。qRT-PCR结果进一步表明PEG模拟干旱胁迫处理后,这4个基因的表达量在根和叶中均显著上调,进一步确定了这些基因的确响应紫花苜蓿干旱胁迫。该研究为后期深入解析紫花苜蓿响应干旱胁迫理论以及通过基因工程技术创制高抗旱紫花苜蓿新种质奠定基础。     

全基因组水平蒺藜苜蓿CPP基因家族的鉴定及表达模式分析

CPP （cysteine-rich polycomb-like protein）基因家族是一类小转录因子,广泛存在于除酵母与原核生物外的各种生物体中,在植物生长发育及响应胁迫过程中具有重要作用。截至目前,CPP基因家族已在多个物种中被鉴定和研究,但在豆科模式植物蒺藜苜蓿中还未见报道。本研究采用生物信息学的方法,在蒺藜苜蓿中共鉴定出9个CPP基因。通过与3个物种CPP基因的蛋白序列构建系统发育树,将CPP基因分为3类,MtCPP成员与大豆的亲缘关系更接近。保守结构域分析表明MtCPP转录因子都具有1~2个CXC保守结构域。染色体定位分析得出,9个CPP基因分布在6条染色体上,并鉴定出2对旁系同源基因,均来源于片段重复事件。通过基因芯片技术检测MtCPP基因的表达模式结果显示,MtCPP基因的表达具有一定的时空特异性。MtCPP基因启动子中含有大量与激素以及胁迫相关的顺式作用元件,并且MtCPP2、MtCPP5、MtCPP6和MtCPP7基因具有响应干旱的表达特征,MtCPP2和MtCPP8基因具有响应盐胁迫的功能。该研究可为后期深入解析MtCPP基因家族功能和筛选参与苜蓿抗逆的MtCPP基因奠定基础。     

紫花苜蓿MsWRKY11基因的克隆及其耐盐功能分析

本研究从紫花苜蓿cDNA中克隆到一个MsWRKY11基因,进化分析表明MsWRKY11与蒺藜苜蓿WRKY11亲缘关系最近.MsWRKY11受NaCl、水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)的诱导表达.将PHB-MsWRKY11-Flag表达载体转入紫花苜蓿获得超表达紫花苜蓿.250 mmol·L-1 NaCl处理下,转基因株系的株高和地上生物量,以及过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性和K+/Na+均明显高于野生型,而Na+含量、电导率、丙二醛(MDA)含量和超氧阴离子含量均显著低于野生型.进一步分析发现盐胁迫下耐盐性相关的关键基因MsNHX1、MsSOS3、MsAPX、MsGRX、MsNAC和MsP5CS的表达量受到强烈诱导,转基因紫花苜蓿叶片中6个基因的表达量高于野生型.上述结果表明,MsWRKY11通过调节细胞K+/Na+内稳态和保护过氧化物酶活性,从而降低Na+对细胞膜结构的破坏,提高紫花苜蓿的耐盐能力.     

紫花苜蓿atpA基因的克隆及表达模式分析

叶绿体atpA基因位于ATP合酶的CF₁上,编码α亚基,是光合作用不可缺少的关键基因。本研究利用RT-PCR技术,从‘新疆大叶’苜蓿(Medicago sativa L.‘Xinjiang Daye’)中克隆出atpA基因,并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR技术进行基因表达模式检测。结果显示,MsatpA基因编码510个氨基酸,相对分子质量为55.71 KD,等电点为5.22。MsAtpA蛋白含有多个磷酸化位点且无跨膜结构和信号肽,二级结构中α-螺旋占比最高;亚细胞定位预测该基因编码的蛋白位于叶绿体中,与同为豆科苜蓿属的黄花苜蓿(Medicago falcata)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的AtpA氨基酸序列同源性较高。表达模式检测结果显示,MsatpA基因在叶中的表达量最高,根中最少;结荚期的基因表达量显著高于其他发育时期;MsatpA基因响应低温、高温、盐和渗透胁迫应答,且呈现出不同的表达特点。研究结果为紫花苜蓿atpA基因功能研究奠定基础。     

苜蓿全基因组WRKY转录因子基因的分析

蒺藜苜蓿的基因组较小,遗传转化相对容易,是国际上广泛用于研究豆科植物的模式植物,其全基因组测序已经完成。WRKY转录因子是近年来在植物中发现的N-端含有WRKYGQK高度保守氨基酸序列的新型转录调控因子, 调节启动子中含W-box元件的调节基因和(/或)功能基因的表达, 从而参与植物的各种防卫反应。本研究以苜蓿基因组序列(Mt2.0)为材料,利用生物信息学方法分析苜蓿全基因组WRKY转录因子基因的数目、种类、系统发生学、保守基序,结果表明,苜蓿中共有28个WRKY基因,其中5个基因含有2个WRKY结构域,共含有33个WRKY结构域,根据其结构域特点可以分为3个大类,同时与水稻WRKY基因进行了比较研究,发现基因数目远少于拟南芥和水稻,同时研究证实苜蓿与水稻WRKY基因的起源和进化关系存在较大差异,显示出苜蓿WRKY进化有其独特的特点,此外分析苜蓿WRKY基因的保守motif共有46个,筛选得到WRKY结构域的5个保守motif。该研究对苜蓿WRKY基因功能的研究及进化具有重要的意义。     

