多粘类芽孢杆菌纤维素酶基因bglA,bglB和EG在乳酸菌中的分泌表达

通过PCR扩增获得乳酸菌(Lactobacterium lactis MG1363)的usp45基因,将其克隆到乳酸菌(L.lactis)食品级表达载体pNZ8048中获得分泌型表达载体pNZ-X;然后将多粘类芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)β-葡萄糖苷酶基因bglA、bglB及内切β-葡聚糖酶基因EG分别连接载体pNZ-X,获得重组质粒pNZ-X::bglA,pNZ-X::bglB和pNZ-X::EG,将3个质粒电转导入L.lactis NZ9000,得到重组乳酸菌L.lactis NZ9000/pNZ-X::bglA、L.lactis NZ9000/pNZ-X::bglB和L.lactis NZ9000/pNZ-X::EG,并测定分泌性表达的BglA,BglB和EG的酶活性。结果显示:3个酶大小均在50kU;DNS法测定酶活力表明重组菌株的酶活力显著低于多粘类芽孢杆菌的酶活力(P0.05),但具有一定的活性;刚果红染色结果也表明重组乳酸菌分泌产生的酶可产生明显的水解圈。试验为重组纤维素酶在食品级菌株中重组表达提供了一种可行的方案,为秸秆的降解研究奠定了基础。     

地衣芽孢杆菌谷氨酸消旋酶基因克隆、原核表达及生物信息学分析

为了进一步分析谷氨酸消旋酶的结构和生物信息功能,试验以γ-PGA生产菌株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) DY136为材料,PCR扩增其谷氨酸消旋酶基因(racE),纯化racE基因进行原核表达,并运用多种在线生物信息学分析软件对该基因编码蛋白质的理化性质、亲/疏水性、信号肽、结构域等进行分析。结果表明：PCR扩增racE基因条带大小为819 bp,对racE基因进行大肠杆菌原核表达,通过构建表达载体和优化表达条件,成功表达了大小为30.15 ku的重组融合蛋白。racE蛋白编码272个氨基酸,氨基酸序列与NCBI中公布的地衣芽孢孢杆菌racE蛋白(GenBank登录号为KAA0845975.1)氨基酸同源性为99.62%。racE蛋白理化性质稳定,是亲水蛋白,无跨膜结构域,不含有信号肽,α-螺旋是其主要的二级结构,主要定位于细胞质中(73.90%)。说明racE基因保守且相对稳定,在谷氨酸的合成中发挥重要作用。     

京尼平甙法测定酶活在β-葡萄糖苷酶高产菌株筛选中的应用

在筛选β-葡萄糖苷酶高产菌株过程中用京尼平甙作底物来测定β-葡萄糖苷酶的活力,在对产物进行显色时,具有显色稳定、重现性好、试剂价格较低等优点。通过水杨苷法作葡萄糖标准曲线,能得到相对酶活与绝对酶活的换算公式,进而得到绝对酶活。实验采用京尼平甙作底物来测定β-葡萄糖苷酶的活力,即京尼平甙法,并从实验室保藏菌和豆豉分离菌中筛选出一株适合β-葡萄糖苷酶产量高的菌株O3。     

肉仔鸡日糖中添加乳杆菌属培养物对消化酶及细菌酶活性的影响

本试验以研究杆菌属培养物对（1）肉鸡小肠（十二指肠远端至回盲结合部）内容物淀粉酶、脂肪酶及蛋白酶活性及（2）小肠内容物和粪便中细菌β－葡萄糖苷酸酶和β－葡萄糖苷酶活性的影响，肉鸡分为3组，分别对应3个日粮处理：基础日粮、基础日粮＋0.1%嗜酸乳杆菌干培养物及基础日粮＋0.1%的12株乳杆菌干混合培养物。结果表明，两个试验组均显著提高了40日龄肉鸡的小肠淀粉酶活性（P＜0.05），但脂肪酶及蛋白酶活不受显著影响，同时还降低了小肠及粪便中β－葡萄糖苷酸酶活及粪便的β－葡萄糖苷酶活，但小肠的β－葡萄糖苷酶活性却未受显著影响。     

