绵羊妊娠期生殖组织Flt-1基因的克隆及其组织表达量的检测

试验从雌性绵羊妊娠期不同阶段的输卵管、子宫内膜、卵泡组织中提取总RNA,根据已发表的绵羊Flt-1基因的cDNA序列设计引物,以β-Actin基因为内参,采用RT-PCR扩增绵羊Flt-1基因,将扩增产物克隆于载体后进行序列分析,并应用Kodak Science 1 D、Bandscan图像分析软件,推断出不同组织中Flt-1基因的表达量。结果表明,从雌性绵羊妊娠期不同阶段生殖道各组织上皮均获得82 bp的Flt-1基因的扩增片段,且Flt-1基因在雌性绵羊生殖道各组织内的表达量不同。说明Flt-1基因对绵羊的妊娠维持起着重要的作用。     

绵羊生殖道中ghrelin基因的克隆及其表达

从雌性绵羊输卵管、子宫体、子宫颈、阴道组织中提取总RNA，根据已获得的绵羊ghrelin基因cDNA序列设计特异性引物，采用RT—PCR方法扩增出了绵羊ghrelin基因；将扩增产物克隆于pMD19-T载体后进行测序。以β-肌动蛋白（β-actin）基因作为内参，采用半定量RT—PCR法扩增ghrelin基因，经琼脂糖凝胶电泳后，应用凝胶成像分析系统计算雌性绵羊不同生殖道组织中ghrelin基因的表达量。结果显示，从雌性绵羊生殖道各组织均扩增出了233bp的ghrelin基因片段；ghrelin基因在子宫体的表达量最高，输卵管内次之，子宫颈和阴道内最低。表明，ghrelin对雌性绵羊生殖系统的调节及生殖激素的分泌等具有重要作用。     

蒙古绵羊雌性生殖道β-防御素(sBD-1)的序列分析及组织表达

从蒙古绵羊输卵管、子宫、子宫颈、阴道组织中提取总RNA,根据GenBank中羊的β-防御素的cDNA序列设计合成引物,通过RT-PCR进行cDNA扩增,获得了301bp的片段。将该片段克隆于pMD-18T载体后进行序列分析,确认该PCR产物为β-防御素。通过相同的RT-PCR反应体系和条件后,对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,以β-actin为参照,根据PCR产物的亮度推断不同组织中β-防御素的表达量。结果,蒙古绵羊雌性生殖道上皮各组织均有β-防御素表达,说明β-防御素在蒙古绵羊雌性生殖道的先天免疫中起重要作用。β-防御素的表达量在雌性生殖道各组织内不同,提示雌性生殖道各组织的防御功能强度不同。     

雌性骆驼生殖组织β-防御素-1基因的克隆及其组织表达量的检测

从雌性骆驼输卵管、子宫、子宫颈、阴道组织中提取总RNA，根据已发表的骆驼β-防御素-1基因的cDNA序列设计合成引物，采用RT—PCR扩增出了骆驼β-防御素-1基因；将扩增产物克隆于pBlueselect T载体后进行了序列分析。以伊肌动蛋白（pactin）基因作为内参，对扩增的β-防御素-1基因进行琼脂糖凝胶电泳后，应用凝胶成像分析系统，推断出了不同组织中β-防御素-1基因的表达量。结果，从雌性骆驼生殖各组织上皮均获得了203bp的β-防御素-1基因的扩增片段，且β-防御素-1基因在雌性骆驼生殖道各组织内的表达量不同。结果表明，β-防御素-1在雌性骆驼生殖组织的先天免疫中起重要作用。     

妊娠期绵羊子宫内膜Fit-1基因表达的RT—PCR检测

以β-actin基因作为内源性内标，采用RT—PCR方法检测了Flt-1基因mRNA在东北细毛羊、小尾寒羊妊娠期不同阶段子宫内膜中的表达量。结果显示，绵羊妊娠期在不同阶段的子宫内膜中Flt-1mRNA均强烈表达，且随着妊娠期的延长，Flt—1mRNA的表达量有逐渐增强的趋势（P〈0．05）；在相同的妊娠阶段小尾寒羊子宫内膜中的Flt-1mRNA表达量显著地高于东北细毛羊的Flt-1mRNA表达量（P〈0．05）。     

蒙古绵羊β-防御素基因相对表达水平实时定量PCR方法的建立

为了利用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术对蒙古绵羊雌性生殖道β-防御素基因表达水平进行相对定量测定,建立蒙古绵羊β-防御素基因相对表达水平的实时荧光定量PCR方法,试验根据GenBank中羊β-防御素基因序列设计合成引物,进行实时荧光定量PCR,同时以β-Actin为内参基因对β-防御素基因进行均一化处理,利用荧光阈值(Ct值)计算β-防御素基因的相对表达量.结果表明:扩增产物为β-防御素;利用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术可以测定蒙古绵羊β-防御素基因表达水平相对含量.     

