泰山螭霖鱼原始生殖细胞的发生及性腺分化规律的研究

通过光镜、电镜及PAS法对泰山螭霖鱼原始生殖细胞的发生、迁移及性腺分化规律进行了研究。结果表明,原始生殖细胞最早出现于受精后11 h的原肠早期;6日龄,生殖嵴形成;20日龄,原始生殖细胞迁移到生殖嵴中,与生殖嵴共同组成原始性腺;60日龄,原始性腺开始分化。卵巢的分化时间早于精巢。电镜下观察到泰山螭霖鱼原始生殖细胞核膜附近有生殖质存在。原始生殖细胞的PAS反应呈阳性。     

鸡胚原始生殖细胞定向诱导分化成骨细胞的研究

探讨体外培养的鸡胚胎原始生殖细胞(EPGCs)的多向分化潜能。分别从发育至19期和28期的鸡胚胎性腺中获取EPGCs,体外培养传代。通过地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C诱导EPGCs向成骨细胞分化,分别进行碱性磷酸酶改良钙钴法染色鉴定、钙结节Von Kossa's染色鉴定和免疫组化鉴定。结果表明:EPGCs被诱导21 d后,定向分化成成骨细胞,诱导率达到80%,碱性磷酸酶改良钙钴法染色、钙结节Von Kossa's染色和免疫组化鉴定均呈阳性,阳性率为75%-85%。由此可得出在诱导条件下,EPGCs体外可定向诱导分化为成骨细胞。     

鱼类原始生殖细胞的研究进展

动物胚胎发育时期,最早出现的生殖细胞称为原始生殖细胞(PGCs)。原始生殖细胞参与生殖腺的形成,通过对原始生殖细胞的研究可揭露性别的分化机制。几十年来,国内外学者用不同方法对鱼类原始生殖细胞的特征、起源、迁移和分化等方面进行了大量的工作,取得了很多成果,笔者现就鱼的PGCs的研究进展情况作一概括性总结。     

原始生殖细胞与胚胎干细胞

原始生殖细胞用于哺乳动物胚干细胞的分离与培养,是进入９０年代以来胚胎干细胞研究领域内的重大技术成果。在小鼠、大鼠、牛和猪等动物上,人们已由ＰＧＣｓ成功地建立了类ＥＳ细胞系。囊胚注射不仅已生出嵌合小鼠,而且其中生殖系嵌合体也已繁殖出数量可观的后代。因此,来自ＰＧＣｓ的ＥＳ细胞,业已证明具有囊胚ＥＳ细胞的全部特性。在ＥＳ细胞培养中,用ＰＧＣｓ替代桑椹胚和囊胚在取材等方面是有优势的。     

青山羊胚胎期睾丸的组织分化

青山羊胚胎期睾丸的组织分化主要表现在白膜、睾丸索、睾丸间质和间质细胞。50日龄时白膜和血管膜已初步分化形成,80日龄纤维膜和血管膜分界明显。睾丸索为实心细胞索,50日龄时平行排列,以后在睾丸索区由外及内逐渐盘曲,110日龄时全部盘曲。间质细胞以80日龄数量最多,95日龄开始减少,至初生时很少且多为退化型间质细胞。     

家畜性腺分化和配子形成研究进展

哺乳动物胎儿发育早期,原始外胚层特定细胞分化为原始生殖细胞,即配子的祖细胞。原始生殖细胞随后迁移到未分化的性腺中,与体细胞共同形成卵巢或睾丸。原始生殖细胞经过有丝分裂增殖形成卵原细胞或精原细胞,随后进行减数分裂分化为配子。性别决定、性腺分化和配子发生过程涉及多种细胞的增殖分化和相互调控,但受到取样和检测技术的限制,以往的研究系统性较差。近十年,单细胞水平检测技术的快速发展为全面分析人和动物生殖能力形成的机制提供了重要机遇。本文综述了不同动物原始生殖细胞的分化、迁移与增殖、性腺分化、性别决定及雌雄配子形成过程的研究进展,并介绍了单细胞测序技术在这些过程中的应用现状和前景,为揭示动物性别和生殖能力形成的机制以及提高哺乳动物的繁殖效率提供理论参考。     

