牛整合素β7亚基片段的表达及多抗制备

为制备牛整合素β7亚基片段的多克隆抗体,根据GenBank中牛整合素β7基因序列,合成了β7亚基 288 bp(140-427 bp）的cDNA片段,通过DNA重组法构建表达质粒,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达。表达产物经Western blotting鉴定,结果证实成功表达了分子质量约为15 ku的β7蛋白。超声破碎细菌后,Ni-NTA树脂进行纯化,免疫兔子获得多抗。间接ELISA检测多抗效价为1∶32000,为进一步研究牛整合素α4β7的功能奠定基础。     

鸡恒定链分子跨膜区2个氨基酸残基在形成MHCⅡ-Ii复合物中的作用

本研究旨在探明鸡恒定链跨膜区特定氨基酸在形成MHCⅡ-Ii复合物聚合中的作用特征.用大引物PCR定点突变法将鸡Ii链跨膜区2个氨基酸Gln47和Thr50分别突变为丙氨酸(Ala),再连接到pEGFP-C1载体中,构建含Ii-GFP融合基因的真核表达载体.同时还分别构建了含pDsRed2-N1-MHCⅡα、pDsRed2-N1-MHCⅡβ、pEG-FP-N1-MHCⅡa和pEGFP-N1-MHCⅡβ真核表达载体.用脂质体介导法将这些重组质粒单独或共转染至COS-7细胞,培养48 h后经荧光显微镜检测野生型Ii和突变型Ii与MHCⅡ类分子的细胞定位,并通过免疫共沉淀研究它们之间的相互关系.结果显示,野生型Ii链与MHCⅡα或MHCⅡβ之间存在细胞内的共定位,而突变型Ii与MHCⅡα或MHCⅡβ在细胞中共表达后未出现共定位现象.免疫共沉淀结果显示,在野生型Ii链与MHCⅡa或(和)MHCⅡβ单转染或三者共转染COS-7细胞后,均能检测到MHCⅡa-li、MHCⅡβ-Ii和MHCⅡ-Ii复合物,而突变型Ii链与MHCⅡα或(和)MHCⅡβ单转染或三者共转染COS-7细胞后,均检测不到MHCⅡα-Ii、MHCⅡβ-Ii和MHCⅡ-Ii复合物.因此Ii链跨膜区Gln47和Thr50 2个氨基酸对于MHCⅡ-Ii复合体的形成是至关重要的.     

牛肌肉生成抑制素基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

将构建的牛pMD 18-T-MSTN克隆载体与真核表达载体pef-dhfr1a酶切,回收牛MSTN目的片段及pef-dhfr1a载体,构建了牛MSTN基因的真核表达质粒pef-dhfr1a-MSTN,然后转染COS-7细胞,将牛MSTN成熟蛋白编码序列在COS-7细胞中进行了表达.提取转染细胞的总RNA,采用RT-PCR和Western-blotting方法,分别从mRNA水平和蛋白质水平上检测到了牛MSTN基因在COS-7细胞中的表达产物,证明已经成功构建出该基因的真核表达载体.     

牛IgG2Fc受体在COS-7细胞表面的稳定表达

将牛IgG2 Fc受（boFcy2R）编码区cDNA亚克隆到真核表达载体pcDNA3的巨细胞病毒启动子下游，构建了重组表达质粒pc3b02R；以重组质粒转染COS-7细胞，用玫瑰花环试验检测boFcy2R在转染细胞表面的表达，通过G418抗性筛选和连续克隆化，在转染细胞表面稳定表达了boFcy2R受体分子，转染细胞的玫瑰花环形成率达90％。最后获得稳定表达boFcy2R受体分子的COS-7转染细胞系，为受体的功能研究提供了良好的技术平台。     

梅花鹿干扰素-β1在MDBK细胞中表达及抗牛病毒性腹泻病毒活性检测

为真核表达梅花鹿干扰素β1(IFN-β1)并检测其抗牛病毒性腹泻病毒(BVDV)活性,本研究以梅花鹿肝脏基因组为模板,通过PCR扩增出IFN-β1的编码区序列,克隆于真核表达载体pVAX1中,构建重组真核表达质粒pVAX1-IFNβ1,并转染MDBK细胞进行表达。结果显示,将pVAX1-IFNβ1转染MDBK细胞后经western blot和间接免疫荧光法检测和鉴定证实,转染的重组质粒能够在MDBK细胞中正确表达目的蛋白,表达的重组蛋白约为25 ku。此外,采用细胞病变抑制法检测表明转染后重组细胞表达的IFN-β1具有抗BVDV活性。本研究为梅花鹿IFN-β1蛋白抗病毒分子机制的研究及抗病毒药物的开发奠定了基础。     