威宁绵羊GH基因cDNA克隆及组织表达研究

为了保护威宁绵羊品种,为威宁绵羊生长激素(GH)基因原核表达、组织表达谱构建提供基础资料,试验对6月龄、1周岁和2周岁的威宁绵羊公母羊GH基因编码区序列进行克隆,并进行生物信息学分析;同时采用实时荧光定量PCR方法对GH基因在威宁绵羊不同性别及不同生长阶段心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及背最长肌6个组织中mRNA水平上的表达规律进行探究。结果表明:威宁绵羊GH基因CDS区序列长度为754 bp,发现2个SNP位点;GH基因在威宁绵羊不同组织中均有不同程度的表达,但不同性别和不同生长阶段的表达有一定的差异,随着威宁绵羊年龄的增大,其GH基因在部分组织器官中的相对表达量呈现小幅度下降的趋势。     

版纳微型猪近交系VEGF基因克隆及其组织中转录水平的检测

为克隆版纳微型猪近交系血管内皮生长因子(VEGF)基因并检测该基因在各组织中的转录水平,本研究提取版纳微型猪近交系18种组织RNA,利用RT-PCR方法扩增VEGF基因编码区全长序列,进行克隆测序。利用VEGF基因序列的推导氨基酸序列与牛等8个物种的VEGF氨基酸序列构建物种系统进化树,同时采用半定量RT-PCR方法分析VEGF基因在版纳微型猪近交系18种组织中的转录水平。结果显示,版纳微型猪近交系VEGF基因编码区全长573 bp,编码190个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,与牛等8个物种具有90%以上的相似性,分子系统进化表明其序列与人的关系最近,其次为牛、羊和兔。多组织半定量RT-PCR研究表明VEGF mRNA在版纳微型猪近交系的18个组织中均有转录水平的表达,其中在卵巢、脾脏、心脏、肺脏及皮肤中表达量较高,其他组织中表达量略低。     

藏系绵羊VEGF基因的克隆、同源性分析及其表达水平的实时荧光定量PCR检测

采用PCR技术从藏系绵羊皮肤组织细胞中扩增出了血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因,长度为573 bp,共编码190个氨基酸;序列比对发现,VEGF基因在所选择的多个物种之间具有高度同源性,相似性在100%～74.5%之间,其中藏系绵羊与普通绵羊的VEGF基因序列完全相同,其次为牛和猪,相似性分别为99.1%和96.2%,而与鸡的同源性最低,相似性为74.5%。采用实时荧光定量PCR SYBR Green I荧光染料法,对藏系绵羊皮肤组织细胞中VEGF基因的表达水平进行了相对定量分析,建立了快速检测VEGF基因表达量的方法。检测结果表明:给妊娠后期藏系母羊补饲自制的营养舔砖和颗粒饲料后,所产羔羊体内VEGF基因的表达水平分别为对照组的11.5倍和0.85倍。为提高羔羊皮肤组织中VEGF基因mRNA的表达水平,对妊娠后期藏系母羊补饲自制的营养舔砖,效果优于补饲颗粒饲料。     

绵羊TPT1基因CDS区遗传结构及组织表达研究

本研究旨在克隆绵羊TPT1基因序列,通过生物信息学分析探究其序列特征及编码蛋白的结构与功能,通过实时荧光定量PCR检测TPT1基因在绵羊不同组织中的空间表达规律。以小尾寒羊为研究对象,PCR扩增获得TPT1的完整编码区(CDS)区并进行测序,对所得序列进行生物信息学分析。结果显示:绵羊TPT1基因CDS为660 bp,编码219个氨基酸,核酸序列与山羊的同源性最高。TPT1蛋白为亲水性蛋白,主要分布在线粒体,存在16个磷酸化位点;二级结构主要包含α-螺旋和无规则卷曲,与预测的三级结构相似。定量PCR结果显示TPT1基因在肾中表达量最高,其次是肌肉、肝、脂肪和肺,在心和脾中表达量最低。结果表明,TPT1基因在生物进化中是保守的,但其表达的蛋白质结构不稳定,在绵羊不同组织中均有表达。     

威宁绵羊SOCS7和GFAP基因组织表达研究

试验旨在检测细胞因子信号传导抑制蛋白7（suppressor of cytokine signaling 7，SOCS7）和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）基因在威宁绵羊不同组织中的表达水平。以6月龄、1周岁和2周岁的威宁绵羊公、母羊为研究对象，采用实时荧光定量PCR测定威宁绵羊不同性别及不同生长阶段心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及脑6个组织中SOCS7和GFAP基因的相对表达量，从mRNA水平上的探究两个基因之间的表达规律。结果显示，SOCS7基因在威宁绵羊不同组织中均有不同程度的表达，其中脾脏中相对表达量最高，其次是肺脏、肾脏、心脏、肝脏和脑组织，随着威宁绵羊年龄的增大，SOCS7基因在组织中的相对表达量呈现小幅度上升的趋势；GFAP基因在威宁绵羊脑组织中相对表达量最高，其余组织中表达量较低，随着年龄增长总体呈现下降趋势。从性别差异来看，威宁绵羊SOCS7基因相对表达量母羊普遍高于公羊，而GFAP基因则是公羊普遍高于母羊，推测SOCS7基因很有可能负向调控GFAP基因的表达。     