视黄酸诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的研究

体外胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）向生殖细胞分化可用于治疗不育症,同时也为揭示种系世代的分子机制提供最佳模型。试验旨在探讨视黄酸（retinoic acid,RA）诱导鸡胚胎干细胞（chicken embryonic stem cells,cESCs）向雄性生殖细胞（male germ cells,MGCs）分化的作用效果。利用胰蛋白酶消化法从新鲜种蛋X期鸡胚中分离胚胎干细胞,以鸡胚成纤维（chicken embryo fibroblast,CEF）细胞为滋养层,进行体外培养,利用形态法、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP）染色和胚胎阶段特异性表面抗原（embryo specific surface antigen 1,SSEA-1）检测对获得的胚胎干细胞进行鉴定。结果表明,获得典型的呈巢状或岛状的cESCs克隆,细胞AKP染色呈蓝紫色,表明其具有较高的内源性AKP活性;SSEA-1鉴定结果呈阳性,显示cESCs克隆具有多能性。采用10^-5 mol/L RA诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化,镜下观察细胞形态变化,分别于诱导第0、2、4、6、8、10天提取细胞总RNA,反转录成cDNA,用于实时荧光定量PCR检测生殖细胞标志基因的表达。结果表明,在此诱导过程中,作为胚胎干细胞标志基因Nanog、Sox2表达量持续显著下降,而生殖细胞特异性基因Dazl、Stra8、c-kit、integrin α6表达量呈持续上升趋势;免疫细胞化学检测可观察到特异基因相关蛋白的阳性克隆。本研究成功分离出cESCs,可体外培养并保持未分化状态及多能性。10^-5 mol/L RA能够促进cESCs向雄性生殖细胞方向分化,可以引起生殖细胞相应基因的表达,为进一步研究雄性生殖细胞的形成和调控机制提供参考。     

鸡胚原始生殖细胞诱导分化为神经元样细胞的研究

原始生殖细胞（Primordial Germ Cells：PGCs）是指能够发育为性细胞的前体细胞,可作为胚胎干细胞（ES）分离与克隆的一种新型材料,其形态、表面标志、体内外分化潜能及体外培养条件均类似于胚胎干细胞.体外培养过程中,在培养液中加入一定的诱导分化剂,PGCs细胞将发生定向分化.长期以来神经系统损伤和神经退行性病变是临床上难以解决的问题,由于原始生殖细胞具有发育全能性,可以在体外通过对其进行定向诱导,得到特定类型的细胞,这将使原始生殖细胞成为今后细胞替代疗法和组织器官移植的来源.本试验采用不同的诱导剂对PGCs进行诱导,以探讨PGCs细胞向神经细胞分化的适宜条件.     

胚胎干细胞向生殖细胞分化的研究进展

胚胎干细胞是一类全能型细胞,能在特定条件下诱导产生生殖细胞。近年来,科学家在胚胎干细胞的研究方面取得了一些突破性进展,能够突破常规,治疗生殖细胞缺乏的不孕不育症,对临床治疗和保护濒临灭绝的动物具有重要意义。笔者对胚胎干细胞体外诱导分化为生殖细胞的相关技术进行综述。     

Migration and differentiation of gonadal germ cells under cross-sex germline chimeras condition in domestic chickens

A series of experiments was conducted to investigate migration, proliferation and differentiation of gonadal germ cells (GGCs) collected from the gonads of 7-day-old chick embryos under cross-sex germline chimera conditions. The migratory and proliferative abilities of exogenous GGCs were examined by transferring 50 fluorescently labeled GGCs collected from White Leghorn (WL) embryos into the blood of 2-day-old Rhode Island Red (RIR) embryos. No significant difference was observed in the number of fluorescently labeled GGCs in the gonads of recipient embryos among any of the four possible donor and recipient sex combinations. Cross-sex germline chimeras were produced to examine the differentiation of GGCs by transferring 100 GGCs from WL embryos into 2-day-old RIR embryos. Exogenous-GGC-derived progeny were obtained from both male and female recipients, except when female GGCs were transferred into male recipients. The migratory ability of GGCs recovered from the 7-day-old embryonic gonad was not influenced by cross-sex germ cell transfer conditions, whereas the differentiation of the GGCs was affected by the sex combinations of GGCs donors and recipients.     

小鼠胚胎干细胞向骨骼肌细胞分化的研究进展

近年来,胚胎干细胞的应用越来越广泛,在体外将小鼠胚胎干细胞诱导分化为肌肉细胞,并且利用这些分化得来的肌肉细胞治疗肌肉退行性疾病,一直是胚胎干细胞研究领域的热点,而胚胎干细胞的分化机制更是其中的难点。目前,用于诱导小鼠胚胎干细胞分化为骨骼肌细胞的方法很多,但分化的效率并不是很高,所以研究胚胎干细胞向骨骼肌细胞方向分化的机制显得尤为重要。文章仅就最近几年对小鼠胚胎干细胞向骨骼肌细胞方向分化的一些方法及其机制作一综述。     

Production of Functional Gametes from Cryopreserved Primordial Germ Cells of the Japanese Quail

The Japanese quail (Coturnix japonica) is a valuable bird as both an experimental animal, for a wide range of scientific disciplines, and an agricultural animal, for the production of eggs and meat. Cryopreservation of PGCs would be a feasible strategy for the conservation of both male and female fertility cells in Japanese quail. However, the effects of freeze-thaw treatment on viability, migration ability and germline transmission ability of quail PGCs still remain unclear. In the present study, male and female PGCs were isolated from the blood of 2-day-old embryos, which were cooled by slow freezing and then cryopreserved at –196 C for 77–185 days, respectively. The average recovery rate of PGCs after freeze-thawing was 47.0%. The viability of PGCs in the frozen group was significantly lower than that of the control group (P<0.05) (85.5% vs. 95.1%). Both fresh and Frozen-thawed PGCs that were intravascularly transplanted into recipient embryos migrated toward and were incorporated into recipient gonads, although the number of PGCs settled in the gonads was 48.5% lower in the frozen group than in the unfrozen control group (P<0.05). Genetic cross analysis revealed that one female and two male recipients produced live progeny derived from the frozen-thawed PGCs. The frequency of donor-derived offspring was slightly lower than that of unfrozen controls, but the difference was not significant (4.0 vs. 14.0%). These results revealed that freeze-thaw treatment causes a decrease in viability, migration ability and germline transmission ability of PGCs in quail.     

