黄花苜蓿花药培养再生体系的建立与单倍体鉴定

花药组织培养再生体系的构建是单倍体育种的重要途径之一。本研究对呼伦贝尔黄花苜蓿(Medicago falcate‘Hulunbeier’)进行了花药组织培养研究并建立了花药组培再生体系。结果显示,液体悬浮培养基比固体培养基更适合呼伦贝尔黄花苜蓿花药愈伤组织的培养,其愈伤形成的培养条件为B5培养基+0.5 mg·L~(-1) 2,4-D+0.25 mg·L~(-1) 6-BA+0.4mg·L~(-1) NAA+3.0mg·L~(-1) KT;分化培养基为MS+1.0mg·L~(-1) 2,4-D+0.5mg·L~(-1) 6-BA+2%蔗糖+0.7%琼脂;生根培养基为1/2MS+0.1mg·L~(-1) NAA+2%蔗糖+0.7%琼脂;获得的再生植株经流式细胞仪鉴定,其单倍体比例高达27%。     

荒漠肉苁蓉组织培养和细胞悬浮培养体系的建立

为了获得稳定的肉苁蓉资源,采用植物组织培养技术和细胞培养技术,以肉苁蓉（Cistanche deserticola Y.C. Ma）的肉质茎为研究材料,诱导出愈伤组织并继代培养,建立一种稳定的肉苁蓉细胞悬浮培养体系。研究结果表明：①肉苁蓉愈伤组织的最佳培养体系为：MS+PVP 2 000 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+GA₃ 1.0 mg/L+蔗糖30 g+琼脂7.0 g/L,pH值为5.8,培养条件为：光照12 h/d、温度（25±1）℃;其中,淡黄色的肉苁蓉愈伤组织为高产细胞株系。②肉苁蓉细胞的悬浮培养体系为：B5+ GA₃ 2.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L,pH值为5.8,培养条件为：光照18 h/d、培养温度（25±1）℃、摇床转速110 r/min。③细胞接种浓度为4.0 gDW/L时,细胞干重达到最大值,为12.350 gDW/L,该体系为最佳培养体系。该研究建立了肉苁蓉愈伤组织培养体系和稳定的肉苁蓉细胞悬浮培养体系。     

多花黑麦草特高和多年生黑麦草四季高频组培再生体系的优化与建立

对在贵州地区广泛种植的多花黑麦草特高(Lolium multiflorum‘Tetragold’)和多年生黑麦草四季(L.perenne‘Four seasons’)的成熟种子进行了愈伤组织诱导及植株再生的研究,建立了两个品种的胚性愈伤组织高频诱导与再生体系。结果表明,剥去成熟种子的颖壳,切除1/3胚乳端,将特高接种于CC+7mg·L~(-1) 2,4-D+0.5mg·L~(-1) 6-BA、四季接种于CC+5mg·L~(-1) 2,4-D+0.5 mg·L~(-1) 6-BA的培养基中,在明显降低组培污染率的同时,能分别得到65.52%和63.55%的最高愈伤组织诱导率;将两个品种诱导出的愈伤组织转移在MS+0.5 mg·L~(-1) 2,4-D+0.5mg·L~(-1) 6-BA+1.25mg·L~(-1) CuSO4+1.0g·L~(-1) CH的继代培养基上,能促进质量较好的Ⅱ型胚性愈伤组织的形成;根据后续转化试验所选用的植物表达载体pCAMBIA 1300的抗性特点,30~40mg·L~(-1)的潮霉素是两个品种愈伤组织最佳的筛选剂和临界浓度;特高的胚性愈伤组织接种在MS+2.0 mg·L~(-1) 6-BA+0.5 mg·L~(-1) NAA+0.1mg·L~(-1) TDZ的培养基上,可以产生86.37%的最高分化率,四季的胚性愈伤组织接种在MS+6.0 mg·L~(-1) 6-BA+0.3mg·L~(-1) NAA+5.0mg·L~(-1) KT的培养基上,能得到85.40%的最高分化率;生根培养基1/2MS+0.5 mg·L~(-1)NAA+0.5mg·L~(-1) IAA能让两个品种分化出的不定芽形成100%的生根率;以腐殖土∶蛭石∶砂壤土=1∶1∶1的混合材料作为营养土,能保证组培再生苗达到99%以上的成活率。优化建立的高频组培再生体系为下一步的遗传转化奠定了基础。     