β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选及产酶条件优化

本研究从实验室构建的微生物菌库中筛选获得1株β-葡萄糖苷酶产生菌株HHL,结合ITS序列分析方法鉴定其为米曲霉（Aspergillus oryzae）。以β-葡萄糖苷酶酶活为考察指标,通过单因素试验及正交试验对其产酶条件进行优化。结果显示：菌株HHL最优产酶条件为以改良察氏培养基为培养基,pH 6.0,接种量8%,培养温度35℃,培养时间144 h。此条件下,产β-葡萄糖苷酶酶活为48.74 U/mL。     

木质素降解菌的筛选及其漆酶性质研究

为筛选产漆酶的木质素降解菌,采用愈创木酚平板法和RB亮蓝平板法进行菌株筛选,利用16S r DNA序列分析对菌株进行鉴定,通过液体发酵培养对漆酶活性和木质素降解能力进行研究。将漆酶基因cot A克隆到表达载体p ET-32a(+)上获得重组质粒p ET-32a(+)-Cot A并转化到BL21中进行表达,通过酶活测定将表达条件进行优化。结果:从白蚁肠道中成功筛选出1株产漆酶的木质素降解菌,鉴定为枯草芽胞杆菌。漆酶的最适酶活温度为60℃,最适酶活p H为3.5~4.0;0.2 mmol/L Cu2+可诱导菌株漆酶的产生,缩短了产酶时间并提高了酶活性。菌株木质素降解率在液体发酵培养24 h后达到了17.1%。漆酶基因大小为1 542 bp,表达的重组蛋白为85 ku,属于有活性的可溶性蛋白。在IPTG浓度为1mmol/L、Cu2+浓度为0.3mmol/L、诱导时间为9 h的条件下,漆酶蛋白活性可达到113.10 U/L。研究表明,本试验成功筛选出1株降解木质素能力较强的枯草芽胞杆菌,获得可分泌较高活性漆酶的重组菌,为木质素酶在畜牧业生产实践上的应用奠定了基础。     

4种芽孢杆菌来源木聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达及酶活分析

研究旨在比较4种不同来源木聚糖酶基因在大肠杆菌E.coli BL21中表达后的酶活等性质,为生产中筛选高表达量及耐极性木聚糖酶基因提供依据。根据已发表的木聚糖酶基因序列设计引物,分别扩增出浸麻芽孢杆菌(B.macerans)B3、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)B6、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)B10和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B12的木聚糖酶基因片段,经克隆表达后获得4种工程菌。经培养和IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳检测及酶特性分析。测序结果表明,4个基因的开放阅读框均为642 bp。其中前3种木聚糖酶基因均为首次报道。4种重组木聚糖酶在55℃下的酶活分别为:36.16、3.85、7.22、98.98 U/ml。4种重组木聚糖酶的最适反应温度均在50~60℃,且枯草芽孢杆菌木聚糖酶最为耐热。结果提示,枯草芽孢杆菌来源的木聚糖酶具有较高的酶活和较好的耐热性。     

不同培养条件对两株芽孢杆菌酶系的影响研究

一些益生菌如芽孢杆菌能分泌多种酶,提高饲料利用率。试验主要是研究TS-01芽孢杆菌和TS-02芽孢杆菌在不同培养基时,单独培养和混合培养对酶系的影响。研究发现两株菌的淀粉酶和蛋白酶分泌能力较强,而甘露聚糖酶和木聚糖酶活力较低,培养条件对酶活有一定影响。     

大豆异黄酮β-葡萄糖苷酶产生菌的选育及产酶条件研究

以豆豉为材料筛选产大豆异黄酮β-葡萄糖苷酶的菌株,并用京尼平甙法检测相对酶活。以相对酶活最高的野生菌为出发菌(经镜检为杆菌),通过UV和LiCl诱变育种,利用单因素和正交实验进行产酶条件研究确定最佳条件为:黄豆粉1%、酵母膏1%、麸皮2%、KH2PO40.1%、NaCl0.5%、起始pH值7.5、装液量30ml、发酵时间48h、发酵温度37℃、转速70r/min。在该条件下,用京尼平甙法测得该菌株的相对酶活为0.826,水杨苷法测得绝对酶活为5.49μg/ml。     