NLRP3炎症复合体的体外构建

为体外构建NLRP3炎症复合体,利用PCR方法扩增目的基因NLRP3、IL-1β、ASC和Pro-Caspase-1,分别连接到相应的载体中,构建重组真核表达质粒p3XFLAG-NLRP3、pEGFP-C1-ASC、pEGFP-C1-IL-1β、PCI-CASP-HA,利用Lipofectamine2000试剂转染到HEK293T细胞后,采用Western blot方法验证各蛋白的表达情况;通过质粒共转染体外构建NLRP3炎症复合体,采用ELISA方法检测IL-1β生成情况。结果显示,3XFLAG-NLRP3、pEGFP-C1-ASC、pEGFP-C1-IL-1β、PCI-CASP-HA重组质粒均被成功构建,各蛋白于HEK293T细胞内均被成功表达;质粒共转染后ELISA检测到高水平的IL-1β生成,表明NLRP3炎症复合体体外构建成功。NLRP3炎症复合体在体外的成功构建,为进一步研究其激活机制奠定了基础。     

利用酵母双杂交系统筛选与人RIPK1互作的牛分枝杆菌蛋白

为探索牛分枝杆菌通过RIPK1来调节细胞凋亡的作用机制,本试验利用分子克隆技术构建诱饵质粒pGBKT7-RIPK1,并通过PEG/LiAc转化法将该质粒转入酵母菌中,经Western blot验证RIPK1在酵母菌中的表达情况后,使用该重组酵母菌筛选牛分枝杆菌基因组文库;筛选所得阳性克隆经互补验证、测序分析以及免疫共沉淀法,最终确定可与RIPK1互相作用的牛分枝杆菌蛋白。结果表明,成功构建诱饵质粒pGBKT7-RIPK1,该诱饵质粒可在酵母菌中表达RIPK1蛋白;用该酵母菌筛选牛分枝杆菌基因组文库共获得16个阳性克隆;这些阳性克隆经互补验证、测序和BLAST对比后共发现翻译正确的7个牛分枝杆菌蛋白;分别构建RIPK1和牛分枝杆菌候选蛋白的真核表达载体,经免疫共沉淀验证后发现可与RIPK1互作的3个牛分枝杆菌蛋白,分别为Mb0869c、Mb0383c和Mb2314,本研究为进一步研究牛分枝杆菌通过RIPK1调节细胞凋亡的作用机制提供数据支持。     

牛FSHβ基因真核表达质粒的构建及表达分析

为开发可以体外合成牛促卵泡素(FSH)的表达系统,试验通过基因合成的手段获得牛FSHβ基因的目的片段,并通过酶切及T4 DNA连接酶的作用将FSHβ目的片段构建成pcDNA3.1-EGFP-FSHβ重组质粒,并针对构建的pcDNA3.1-EGFP-FSHβ重组质粒,采用菌液PCR、双酶切的方法对该重组质粒进行鉴定,并进一步利用293T细胞检测该重组质粒的表达情况。结果表明:菌液PCR和双酶切的结果证实了牛FSHβ基因片段插入了重组质粒中;pcDNA3.1-EGFP-FSHβ重组质粒可以在293T细胞中表达出绿色荧光蛋白,而且经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测发现pcDNA3.1-EGFP-FSHβ重组质粒可以在293T细胞中转录并翻译出牛FSHβ基因的蛋白表达产物。说明pcDNA3.1-EGFP-FSHβ重组表达质粒构建成功,并且可以在293T细胞中表达。     