三叶青细胞悬浮培养体系的条件优化和总黄酮含量的测定研究

试验旨在探讨使用三叶青细胞悬浮培养生产三叶青黄酮的可行性。试验以野生三叶青叶片和茎段为外植体诱导愈伤组织，测定增殖、单细胞培养及其总黄酮含量，悬浮培养细胞经不同液体培养基配方、光照方式、摇床转速、接种量、p H值、培养天数培养，以乙醇为溶剂，回流提取总黄酮，使用NaNO₂-Al(NO₃)₃显色，在500 nm处用紫外分光光度计测定总黄酮含量。结果显示，三叶青最佳培养基为MS+1.5 mg/L 6-BA+2.5 mg/L 2-4D+3 mg/L NAA+0.4 mg/L 6-KT,8 h/d光照，摇床转速110 r/min，接种量25 m L/L,pH值5.8，培养时间为13 d。研究表明，三叶青细胞培养可生产黄酮，最优培养条件下三叶青细胞悬浮培养体系黄酮积累量可达20.524 mg/g。     

大花红景天外植体筛选及愈伤组织诱导研究

以大花红景天种子为材料进行无菌苗培养,筛选和优化最佳外植体和愈伤组织诱导培养基,为大花红景天快速繁殖提供理论依据。大花红景天无菌苗培养基为1/2MS,pH5.4,置于湿度75±2%,光照强度2 000lx,光照12h(20±1℃)∶黑暗12h(10℃±1℃)环境中培养;最佳外植体为根颈顶端组织;愈伤组织形成最佳培养基为MS+1.5mg·L~(-1) 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D),1.5mg·L~(-1 )6-苄氨基嘌呤(6-BA),0.5mg·L~(-1)6-糠基氨基嘌呤(KT),0.2mg·L~(-1)吲哚-3-乙酸(IAA),置于湿度75±2%,光照强度2 000lx,光照8h(20±1℃)∶黑暗16h(10±1℃)环境中培养,出愈率最高可达95%。本试验获得大花红景天最佳的无菌苗培养条件,根颈顶端组织最佳外植体,优化愈伤组织诱导培养基,提高了诱导率,适宜在低海拔条件下进行快速诱导大花红景天的愈伤组织和植株再生,为大花红景天快速繁殖和规模化生产提供了依据。     

外源CO对筋骨草β-蜕皮甾酮积累的影响

为了明确一氧化碳(CO)对植物次生代谢物的调控作用,本研究分析了多花筋骨草(Ajuga multiflora)和匐枝筋骨草(A.lobata)根和叶诱导愈伤组织中β-蜕皮甾酮的含量,并将β-蜕皮甾酮含量高的匐枝筋骨草根诱导的愈伤组织进行悬浮培养。将不同浓度的CO供体氯高铁血红素添加到筋骨草悬浮培养体系中发现,CO促进了悬浮细胞中β-蜕皮甾酮的合成。同时发现,当处理8d时,低浓度的CO处理(8μmol·L-1)使β-蜕皮甾酮的积累量提高了80.82%,但高浓度处理(12、16、20μmol·L-1)的悬浮细胞中β-蜕皮甾酮含量显著低于对照组(P0.05)。上述结果初步证实了低浓度CO(8μmol·L-1)处理对匐枝筋骨草悬浮细胞中β-蜕皮甾酮的积累具有促进作用。     

