猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR

根据GenBank公布的猪瘟病毒基因组5'非编码区基因序列进行同源性比较分析,选择保守序列区作为扩增区域,设计1对特异性扩增引物,通过优化反应条件,建立了一个用于猪瘟病毒快速定量检测的SY13R GreenⅠ荧光定量RT-PC R方法.试验结果表明该方法重复性好,反应批内循环阈值差异不显著.与猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型等猪源病毒无交叉反应,具有高度的特异性,而且灵敏度高,最小检出量为2×10(2)病毒基因组拷贝数.利用此方法对15例临床样本进行检测,其结果与兔体交又免疫试验一致,表明此方法可作为猪瘟实验室快速诊断和疫情监测的一种快速、准确、简便的检测工具.     

猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR的建立及其对人工感染猪体内猪瘟病毒的检测

本研究应用猪瘟病毒通用引物和野毒特异性TaqMan探针,并以质粒作为阳性标准品,结合Corbett公司的RotorGene3000荧光定量PCR仪,建立了一种敏感、特异、重复性好的快速检测猪瘟病毒核酸载量的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。该方法在10^8-10^1范围内具有良好的线性关系,可检测到初始模板中10拷贝/μL的病毒核酸,与本实验室建立的RT-套式PCR（RT-nPCR）具有相近的敏感性,二者对152份不同样品检测符合率达94.7%。应用本方法对人工感染10^6TCID50猪瘟石门强毒的猪只感染后0-14 d全血中猪瘟病毒RNA进行了定量检测,揭示了猪瘟病毒在猪体内复制的动态变化,证实了感染猪临床表现与病毒滴度存在明显的时间相关性。此外发现,在同居感染猪出现猪瘟临床症状前3-4 d可从其全血中检出病毒RNA。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测猪瘟疫苗病毒含量

为建立一种能够快速定量检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的实时荧光定量RT-PCR方法。对GenBank登录的25株猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株基因组全序列进行比较分析,在其高度保守的5′端非编码区设计1对针对猪瘟兔化弱毒疫苗的特异性引物,扩增片段为245 bp,且不与牛病毒性腹泻病毒以及其他猪源病毒发生非特异性反应。应用实时荧光定量RT-PCR法对16份猪瘟脾淋苗和细胞苗进行定量检测,结果表明,102拷贝/μL的总RNA即能得到特异性扩增,在107~102拷贝/μL线性范围内有良好的扩增曲线,并与兔体定型热反应有良好的相关性。该法具有敏感性、特异性、重复性好等优点,可望取代传统的兔热法用于猪瘟疫苗生产过程中的效价测定及指导疫苗的配制,也为猪瘟病毒分子生物学研究提供一种新的有效工具。     

用荧光定量RT-PCR方法检测猪瘟病毒

为了建立能特异检测不同基因型猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV),同时又能区分其他瘟病毒的基因检测方法,本实验针对CSFV基因组5′端非编码区设计并合成了简并引物和TaqMan探针,在优化反应条件的基础上,成功地建立了特异检测CSFV的荧光定量RT-PCR检测方法。再以已知滴度的CSFV石门株血毒总RNA反转录产物建立标准品,该标准品可以用于定量临床样品中的CSFV滴度,所建立的荧光定量PCR方法可以灵敏地检测出10~(-0.82)个TCID_(50)病毒含量。最后用建立的方法对108份临床样品进行检测并同时进行病毒分离,荧光定量PCR方法检测出73份阳性样品且与病毒分离的符合率为100%,而常规RT-PCR只检测出54份阳性样品,表明本荧光定量RT-PCR法在检测猪瘟病料上具有潜在的应用价值。     

猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立和初步应用

根据GenBank公布的猪瘟病毒基因组5′非编码区基因序列进行同源性比较分析,选择保守序列区作为扩增区域,设计1对特异性扩增引物,通过优化反应条件,建立了一个用于猪瘟病毒快速定量检测的SYBR Green Ⅰ 荧光定量RT-PCR方法。试验结果表明该方法重复性好,反应批内循环阈值差异不显著。与猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型等猪源病毒无交叉反应,具有高度的特异性,而且灵敏度高,最小检出量为2×102病毒基因组拷贝数。利用此方法对15例临床样本进行检测,其结果与兔体交叉免疫试验一致,表明此方法可作为猪瘟实验室快速诊断和疫情监测的一种快速、准确、简便的检测工具。     

猪瘟病毒的实时荧光RT-PCR检测

应用实时荧光RT-PCR方法对12份猪瘟可疑病料进行了检测,结果有9份为阳性,阳性率为75%（9/12）,并对这12份病料进行猪瘟直接免疫荧光抗体试验,结果与猪瘟实时荧光RT-PCR检测结果基本一致,结果证明,应用实时荧光RT-PCR方法诊断临床中的猪瘟病例可行,并具有快速、准确、敏感的特点。     