利用酵母双杂交系统筛选TRADD的互作牛分枝杆菌蛋白

为研究牛分枝杆菌抑制肿瘤坏死因子介导的细胞凋亡来逃避宿主免疫反应的机制,本试验采用酵母双杂交系统在牛分枝杆菌中筛选可与肿瘤坏死因子受体1相关死亡域蛋白（TRADD）相互作用的蛋白。通过限制性内切酶Sau3AⅠ部分消化牛分枝杆菌基因组,回收片段随机插入pGADT7载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建牛分枝杆菌基因组文库。PCR扩增人tradd基因,将扩增产物克隆于pGBKT7载体上,构建重组诱饵质粒pGBKT7-tradd,转化酵母菌Y2HGold。用诱饵质粒pGBKT7-tradd对牛分枝杆菌基因组文库进行筛选,以获得与TRADD互作的阳性候选克隆;提取阳性候选克隆中的质粒,经测序和同源性比对分析,获得与TRADD互作的牛分枝杆菌蛋白的生物学信息。结果显示,构建的文库滴度为2×10⁶ CFU,平均插入片段在1.5 kb左右,文库重组率>95%。经Western blotting验证,诱饵质粒pGBKT7-tradd可在酵母菌中表达诱饵蛋白TRADD,且TRADD的表达对酵母菌无毒性,不会在酵母菌中自激活。应用酵母双杂交系统初步筛选出20个与TRADD互作的阳性克隆,经复筛、测序和BLAST对比,最终发现7个基因序列。本研究应用酵母双杂交技术成功筛选到7个与TRADD互作的牛分枝杆菌蛋白,为进一步研究牛分枝杆菌对细胞凋亡的抑制机制提供线索。     

利用酵母双杂交系统筛选TRADD的互作牛分枝杆菌蛋白

为研究牛分枝杆菌抑制肿瘤坏死因子介导的细胞凋亡来逃避宿主免疫反应的机制,本试验采用酵母双杂交系统在牛分枝杆菌中筛选可与肿瘤坏死因子受体1相关死亡域蛋白(TRADD)相互作用的蛋白。通过限制性内切酶Sau3AⅠ部分消化牛分枝杆菌基因组,回收片段随机插入pGADT7载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建牛分枝杆菌基因组文库。PCR扩增人tradd基因,将扩增产物克隆于pGBKT7载体上,构建重组诱饵质粒pGBKT7-tradd,转化酵母菌Y2HGold。用诱饵质粒pGBKT7-tradd对牛分枝杆菌基因组文库进行筛选,以获得与TRADD互作的阳性候选克隆;提取阳性候选克隆中的质粒,经测序和同源性比对分析,获得与TRADD互作的牛分枝杆菌蛋白的生物学信息。结果显示,构建的文库滴度为2×10~6 CFU,平均插入片段在1.5kb左右,文库重组率95%。经Western blotting验证,诱饵质粒pGBKT7-tradd可在酵母菌中表达诱饵蛋白TRADD,且TRADD的表达对酵母菌无毒性,不会在酵母菌中自激活。应用酵母双杂交系统初步筛选出20个与TRADD互作的阳性克隆,经复筛、测序和BLAST对比,最终发现7个基因序列。本研究应用酵母双杂交技术成功筛选到7个与TRADD互作的牛分枝杆菌蛋白,为进一步研究牛分枝杆菌对细胞凋亡的抑制机制提供线索。     

鸡降钙素真核表达质粒pCEP4-CT的构建及细胞表达

构建重组鸡降钙素真核表达载体pCEP4-CT,转染非洲绿猴肾细胞(COS-1)并检测其表达。通过酶切方法自含鸡降钙素(CT)基因的克隆质粒pGEM-T-CT中扩增CT基因,并将其克隆到真核表达载体pCEP4中。阳性克隆鉴定后,在PEI介导下转染非洲绿猴转化肾细胞(COS-1),通过间接免疫荧光试验(IFA)检测CT在COS-1中的表达状况。结果表明,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确;在COS-1细胞中检测到了CT的表达,为进一步探讨该基因在动物机体中调控钙代谢奠定了基础。     

利用BiFC技术研究柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原1结构域Ⅰ与棒状体颈部蛋白2互作关系