长穗偃麦草成熟种胚高频再生体系

以长穗偃麦草(Elytrigia elongata)成熟胚为外植体,在MS基本培养基的基础上,附加不同浓度的2,4-D、6-BA和NAA等植物生长调节剂,开展对其愈伤组织诱导、绿苗分化和生根等的试验研究。结果表明,适宜愈伤组织诱导的培养基为MC (MS+30 g·L~(–1)麦芽糖+1 g·L~(–1) CH+200×5 mL·L~(–1) VB+0.5 g·L~(–1) L-Pro+3 g·L~(–1)植物凝胶)+3 mg·L–12,4-D+0.025 mg·L~(–1) 6-BA,诱导率达77.78%,4周后可见淡黄色愈伤组织;最佳分化培养基为MC (MS+30 g·L~(–1)麦芽糖+1 g·L~(–1) CH+200×5 mL·L~(–1) VB+0.5 g·L~(–1) L-Pro+3 g·L~(–1)植物凝胶)+0.1 mg·L~(–1) 2,4-D+3 mg·L~(–1) 6-BA,分化率达66.67%,4周后出现芽点,同时伴随根毛发生;最佳生根培养基为MR(1/2MS+15 g·L~(–1)麦芽糖+3 g·L~(–1)植物凝胶)+0.5 mg·L~(–1) NAA,移栽后全部成活。从而建立了一套从长穗偃麦草"成熟种胚–诱导愈伤组织–绿苗分化–生根–移栽"的组培再生体系,为进一步研究其抗逆分子机制奠定了重要基础。     

芦竹属新材料绿洲3号的愈伤组织诱导

为了诱导愈伤组织,本研究以绿洲3号(Arundo)为试验材料,分别以NaClO(商品名为安替福民)和HgCl2(升汞)对其茎段进行消毒,然后取无菌茎段及从无菌茎段长出来的幼芽和幼叶为外植体,利用不同浓度的激素及1.0g·L~(-1)聚乙烯吡咯烷酮对外植体进行愈伤组织诱导。结果表明,以0.1%HgCl_2溶液消毒18min的消毒效果最佳,污染率为13%;而NaClO不能有效地消毒,且对茎段有一定的毒害作用。以MS+0.5 mg·L~(-1) 6-BA+1.0g·L~(-1) PVP+3.0mg·L~(-1) 2,4-D培养基配方的诱导效果最佳,且3种外植体中愈伤组织最难诱导的为幼叶,其次是茎段,最易诱导的为幼芽。其中,1.0g·L~(-1) PVP能显著促进芽诱导率,使得出愈率达到100%。     

芦竹愈伤组织诱导及再生体系的建立

本研究首先对芦竹(Arundo donax)的侧枝茎尖及带腋芽幼茎段进行了根诱导并产生无菌苗,然后对芦竹的幼叶段、无菌苗叶段、根段、无菌苗茎段、带腋芽幼茎段5种外植体进行了愈伤组织的诱导试验,建立从愈伤组织到再生植株的培养体系。结果表明,MS+0.2 mg·L~(-1)NAA+1.0 mg·L~(-1)KT既可以促进侧枝茎尖及带腋芽幼茎段根系的发育,也能促进二者芽的生长,从而产生无菌苗。在MS+1.0 mg·L~(-1)2,4-D+0.1 mg·L~(-1)KT培养基上,幼叶段和无菌苗叶段都没能产生愈伤,少数根段产生了愈伤但量很少,多数的无菌苗茎段都能产生愈伤但量相对较少;而带腋芽幼茎段则可以在腋芽基座部位诱导出大量的愈伤组织,经过继代增殖可形成质地松软的乳白色愈伤,放置于MS+0.5 mg·L~(-1)KT+1.0 mg·L~(-1)6-BA培养基上可同时分化出大量的根和芽来,显示了芦竹的愈伤组织具有很强的分化和再生能力,也表明在芦竹上可以通过愈伤组织的诱导、分化及植株再生这一技术体系来大大提高其繁殖系数。本研究可以为优良芦竹品种的快繁以及在芦竹上开展现代生物技术的研究和应用提供初步的技术基础。     