猪瘟兔化弱毒疫苗中病毒含量实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立敏感、特异的评价猪瘟兔化弱毒(HCLV)疫苗中病毒含量的实时荧光定量RT-PCR方法,参照中国猪瘟石门株兔化弱毒全长序列,在猪瘟兔化弱毒活疫苗基因组5'非编码区设计1对标准品引物、1对特异性引物和1条探针,建立检测猪瘟兔化弱毒活疫苗病毒含量的实时荧光定量RT-PCR方法.该方法检测的敏感度达1.20×10⁵拷贝/mL;对猪繁殖与呼吸综合征、猪乙型脑炎、仔猪副伤寒和猪伪狂犬病4种活疫苗基因组扩增结果均为阴性;重复性试验结果显示,批内变异系数为0.29%～0.39%,批间变异系数为0.32%～0.61%.应用此方法对6个不同厂家生产的7种猪瘟兔化弱毒活疫苗中病毒含量进行了检测,发现不同厂家生产的疫苗中病毒含量存在较大差异.结果表明,建立的猪瘟兔化弱毒疫苗实时荧光定量RT-PCR方法能特异地检测疫苗病毒含量,可用于初步评价猪瘟兔化弱毒疫苗抗原含量.     

猪瘟病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

本研究在CSFV 5'端非编码区设计一对引物和一条特异性TaqMan探针,以构建的重组质粒为标准品,建立了一种检测CSFV的荧光定量PCR方法(FQ-PCR),对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验.结果显示,可特异地检测CSFV,该方法在101～107拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,灵敏度可达10拷贝/μL,重复...     

牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了建立一种快速、特异、灵敏的检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)Taq Man实时荧光定量RT-PCR的方法,根据NCBI GenBank上已公布的BVDV、猪瘟病毒(CSFV)核酸序列进行比对,利用Oligo 6.71软件设计一对引物及一条探针,建立了检测BVDV的Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法。通过对该方法的特异性、重复性及其敏感性进行相关试验,结果表明该方法检测出BVDV标准毒株Oregon C_(24)V为阳性,猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和CSFV的检测均为阴性。对BVDV标准毒株最低检测量达到10~(-2.5) TCID_(50)。该方法检测同一样品重复进行8次检测,结果均一致,表明方法的重复性较好。应用该方法对6批猪瘟疫苗专用血清进行BVDV检测,阳性率为16.7%;猪瘟弱毒苗中未检出BVDV。建立的BVDV Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法为生产无BVDV污染的猪瘟苗提供了有力的保障。     

实时荧光定量RT-PCR方法检测禽流感病毒

根据禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)M基因上的保守序列,合成引物和荧光标记探针,以阳性AIVM基因质粒为标准品做标准曲线,建立了荧光定量逆转录聚合酶链反应(RRT-PCR)检测方法。结果表明,本试验建立的标准曲线循环阈值(Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.999,灵敏度约为5拷贝/μL,相当于5个AIV颗粒,对新城疫病毒和其他禽病病毒无交叉反应,特异性好、重复性佳,为AIV检测提供了一种特异、敏感、快速的定量检测方法。对500份临床泄殖腔棉拭样品的检测,其结果阳性?阴性数与经典病毒分离方法符合率分别为91.2%?99.4%。在AIV临床样品筛检、流行病学监测等方面显示良好的应用前景。     

湟源地区猪瘟疫苗免疫效果监测与分析

采用猪瘟正向间接血凝试剂盒对2013年湟源地区部分规模化养猪场和农村散养户的739份血清样品进行了猪瘟抗体监测与分析。结果显示,猪瘟免疫总合格率为79.30%,其中规模化养猪场免疫合格率为81.56%,离散度为23.88%,散养户免疫合格率为76.27%,离散度为34.54%。湟源地区规模养殖场的免疫效果好于散养户。     

应用定量RT-PCR对猪瘟兔化弱毒疫苗的质量评价研究

为进一步验证猪瘟兔化弱毒(HCLV)疫苗荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)与兔体定型热试验之间存在正相关性,本研究利用qRT-PCR方法对278批次HCLV疫苗进行检测,分别检测其疫苗含量及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)污染情况。结果表明,278批次猪瘟疫苗中有66批(24%)疫苗含量达不到规程标准,有42批(15%)疫苗存在BVDV污染;从所检疫苗中抽取6份qRT-PCR检测HCLV含量较低的疫苗,采用兔体定型热试验进行验证,两种方法结果吻合,表明qRT-PCR方法可以作为评价猪瘟疫苗质量的一种备选方法。     