一株喜油嗜热芽孢杆菌G1201产高温蛋白酶的性质研究及异源表达初探

从高温环境中分离出产高温蛋白酶菌株，以脱脂奶粉为唯一碳氮源，通过形态学、生理生化特性和16S rRNA基因序列测定确定菌株种属|硫酸铵沉淀法获得高温蛋白酶的粗酶，并对其进行酶学性质分析|克隆编码高温蛋白酶的基因序列，构建表达载体在大肠杆菌中进行异源表达。结果表明：筛选到1株产高温蛋白酶的菌株G1201，经鉴定为喜油嗜热芽孢杆菌（Geobacillus thermoleovorans)，所产高温蛋白酶大小52.5 kD，属丝氨酸蛋白酶家族，最适作用温度和pH分别为70 ℃和9.0，Ca2+、Mg2+、吐温20和TritonX-100对酶活有促进作用|异源表达结果显示产物以包涵体的形式存在，目的蛋白复性后含量为0.108 mg/mL。该菌株所产高温蛋白酶可耐受饲料、食品加工过程中的高温环境，具有良好的应用潜力。 [关键词] 喜油嗜热芽孢杆菌|高温蛋白酶|酶学性质|异源表达     

蜡样芽孢杆菌W-3木聚糖酶xynA基因原核表达及其酶学性质研究

【目的】克隆蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)W-3菌株的木聚糖酶基因xynA并进行生物信息学分析,探究其异源表达及酶学特性。【方法】采用同源扩增法克隆xynA基因,构建原核表达载体pCola-xynA,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行异源表达,通过镍柱亲和层析分离纯化并通过SDS-PAGE鉴定重组蛋白,利用在线软件对xynA蛋白进行生物信息学分析。以榉木木聚糖为底物探究xynA在不同温度、不同pH条件下的酶学性质。【结果】xynA基因全长642 bp,含1个完整的开放阅读框,编码213个氨基酸。序列比对结果显示,xynA和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)亚种FZB42木聚糖酶(AJD80562.1)相似性为96%,和类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)NBRC15307木聚糖酶(AAZ17386.1)及高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)同家族木聚糖酶(WP-007407578.1)相似性为94%。xynA蛋白N-端含1个信号肽,理论等电点为9.42,分子质量为23.3 ku,蛋白结...     

玉米赤霉烯酮降解酶在枯草芽孢杆菌中的表达及其对母猪繁殖性能的影响

本试验旨在建立玉米赤霉烯酮(ZEN)降解酶基因ZEN-jjm在枯草芽孢杆菌中的表达体系,确定其产物的生物降解活性及对母猪繁殖性能的作用。克隆ZEN-jjm基因,经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后连接至p HT01表达载体中,构建重组质粒;转化枯草芽孢杆菌,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析ZEN-jjm蛋白表达水平。高效液相色谱法(HPLC)检测表达的ZEN-jjm蛋白降解ZEN的活性。通过对母猪的繁殖性能的评价,确定ZEN降解酶降解ZEN对母猪繁殖性能的影响。双酶切和测序结果表明:ZEN-jjm成功插入p HT01中,SDSPAGE表明获得1株高效表达目的蛋白的重组枯草芽孢杆菌,其大小约为29 ku。HPLC结果表明表达的ZEN-jjm蛋白能有效地降解ZEN;表达的ZEN-jjm蛋白能显著缓解ZEN对繁殖母猪的毒害作用(P0.05)。综上:1)本研究成功构建了表达ZEN-jjm在枯草芽孢杆菌中的表达载体,并在枯草芽孢杆菌中得到了表达。2)表达的ZEN-jjm蛋白具有降解ZEN的生物活性。3)在饲粮中添加ZEN-jjm蛋白能显著降低ZEN对母猪能繁殖性能的危害。     