苜蓿花药悬浮培养体系的建立及其影响因素

苜蓿(Medicago sativa L.)花药悬浮培养体系的建立可为苜蓿体细胞杂交、遗传转化以及获得苜蓿单倍体,建立苜蓿加倍单倍体群体(DH)提供快捷有效的途径。采用固-液培养基结合的方式建立苜蓿花药悬浮培养体系,通过探索体系建立的基础条件及其影响因素,可建立适宜的苜蓿花药悬浮培养体系。结果表明,苜蓿悬浮培养体系中,基本液体培养基为NB培养基,培养液最佳组合为NB+2,4-D 0.3 mg·L^-1+NAA 0.3 mg·L^-1,蔗糖2%;建立苜蓿花药悬浮细胞系,应选取淡黄色或乳白色,结构疏松,颗粒状胚性愈伤组织为悬浮培养的基础材料;苜蓿花药悬浮细胞系继代周期为6~8 d;苜蓿花药悬浮培养时初始接种量为2g/30mL时悬浮细胞PCV、鲜重以及干重的增殖倍数最高,增殖倍数均超过4倍;植物生长调节剂2,4-D的添加浓度以0.3 mg·L^-1为宜;糖作为组织培养过程中唯一的碳源,在苜蓿细胞悬浮培养体系中应有一定的浓度范围。因此,苜蓿花药悬浮培养中,蔗糖浓度为2%-3%时效果最好。     

野生黄花苜蓿组织培养及再生体系研究

以呼伦贝尔草原野生黄花苜蓿(Medicago falcata L.)无菌苗的子叶和下胚轴为外植体,对其组织培养及再生体系进行系统的研究,以期为其下一步转基因试验提供良好的受体。结果表明:最佳愈伤诱导培养基为MS+1.5 mg·L^-1 2,4-D+0.4 mg·L^-1 6-BA+3%蔗糖+0.7%琼脂,下胚轴和子叶的最佳愈伤诱导率均可达到100%。最佳胚性愈伤形成培养基为MS+0.5 mg·L^-1 KT+0.1 mg·L^-1 NAA+2%蔗糖+0.7%琼脂,胚性愈伤形成率为81.5%;最佳分化芽形成培养基为MS+0.25 mg·L^-1 KT+0.05 mg·L^-1 NAA+2%蔗糖+0.7%琼脂,分化芽形成率为36.5%。最佳生根培养基为1/2MS+0.5 mg·L^-1 NAA+1.5%蔗糖+0.7%琼脂,生根率为93.3%。愈伤诱导结果显示,供试黄花苜蓿材料个体间组织培养再生性存在较大差异,在同一激素水平上有大约1/3植株的愈伤状态优于其他植株。     

大花金挖耳细胞悬浮培养及其胞内代谢产物化感潜力的研究

为了优化大花金挖耳(Carpesium macrocephalum Franch.et Sav.)细胞悬浮培养的条件,评价其胞内代谢产物的化感潜力。本文研究了无机盐浓度不同的MS,1/2MS,B5,1/2B5,NT和1/2NT等6种培养基及NT中N,P,Ca,Mg,K等5种大量元素含量对大花金挖耳悬浮培养细胞生物合成黄酮的影响,并采用微量活性测定法测定了其细胞培养物的化感潜力。结果表明:大花金挖耳细胞悬浮培养的最优基本培养基是NT,NT中总氮浓度为50.62 mmol·L^-1,NH₄⁺:NO₃^-为2:3时,黄酮含量最高为1.38%,H₂PO₄^-,Ca²⁺,Mg²⁺,K⁺等离子依次在5.00,1.50,0.50~1.00,14.39~27.81 mmol·L^-1范围内有利于大花金挖耳悬浮培养细胞的生长和黄酮合成;大花金挖耳悬浮培养细胞的粗提物对供试的紫花苜蓿(Medicago sativa L.)、刺儿菜(Cephalanoplos segetum(Bge.)Kitam.)、反枝苋(Amaranthus retroflexus L.)、小白酒草(Conyza canadensis(L.)Cronq.)和小麦(Triticum aestivum L.)等5种植物幼苗根生长均具有抑制作用,毒力依次为10.66,12.32,15.85,102.16,210.96 mg·mL^-1。     