皮下注射猪瘟疫苗对抗体水平变化的研究

探索仔猪皮下注射与肌肉注射抗体水平变化的差异,验证猪群进行猪瘟疫苗皮下注射与肌肉注射之间存在的效果差异并分析变化规律,为免疫接种方案的调整优化提供新的思路,为各个猪场减少防疫成本提供有益参考。     

用RT-PCR技术检测盐渍猪肠衣中猪瘟病毒的研究

参考GenBank中发表的猪瘟病毒（CSFV）序列，设计一对CSFV特异性PCR引物；从CSFV感染猪盐渍小肠中提取总RNA，经逆转录后进行PCR扩增，在盐渍小肠中成功扩增出与预期大小（168bp）一致的特异性条带，而正常猪和感染猪伪狂犬病病毒的猪小肠扩增结果均为阴性。用本方法对20例不同稀释浓度的盐渍猪肠衣样本进行检测，结果显示比经典抗原检测方法（抗原捕获ELISA法）具有更高的敏感性。实验表明，本RT—PCR技术能应用于盐渍猪肠衣的CSFV检测，为快速、准确检测盐渍猪肠衣中CSFV提供了一条新途径。     

猪瘟疫苗中牛病毒性腹泻病毒2型的检测

为对上海某猪场送检的一份猪瘟疫苗进行牛病毒性腹泻病毒(BVDV)检测,本研究将猪瘟疫苗样品接种于MDBK细胞,盲传15代后仍无致细胞病变效应,但间接免疫荧光试验表明接种该疫苗后的MDBK细胞能够被单克隆抗体BZ-53(BVDV-2)识别。采用BVDV-1和BVDV-2的5’-UTR的通用检测引物和针对BVDV E2的引物,对样品RNA进行RT-PCR检测,结果显示,样品能够扩增出约288 bp的BVDV特异性片段;此外,5’-UTR和E2基因片段的测序分析结果表明分离株属于BVDV-2,并且其E2基因与牛源XJ-04株(BVDV-2)的E2基因同源性最高(92.3%),而与猪源ZM-95株(BVDV-1)的E2基因同源性较低(64.5%)。由此证明,该猪瘟疫苗中的确污染有一株BVDV-2株。     

用RT-PCR方法检测猪瘟细胞苗中污染牛病毒性腹泻病毒

参考GenBank中牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和猪瘟兔化弱毒病毒(HCLV)序列,设计和建立了一种PCR检测方法,通过试验证明,所建方法能够对HCLV和BVDV进行鉴别诊断;用此方法对23个批次的猪瘟细胞苗进行检测,发现有5批疫苗污染BVDV,均为BVDV I型,污染率为21.74%。测定序列与BVDV Oregon C24V株(AF091605)的核苷酸相似性为83.2%~83.5%,与NADL株(M31182)的核苷酸相似性为86.4%~86.7%。     

梅迪-维斯纳病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立检测梅迪-维斯纳病毒(MVV)的TaqMan实时荧光定量PCR方法,本研究根据MVV核苷酸保守序列设计引物和探针。以梯度稀释的含有MVV目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示:5.0×105～5.0×101拷贝范围内定量PCR均有S型扩增曲线,检测灵敏度为50拷贝。对羊的其他病毒核酸均无扩增反应。本研究建立的实时定量PCR方法,灵敏度高,特异性好,在MVV的快速检测中具有良好的应用前景。     

猪瘟疫苗研究进展及我国传统疫苗的研究现状

简要介绍了国内外传统猪瘟疫苗和新型猪瘟疫苗的研究进展,着重对我国猪瘟传统疫苗的特点、生产工艺、生产和应用中的问题进行了概述,并对猪瘟疫苗研究做了展望.     

猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR方法的建立

本研究根据GenBank中发表的猪瘟病毒(CSFV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的基因组序列,设计筛选出两对用于双重RT-PCR反应的特异性引物,通过对特异性、灵敏性和稳定性等试验,建立了检测猪流行性腹泻病毒和猪瘟病毒的双重RT-PCR核酸检测技术。利用建立的CSFV-PEDV双重RT-PCR核酸检测技术,对某规模化猪场病料进行检测,结果表明,扩增出大小约311 bp和501 bp大小的特异性条带,为猪瘟与猪流行性腹泻病毒混合感染。建立的CSFVPEDV双重RT-PCR核酸检测技术具有良好的特异性、灵敏性和稳定性,该方法的建立为CSFV和PEDV的快速诊断、疫情监测及流行病学研究奠定了基础。