复合生态菌固态发酵木薯渣工艺参数优化及混菌发酵对木薯渣营养品质的影响

本试验旨在探讨复合微生物固态发酵木薯渣最佳发酵参数,并考察混菌发酵对木薯渣营养品质的影响。从木霉、曲霉、枯草芽孢杆菌和酵母4大类共12株菌中分别筛选出1株发酵效果较好的菌株,以营养改善最佳的菌株为主发酵菌,与其它3株进行不同组合,筛选出最适发酵组合,并考察组合中不同菌种最适接种比例、接种量和菜粕添加量;在此基础上采用正交试验设计,考察发酵时间、发酵温度、料水比以及初始p H间交互作用对木薯渣营养价值的影响。结果表明:每克发酵原料按黑曲霉-II∶枯草芽孢杆菌-II∶酿酒酵母=3∶2∶1的比例接种2.5×106个微生物(孢子),菜粕添加量为20%,发酵时间4 d,发酵温度35℃,料水比1∶2,初始p H 4效果最好。以最优条件发酵木薯渣,以干物质计算,发酵后木薯渣粗蛋白由10.77%提高到17.92%(P0.05),粗纤维由21.50%降低到16.54%(P0.05)。此外,发酵后产物羧甲基纤维素酶、滤纸酶、β-葡萄糖苷酶酶活分别达到12.31、3.92和3.95 U/g DM。利用复合微生物固态发酵可以显著提高非常规饲料原料木薯渣的营养价值。     

骆驼瘤胃内优势纤维素降解菌酶活种类及活力测定方法比较研究

利用传统纤维素酶活力测定方法———3,5-二硝基水杨酸法(DNS法)和根据试验具体情况自行构建的纤维素酶活力测定方法,对健康骆驼瘤胃内自行分离的7株优势纤维素降解菌的纤维素酶酶活种类及活力进行了测定。测定结果为:DNS法中不同菌株的CX酶酶活大小为1#2#17#10#15#8#20#;C1酶酶活大小为1#2#17#20#10#15#8#;β-葡萄糖苷酶酶活大小为1#2#17#10#20#8#15#;总酶活大小为1#2#17#8#10#15#20#。自行构建方法中CX酶酶活大小为(1#、2#、15#)(10#、17#)(8#、20#);C1酶酶活大小为(1#、2#、15#、17#)(8#、10#)20#;β-葡萄糖苷酶酶活大小为(1#、2#、8#、10#、15#、17#)20#;总酶活大小为2#1#15#17#10#8#20#。根据测定结果可以看出,2种方法所测定的酶活大小趋势较为接近,但在试验过程中DNS法出现诸多问题,弊端较多,而自行构建的方法能够克服DNS法的缺点,使其结果更为简便直观,如果结合DNS法试验数据,则可以使试验结果更加精确。     

一株产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及其酶促反应适宜条件初步研究

为了分离、筛选产纤维素酶益生菌,确定其酶促反应适宜条件,利用羧甲基纤维素钠等作为筛选培养基,结合刚果红染色法,从玉米青贮饲料样品中筛选产纤维素酶益生菌,并通过形态学和系统进化树方法鉴定分离菌。同时对培养时间、pH和温度等酶促反应条件进行了研究。结果表明,筛选出1株可降解羧甲基纤维素,并产生清晰透明圈的菌株。经形态学观察和16SrRNA基因序列分析,鉴定该菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。粗酶液中滤纸酶活为1.5U/mL,外切葡聚糖酶活为1.3U/mL,内切葡聚糖酶活为6.4U/mL,β-葡萄糖苷酶活为2.3U/mL。酶促反应的适宜条件为pH 5.5,温度50℃,粗酶液为培养3d后发酵液上清。解淀粉芽孢杆菌分离株具有一定的产纤维素酶能力,在玉米秸秆生物降解与利用方面具有潜在的开发价值。     

椰果内生枯草芽孢杆菌YZ-21甘露聚糖酶基因的克隆、表达及酶学性质研究

为了提高β-甘露聚糖酶的活性及稳定性,通过基因克隆技术克隆并表达了一株分离自椰果的内生枯草芽孢杆菌YZ-21(Bacillus subtilis YZ-21)β-甘露聚糖酶基因ManA,并使用3,5-二硝基水杨酸法(DNS)测定了酶活性及稳定性。结果表明：β-甘露聚糖酶基因ManA序列全长1 104 bp,与相同来源的β-甘露聚糖酶同源性高达97.56%,具有ManA保守结构域,符合糖苷水解酶家族GH26的典型特征。将ManA连接到pET-32a表达载体上,构建重组表达质粒pET-ManA,并导入大肠杆菌BL21(DE),经诱导获得了β-甘露聚糖酶基因ManA的高效表达。表达产物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶电泳分析,显示条带大小约为56.07 ku。重组酶活性为372.86 U/mL,酶学性质研究发现其最适反应温度为40℃,最适pH为7.0,最佳反应底物是瓜豆胶,酶活性能够达到392.54 U/mL。在55℃处理120 min后,酶活仍保留69.8%,pH为4.0～9.0时处理30 min后酶活性均能保留60%以上,且金属离子Ca²⁺、Co     