Lyz-GFP双元基因在苜蓿愈伤组织中的转化

利用农杆菌介导法将溶菌酶(Lyz)与绿色荧光蛋白(GFP)基因转入"甘农1号"杂花苜蓿(Medicago sativa Martyn)和"甘农3号"紫花苜蓿(Medicagosativa L.)品种中,获得含有该双元基因的苜蓿转基因愈伤组织;采用荧光检测和PCR扩增技术,检测到溶菌酶Lyz和绿色荧光蛋白GFP基因在苜蓿愈伤细胞中的表达;研究该双元基因在苜蓿品种"甘农1号"和"甘农3号"中转化的若干影响因素,确定适宜的转化条件以期提高基因转化效率。结果表明:75 mg·L^-1的卡那霉素对苜蓿愈伤组织的生长具有显著抑制效应;300mg·L^-1头孢霉素能够有效地抑制农杆菌LBA4404的生长;OD₆₀₀值为0.4-0.5的农杆菌适宜的侵染时间是10min;经预培养3-4d的材料侵染后再共培养3d之后,在愈伤组织诱导培养基MS₊2,4-D 2.0mg·L^-1+KT0.5 mg·L^-1+0.6%琼脂+2.5%蔗糖的培养基上诱导出抗性愈伤组织;"甘农1号"和"甘农3号"的抗性愈伤组织诱导率分别为35%和32%。     

千日红无菌苗生长及试管开花诱导

为进一步探究千日红(Gomphrena globosa)无菌苗生长和试管开花诱导机制,在组培条件下,以带顶芽的千日红茎段为对象,研究培养基中蔗糖含量、外源激素种类(细胞分裂素BA和生长素NAA)及浓度、生长素运输抑制剂(TIBA和NPA)对氮诱导的千日红生长和试管开花的影响。结果表明,蔗糖是千日红无菌苗生长和开花诱导最关键的因素,在不含蔗糖的培养基中,开花率为0且生根较少;随蔗糖含量的增加开花率逐渐提高,并在80g·L~(-1)时达最大(80.72%);而根系长度和数量及植株长势在蔗糖含量为20~40g·L~(-1)时较好。BA对无菌苗生长和开花的诱导效应大于NAA,当BA浓度为1.0mg·L~(-1)时,开花率达最大值60.14%,此时无菌苗长势也较好;而NAA对各指标均无显著性影响。TIBA明显降低了千日红试管开花率并且显著抑制根系的生长,而且在同等条件下对开花率和各生长指标的抑制效应大于NPA。综上所述,氮诱导千日红离体开花和正常生长过程中蔗糖是不可缺少的,并且受外源细胞分裂素的影响和体内激素的调控。     

偏关苜蓿种子萌发及植株再生体系优化

本试验以偏关苜蓿（Medicago sativa ‘Pianguan’）种子为材料,从不同消毒剂、培养基成分对种子萌发以及不同激素及浓度配比对愈伤组织诱导分化的影响等方面展开研究。结果表明：0.1% HgCl₂消毒6 min后置于1/4MS培养基上的种子发芽率、发芽势较高,霉烂率低;不同外植体的最优愈伤诱导培养基为MS+2 mg·L^-1 2,4-D+0.4 mg·L^-1KT,下胚轴与子叶最高诱导率分别为100%和98%;最优愈伤分化培养基为UM+1.6 mg·L^-1KT,下胚轴与子叶最高分化率分别为59%和44%;不定芽转至1/2MS生根培养基,生根率达64%。本研究系统构建了优化的偏关苜蓿植株再生体系,可为后续遗传转化提供技术支撑。     