紫花苜蓿ＷＲＫ转录因子基因的克隆与亚细胞定位

 ＷＲＫＹ 转录因子家族在植物生长发育各个阶段发挥重要作用。本研究运用电子克隆和ＲＴ－ＰＣＲ 结合的方法获得１个紫花苜蓿ＷＲＫＹ 转录因子家族成员的ｃＤＮＡ 序列,命名为MsWRKY56。该序列长１２６７ｂｐ,包含１个９５１ｂｐ的最大开放阅读框,编码３１７个氨基酸;构建该基因的瞬时表达载体,通过基因枪轰击洋葱表皮的方法对编码蛋白进行亚细胞定位研究,结果表明该基因编码蛋白定位于细胞核,符合转录因子的亚细胞定位特征,为进一步研究该基因编码蛋白的结构和功能奠定了基础。     

紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的分离及遗传转化研究

WRKY转录因子是植物特有的转录因子,广泛参与植物对多种逆境胁迫的反应。但是对紫花苜蓿中WRKY转录因子的研究还较少。本研究从紫花苜蓿中克隆了一个WRKY I类转录因子MsWRKY33。该基因CDS全长1536 bp,编码512个氨基酸,结构分析显示MsWRKY33包括两个WRKY结构域和一个C2H2锌指结构(C-X4-C-X23-H-X-H),表明其属于WRKY I 族WRKY转录因子。亚细胞定位预测MsWRKY33蛋白定位在细胞核。MsWRKY33基因受盐、干旱和冷胁迫诱导,暗示基因可能参与了这些逆境胁迫的调控。构建原核表达载体pET-MsWRKY33, SDS-PAGE分析表明在大肠杆菌中表达了MsWRKY33蛋白。扩增MsWRKY33编码区cDNA,以pBI121为基础载体,构建植物超表达载体pBI121-MsWRKY33。采用农杆菌介导的愈伤组织培养法转化紫花苜蓿。利用nptⅡ基因引物和载体特异引物检测抗性苗呈阳性,表明目的基因已成功导入紫花苜蓿基因组中。qRT-PCR检测发现,MsWRKY33基因在转基因株系中得到增强表达。本研究为进一步探索WRKY转录因子基因在紫花苜蓿抗逆性调控中的作用奠定了基础。     

蒺藜苜蓿全基因组中U-box基因家族的筛选与特征分析

植物基因组中广泛存在U-box基因,其编码蛋白大部分作为泛素系统中决定底物特异性识别的E₃泛素连接酶,广泛地调控植物生长生殖发育以及响应逆境胁迫等过程。本文利用蒺藜苜蓿基因组数据库,通过生物信息学手段,鉴定蒺藜苜蓿U-box家族基因;采用MEGA6软件进行系统进化树分析;通过GSDS在线工具和Mapinspect软件进行基因结构及染色体定位分析;利用已有的蒺藜苜蓿芯片数据进行组织表达和胁迫响应表达分析。结果表明,蒺藜苜蓿基因组中含有41个U-box基因,不均匀地分布于蒺藜苜蓿的8条染色体上。根据结构域组成和系统进化分析将这些U-box蛋白分成6类。基因表达模式分析发现,该家族成员的表达具有一定的组织特异性,并能响应盐、干旱和氮素胁迫。这些研究结果为蒺藜苜蓿U-box基因家族的功能分析奠定了基础。     

MADS-box基因家族在蒺藜苜蓿的全基因组分析

MADS-box基因家族是植物体内的重要转录因子,它们广泛地调控着植物生长、发育和生殖等过程。本研究以蒺藜苜蓿基因组数据为材料,采用结构域搜索方法,鉴定了138个MADS-box基因。通过序列比对系统进化分析,将它们分成两大类:Ⅰ型(92个)和Ⅱ型(46个)。同时,通过染色体定位分析发现,134个MADS-box基因定位在染色体上,还有4个MADS-box基因定位在尚未完成最终拼接的超长片段上。蒺藜苜蓿的MADS-box基因家族成员之间存在大量的基因重复,特别是Ⅰ型MADS-box基因,通过基因复制,MADS-box基因家族在染色体上形成多个密集的MADS-box基因簇。对蒺藜苜蓿的RNA-seq表达谱数据分析,发现MADS-box基因在心皮组织、花器官等组织中表达量较高,这表明蒺藜苜蓿的MADS-box基因家族广泛地参与苜蓿组织分化、发育以及生殖等过程的调控,这将为进一步揭示MADS-box类转录因子在蒺藜苜蓿中作用机制提供了重要的参考。     

苜蓿干草调制过程中群体特征对粗蛋白质含量的通径分析

通径分析表明,苜蓿干草在调制过程中含水量与粗蛋白质之间的相关关系主要是通过中性洗涤纤维(NDF)和叶片损失率的间接影响产生的;NDF与粗蛋白质的相关关系,直接作用和通过叶片损失率的间接作用各占50%,并且通过含水量所起的作用为正效应;叶片损失率与粗蛋白质含量的相关关系,主要是直接作用(占56.0%)和通过NDF的间接作用(占54.5%)所引起的.     

苜蓿根腐病病原菌的分离及鉴定

从甘肃张掖、酒泉2市采集苜蓿Medicago sativa根腐病样品15份,按照柯赫证病律对其进行病原物分离、鉴定.结果表明：发病部位分离到的菌株以镰孢霉Fusarium spp.占优势,经致病性测定和接种试验证明,腐皮镰孢霉F.solani致病性最强,接种后病株率达60%以上;其次是尖孢镰孢霉F.oxysporum和串珠镰孢霉F.moniliforme,致病性弱,发病株率为16.7%～23.3%;腐皮镰孢霉与尖孢镰孢霉或串珠镰霉混合接种,发病率均高于单独接种的发病率,而病株上获得的其他分离物均无致病性.研究证明苜蓿根腐病是以腐皮镰孢霉为主要病原,并与尖孢镰孢霉和串珠镰孢霉复合侵染导致的一种病害.