瘤胃源枯草芽孢杆菌BX1-12的筛选鉴定及其产酶抑菌活性

本试验通过筛选瘤胃环境中具产酶抑菌活性的芽孢杆菌,为开发功能型饲用微生态制剂奠定基础。采用可培养的方法从健康高产奶牛瘤胃液中分离芽孢杆菌,并测定其产酶能力及抑菌活性,同时对筛选到的功能菌株进行生理生化和分子生物学鉴定。结果显示：从健康高产奶牛瘤胃液中筛选出一株芽孢杆菌BX1-12,其产纤维素酶、蛋白酶及α-淀粉酶活力分别为27.33、137.54 U/mL和1450.53 U/100 m L,同时该菌具广谱抑菌效果,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和伤寒沙门氏菌的抑菌圈直径分别为13.62、23.21 mm和25.97 mm。结合Biolog生理生化实验及16S rRNA序列分析,鉴定该菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。综上,从健康高产奶牛瘤胃液中分离得到的这株枯草芽孢杆菌BX1-12,具有产多种酶活及广谱抑菌的能力,是一株良好的用于奶牛微生态制剂的候选菌株。     

黑曲霉高产纤维素酶活突变株ZM-8的筛选

对航空诱变的黑曲霉(Aspergillus niger)进行筛选,得到纤维素酶高产突变株ZM-8。以玉米秸秆粉为主要碳源,经固体发酵培养,测得其滤纸酶(FPA)、纤维二糖水解酶(C1)、葡聚糖内切酶(CMCase)、β-葡萄糖苷酶(β-Glase)的酶活力分别为110.2、389.9、489.3U/g和1208.1U/g,比出发菌株各组分的酶活分别提高2.1、3.5、1.7倍和1.8倍。经过5次继代固体发酵试验,证明该菌株具有较好的产酶稳定性。     

高产纤维素酶菌的筛选及鉴定

为了获得高产纤维素酶的菌株,从纤维素含量丰富的地方进行取样,如稻秆堆积土壤、腐木堆积土壤等,以刚果红水解圈的大小作为判断标准,从12份样品中筛选出6株产酶能力强的菌株,并对其进行生理生化及16S r DNA鉴定,结果表明,2号为蜡状芽孢杆菌,5号为枯草芽孢杆菌,9号为巨大芽孢杆菌,10号为地衣芽孢杆菌,11号为微小杆菌,12号为绿色木霉。并把这些菌种用于固态发酵,选择麸皮和米糠两种不同的纤维质材料来进行发酵,用CMC法测量了发酵后的酶活力,发现地衣芽孢杆菌发酵后的活力最强,酶活值分别达到3 437 U/ml和8 541 U/ml,在生产上有潜在的应用前景。通过对地衣芽孢杆菌发酵温度、时间及含水量的初步优化,获得其固态发酵的最优化条件:培养温度30℃,培养时间60 h,初始水分含量40%。试验为进一步利用此菌株进行工业化生产奠定了基础。     

纤维素酶产生菌灰白青霉HML0233的分离及系统分类研究

通过滤纸纤维素平板及发酵产酶鉴定,从腐木下土壤中分离出一株分解纤维素能力较强的真茵HM10233.该菌株的CMC酶活为31.04 U/mL,β-葡萄糖苷酶酶活为47.66 U/mL,滤纸酶活为5.28 U/mL.根据形态特征观察初步推测该菌株属于青霉属;经5.8S rDNA基因两侧的内转录间隙ITS序列同源性分析及构建系统进化树分析.该菌株和Penicillium canescens NKRL 35656同源性很高,推测该菌株为灰白青霉(Penicilliumcanescens).