猪丁型冠状病毒在悬浮培养猪肾细胞LLC-PK1上的增殖特性分析

旨在分析猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)在悬浮培养的猪肾细胞LLC-PK1上的增殖特性,为PDCoV灭活疫苗的规模化生产提供细胞材料。采用逐步降血清法优化LLC-PK1细胞悬浮培养工艺;利用有限稀释法筛选PDCoV适应性细胞株;利用间接免疫荧光法鉴定PDCoV对LLC-PK1细胞的感染性;分别对PDCoV接种LLC-PK1悬浮细胞的初始密度、MOI、收毒时间、TPCK胰酶浓度等参数进行优化,确定最佳悬浮培养条件。成功筛选出可高效增殖PDCoV的单克隆悬浮细胞株LLC-PK1Sa,且利用其增殖的PDCoV可特异性的感染LLC-PK1细胞;PDCoV按MOI为10^-3接种于密度为2×10⁶ cells·mL^-1的LLC-PK1Sa细胞,当TPCK胰酶终浓度达到7.5 μg·mL^-1时,接毒后48 h收获的病毒液滴度最高。本研究首次实现了PDCoV在LLC-PK1Sa悬浮细胞中的高效增殖,并对悬浮培养条件进行了初步优化,可为PDCoV灭活疫苗的规模化生产提供理论参考。     

生物反应器培养BHK-21悬浮细胞增殖伪狂犬病病毒工艺优化

旨在筛选伪狂犬病病毒（PRV）敏感的BHK-21细胞并分析其生长和病毒增殖特性,优化反应器中BHK-21悬浮细胞的培养和病毒增殖条件,建立生物反应器培养BHK-21悬浮细胞增殖PRV工艺。本研究利用响应面和单因素优化法,以细胞生长动力学特性、TCID₅₀病毒滴度等参数为指标,优化1.2 L生物反应器中BHK-21悬浮细胞的最佳培养和增殖病毒条件,在5 L生物反应器中进一步批培养验证。结果显示,筛选获得PRV高敏感的BHK-21-02贴壁细胞和BHK-21-XF02悬浮细胞各1株,BHK-21-XF02悬浮细胞在含3%血清的SLM-BHK低血清培养基和SFM-BHK无血清培养基中均能实现良好的生长和病毒增殖。利用响应面法优化得到1.2 L反应器最佳培养条件为接种密度1.20×10⁶cells·mL^-1、搅拌转速120 r·min^-1、DO值40%,5 L反应器批培养72 h细胞密度可达（7.61±0.18）×10⁶ cells·mL^-1、细胞活率为（96.93±1.18）%。利用单因素法优化得到1.2 L反应器最佳病毒增殖条件为MOI 0.001、培养温度37℃、细胞密度2.0×10⁶cells·mL^-1、搅拌转速80 r·min^-1,5 L反应器批培养接毒后48 h病毒滴度达到最大值（7.13±0.11） lgTCID₅₀·mL^-1。本研究可为PRV疫苗相关研究和规模化生产提供参考。     

青绿苔草(Care breviculmis)愈伤组织诱导与再生体系的建立

为建立青绿苔草高效的再生体系,本研究以青绿苔草的种子为外植体,探究不同植物激素配比对愈伤组织诱导、愈伤分化和生根的影响。结果表明：MS+1.5 mg·L^-1 NAA+0.5 mg·L^-1 6-BA+2.0 mg·L^-1 2,4-D为诱导愈伤的最佳培养基,诱导率可以达到68.3%,愈伤表现为松散的黄色颗粒;MS+1.0 mg·L^-1 NAA+1.0 mg·L^-1 6-BA为最佳分化培养基,分化率为93.8%,不定芽数量达到40个,长势良好;不定芽在1/2 MS培养基中生根效果最好,其根长、株高和生根数量均显著高于其他处理。本研究建立了高效的青绿苔草再生体系,为研究青绿苔草的遗传转化及应用生物技术育种奠定了基础。