为了验证柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)顶膜抗原1结构域Ⅰ(apical membrance antigen 1 domain I,E tAMA1-DⅠ)与棒状体颈部蛋白2(rhoptry neck protein 2,EtRON2)的互作关系,以柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA为模板,PCR扩增出492 bp的E tAMA1-DⅠ片段和1395 bp的E tRON2片段,并与pGEM-T-easy载体连接构建相应重组质粒。获得的阳性重组质粒及双分子荧光互补技术的真核表达载体pBiFC-VN155和pBiFC-VC155用E c oRⅠ和B g I II进行双酶切,将E tAMA1-DⅠ、E tRON2分别与pBiFC-VN155、pBiFC-VC155连接,构建真核重组质粒pBiFC-VN155-E tAMA1-DⅠ和pBiFC-VC155-E tRON2。将2个真核重组质粒分别转染BHK细胞进行表达,经间接免疫荧光鉴定,可在BHK细胞中成功表达。将2个真核重组质粒共转染至BHK细胞中,同时将pBiFC-bJunVN155和pBiFC-bFos(deltaZIP)VC155、pBiFC-bJunVN155和pBiFC-bFos(delta)VC155共转染至细胞中分别作为阳性和阴性对照组。BiFC结果发现真核重组质粒共转染组和阳性对照组的BHK细胞均产生绿色荧光,而阴性对照组无荧光,表明E tAMA1-DⅠ与E tRON2蛋白之间存在互作关系。本研究结果为深入研究E tAMA1及E tRON2在球虫入侵过程中的功能与作用机制奠定基础。     

绵羊干扰素调节因子-1基因在COS-7细胞中转染表达的研究

本研究旨在构建真核表达载体pIR ES2-EGFP-IR F1,并在COS-7细胞中过量表达。根据绵羊IRF1基因cDNA序列设计、合成引物,构建真核表达载体pIR ES2-EGFP-IR F1质粒,用电穿孔法,以表达质粒转染COS-7细胞,并用LPS刺激,用定量PCR方法检测IRF1基因的表达量是否升高。结果表明:重组质粒pIR ES2-EGFP-IR F1转染细胞后,可以观察到绿色荧光蛋白的表达,并且可以过量表达,与空白对照组相比差异极显著(P<0.01),说明通过转染的确会对细胞造成影响,排除转染试剂及未融合GFP的作用后,效果仍然明显。利用LPS刺激后,随着作用时间延长至24 h,IRF1基因的表达量较未用LPS作用的对照组有更高倍数的提高。     

马Viperin的抗EIAV功能初步研究及其重组腺病毒的构建

Viperin是一种细胞内抗病毒蛋白,可以被I型干扰素、多聚I:C、脂多糖及多种病毒诱导表达,在细胞内主要定位在内质网和脂滴,具有广谱的抗病毒功能。为研究马Viperin(eViperin)在抗病毒感染中的作用,本研究应用RT-PCR从马巨噬细胞中扩增eViperin基因,并将其克隆于真核表达载体pDC315中构建重组质粒pDC-eViperin-Flag,将重组质粒转染293T细胞,western blot检测结果表明eViperin在293T细胞中正确表达。将该重组表达质粒与表达马传染性贫血病毒(EIAV)Gag前体蛋白(Gag precursor,Pr55gag)的表达质粒共转染293T细胞,转染48 h后western blot检测,结果显示实验组细胞培养上清中的Pr55gag含量显著低于空白对照组,表明eViperin具有抑制EIAV释放的作用。此外,将该重组表达质粒与腺病毒骨架质粒pBHGlox△E1,E3Cre共转染HEK293细胞,进一步构建拯救出表达eViperin的重组腺病毒,为研究eViperin的抗病毒功能研究奠定了基础。     

牛β-干扰素在新城疫病毒La Sota疫苗株中的高效稳定表达及抗病毒活性检测

研究利用新城疫病毒La Sota株作为表达载体,构建表达牛β-干扰素基因的重组新城疫病毒全基因组质粒pFL-BoIFN-β, 与辅助质粒共转染BHK-21细胞后获得表达BoIFN-β的重组新城疫病毒.收获的鸡胚尿囊液内的重组病毒经RT-PCR检验证实重组病毒含有相应外源基因.将重组病毒尿囊液经紫外线照射以灭活新城疫病毒,利用表达绿色荧光蛋白的重组水泡性口炎病毒在牛肾细胞上测定rL-BoIFNβ抗病毒活性, 表达BoIFN-β的重组新城疫病毒能有效抑制重组水泡性口炎病毒在牛肾细胞上的复制, rL-BoIFNβ接种SPF鸡胚所收尿囊液抗病毒活性高达2×107 IU/mL.结果表明:重组新城疫病毒rL-BoIFNβ接种的SPF鸡胚尿囊液具有高效而稳定的抗病毒活性,重组新城疫病毒可以作为外源蛋白的高效表达载体而广泛应用.     