昆明白小鼠胚胎生殖细胞的分离与培养

以昆明白品系小鼠胎儿生殖嵴为材料，以不同的培养液分离培养胚胎生殖细胞（EG cells），发现小鼠胎儿肝细胞条件培养液的效果好于未添加白血病抑制因子（LIF）的基础培养液，而差于添加了1000IU／mL LIF的基础培养液。同时，试验对比了从不同胎龄胎儿分离培养原始生殖细胞（PGCs）的情况，鉴定了EG细胞的生物学特性；EG细胞经体外培养，可以分化为神经样细胞、上皮样细胞和简单类胚体。     

影响山羊类胚胎干细胞分离克隆的因素分析

将本地槐山羊胎儿的原始生殖细胞(PGCs)与其生殖嵴周围组织细胞共同分离,经传代培养后获得了具有干细胞特征的山羊类ES细胞。结果表明高糖DMEM培养基和低糖DMEM培养基相比较,低糖DMEM更适宜于山羊类ES细胞的分离与克隆;类ES细胞在山羊胎儿成纤维细胞饲养层上生长效果较好,可传4代或5代,而在小鼠成纤维细胞饲养层上,类ES细胞仅传3代;联合添加白血病抑制因子(LIF)、干细胞因子(SCF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)能显著提高山羊类ES细胞分离与克隆的效率;胎龄为30~45d的胎儿原代培养时可获得大量的细胞集落,克隆培养可传至5代,适合作山羊类ES细胞的分离培养。     

鸡胚胎生殖嵴中原始生殖细胞的分离培养研究

在鸡胚孵化的 19期以Ficoll密度梯度离心和酶解离两种方法分离生殖嵴中的原始生殖细胞 (PGCs)。探索在生殖嵴中PGCs分离、培养的适宜方法 ,以获得较多数量 ,较高活力的PGCs作介导生产转基因鸡。在倒置显微镜下进行形态观察 ,台盼兰染色比较存活时间 ,PAS特异染色法识别鉴定PGCs。结果表明两种分离方法均能分离到一定数量的PGCs细胞。与Ficoll密度梯度离心法相比 ,酶解离法分离到的PGCs的相对数量较多 ,存活时间较长 ,是一种较可行的分离方法。在鸡胚孵化的第 19期 ,PGCs大量聚集在肢体后端的生殖嵴原基处 ,此时的生殖嵴大小已达一定程度 ,分离其中的PGCs操作简便 ,有较强的可操作性 ;提取出的PGCs为转基因鸡的生产提供了介导材料     

牛骨骼肌卫星细胞的分离培养及诱导分化方法的建立

为了给牛骨骼肌卫星细胞的分离培养及诱导分化方法及进一步揭示肌肉分化的机理及转基因肉牛的研究提供重要帮助,试验以新生胎牛的骨骼肌为试验材料,分别采用胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅺ与胰蛋白酶结合对其进行消化,并通过差速贴壁法对骨骼肌卫星细胞进行分离纯化,同时采用免疫荧光染色、RT-PCR、Western-blot法对骨骼肌卫星细胞进行鉴定。结果表明:研究成功获得了大量的牛骨骼肌卫星细胞;该细胞的标志性分子的mRNA及其蛋白表达的纯度在98%以上;细胞生长状态良好,可稳定传至90代并保持旺盛的增殖活力;细胞分化效率高,2%的马血清能够诱导细胞分化使其融合形成多核肌管,数量众多的肌管可自发融合为更粗的肌管,并可观察到其具有收缩现象。     

寿光鸡胚原始生殖细胞的形态和分布观察

采用连续切片法进行鸡胚胎显微观察,研究寿光鸡原始生殖细胞（PGCs）形态和分布规律。试验结果表明,PGCs在迁移过程中出现3次聚集高峰。第1次是在孵化19～22 h时聚集在生殖新月处;第2次是在孵化48～55 h时聚集在心脏和背主动脉中;第3次是孵化4~5 d时的生殖嵴中。生殖新月区的PGCs呈不规整的圆形或卵圆形,细胞内含有大量的糖原颗粒,血液中PGCs呈规整的圆形。性腺中PGCs呈圆形或卵圆形,有伪足。胞核均呈圆形或椭圆形,偏向细胞边缘。细胞直径为10~22.5 μm,细胞核的大小均为7.5 μm左右。