奶牛LAP基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时表达

根据GenBank上发表的牛舌抗菌肽(Lingual antimicrobial peptide,LAP)基因cDNA序列设计1对特异引物,从患乳腺炎的奶牛乳腺组织中以RT-PCR方法扩增LAP基因片段,将其克隆到pMD19-T Simple载体中测序。重组质粒经EcoRⅠ+BamHⅠ双酶切回收目的基因片段,亚克隆入增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1中构建重组融合表达质粒pEGFP-LAP,将其脂质体转染COS-7细胞,经荧光显微镜观察到融合表达的绿色荧光蛋白,采用RT-PCR检测到LAP基因在COS-7细胞中转录。pEGFP-LAP重组表达质粒的成功构建为进一步研究奶牛LAP基因的表达特性及利用基因工程技术防治奶牛乳腺炎奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒E^rns基因的真核表达及抗原性检测

为研究牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E^rns基因的生物学功能，将含有牛病毒性腹泻病毒E^rns基因的质粒pMD18-T—EE^rns经BamHⅠ／HindⅢ双酶切，获得了E^rns片段，再与杆状病毒转移栽体pBlueBaeHis2A连接，构建成重组质粒。将重组质粒pBlueBaeHis2A-E^rns与Bac-N—Blue^TMDNA共转染至sf9昆虫细胞中，获得了重组病毒，经噬斑筛选纯化，感染sf9昆虫细胞进行表达。SDS-PAGE分析结果表明，表达的目的蛋白大小约30ku；Western-blotting检测表明，该蛋白具有良好的抗原性。     

牛源犬新孢子虫NcGRA7基因的克隆及原核表达分析

为了解牛源犬新孢子虫NcGRA7基因的生物学特性,本实验采用PCR技术扩增牛源犬新孢子虫NcGRA7基因,并连接至pMD-18T载体中,构建重组质粒pMD 18-NcGRA7,经PCR、酶切鉴定及测序分析,将NcGRA7基因连接到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-NcGRA7,转化大肠杆菌BL21,筛选阳性克隆,将PCR和酶切鉴定正确的重组质粒进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE和westem blot分析表达产物.结果表明,扩增的NcGRA7基因片段大小为701 bp,编码233个氨基酸,与GenBank中登录的NcGRA7(AF176649)核苷酸序列同源性为98.7％;western blot分析表达蛋白的分子量为52 ku,具有较好的反应原性.本实验为犬新孢子虫NcGRA7基因疫苗研究奠定了基础.     

鸡传染性支气管炎病毒多表位核酸疫苗的构建和表达

通过文献报道和计算机软件分析筛选出鸡传染性支气管炎病毒(IBV)结构蛋白基因S1、S2、N基因的T、B细胞的优势抗原表位共7段,采用人工合成及PCR方法将各抗原表位以柔性氨基酸(GP/GA)作为接头串联成一条全新的多表位嵌合基因F,并定向克隆入真核表达质粒pVAX1,采用酶切分析与序列测定方法筛选鉴定阳性重组质粒.阳性质粒pVAX-F通过脂质体转染COS-7细胞进行表达研究.提取转染细胞总RNA,RT-PCR方法检测到目的基因的转录;间接免疫荧光试验(IFA)检测到特异性荧光存在.表明表达产物能与相应抗体特异性结合,证明了具有一定的生物学活性和抗原性,有望成为抗IBV的核酸疫苗.     

含CpG序列PRRSV ORF5基因真核表达质粒在小鼠的细胞免疫应答

为了提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因免疫的效果,构建含CpG基序和PRRSV ORF5的真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5.经酶切鉴定和序列测定,将重组质粒转染COS-7细胞,经间接免疫荧光试验证实CpG-pVAX1-ORF5可表达PRRSV GP5蛋白.免疫SPF小鼠,检测鼠的脾T淋巴细胞亚群数量(CD4+和CD8+)以及淋巴细胞增殖反应(MTT法)水平.结果表明本试验构建的含CpG基序真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5能诱导小鼠产生针对PRRSV的细胞免疫.