威宁绵羊SOCS7和GFAP基因组织表达研究

试验旨在检测细胞因子信号传导抑制蛋白7(suppressor of cytokine signaling 7,SOCS7)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)基因在威宁绵羊不同组织中的表达水平。以6月龄、1周岁和2周岁的威宁绵羊公、母羊为研究对象,采用实时荧光定量PCR测定威宁绵羊不同性别及不同生长阶段心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及脑6个组织中SOCS7和GFAP基因的相对表达量,从mRNA水平上的探究两个基因之间的表达规律。结果显示,SOCS7基因在威宁绵羊不同组织中均有不同程度的表达,其中脾脏中相对表达量最高,其次是肺脏、肾脏、心脏、肝脏和脑组织,随着威宁绵羊年龄的增大,SOCS7基因在组织中的相对表达量呈现小幅度上升的趋势;GFAP基因在威宁绵羊脑组织中相对表达量最高,其余组织中表达量较低,随着年龄增长总体呈现下降趋势。从性别差异来看,威宁绵羊SOCS7基因相对表达量母羊普遍高于公羊,而GFAP基因则是公羊普遍高于母羊,推测SOCS7基因很有可能负向调控GFAP基因的表达。     

绵羊Otx-2基因的分子克隆、组织表达及其与季节性繁殖关系的研究

旨在研究绵羊Otx-2基因与绵羊繁殖的关系,从阿勒泰绵羊下丘脑组织中克隆Otx-2及MT1、KISS-1、GnRH基因CDs(Coding region)区部分序列,采用RT-PCR分析了这些基因在心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、胃、大脑、小脑、子宫、垂体、松果体、下丘脑和甲状腺组织中的表达差异;进一步用实时荧光定量PCR方法分析繁殖期和繁殖间期绵羊下丘脑中这些基因在日间和夜间表达的变化规律。结果表明,Otx-2和KISS-1、MT1基因在各组织中均有不同程度的表达,其中Otx-2和KISS-1在下丘脑中的表达量较高。Otx-2基因与KISS-1和GnRH基因在繁殖期的表达量均高于繁殖间期的表达量,且均表现出夜间的表达量极显著高于日间表达量的相似表达规律,综上表明,Otx-2基因可能参与绵羊的季节性繁殖调控。     

藏系绵羊KRT26基因的克隆测序和组织表达分析

为了克隆藏系绵羊KRT26基因序列,并研究其组织表达谱,试验从藏系绵羊皮肤中提取总RNA,用RT-PCR技术克隆KRT26基因,并进行了氨基酸序列测定和荧光定量PCR分析。结果表明:获得了1 407 bp的编码区序列,该序列与绵羊KRT26基因的预测序列仅有1个碱基差异,推导的氨基酸序列相同,与牛、人、小鼠KRT26的氨基酸序列相似性依次为94.44%、79.44%和73.32%。KRT26基因在藏系绵羊的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脂肪、皮肤中均有不同程度表达,但在皮肤的表达量远远高于其他组织,表现出极高的组织特异性。     

藏鸡胚胎HIF-2α和VEGF基因表达的组织特异性与相关性研究

研究旨在检测低氧诱导因子2α基因(Hypoxia inducible factor-2α,HIF-2α)和血管内皮生长因子基因(Vascular endothelial growth factor,VEGF)在14胚龄藏鸡不同组织中的差异表达情况及两基因在不同组织中表达的相关性。低氧条件下孵化藏鸡种蛋至14胚龄时,取鸡胚肝脏、胸肌、腿肌、卵黄膜、尿囊膜、下丘脑6个组织;使用试剂盒从上述组织中提取总RNA,反转录后对各组织中HIF-2α基因、VEGF基因及内标β-actin基因进行实时荧光定量PCR检测;利用统计软件分析HIF-2α和VEGF基因在不同组织中的表达是否有差异及两基因相对表达量之间是否具有相关性。结果显示,HIF-2α基因在尿囊膜中表达最高,肝脏次之,其余四个组织中HIF-2α基因表达量较低且彼此间无显著差异。肝脏中出现VEGF基因特异性高表达,其余组织中VEGF基因表达量由高到低依次为腿肌、胸肌、尿囊膜、卵黄膜、下丘脑。尿囊膜组织中HIF-2α基因与VEGF基因表达量呈负相关,其他组织中两基因表达均不相关。研究发现尿囊膜和肝脏中HIF-2α基因高表达以及VEGF基因在肝脏中的高表达可能是藏鸡早期发育过程中应答低氧环境的重要机制之一。HIF-2α基因与VEGF基因在尿囊膜组织中表达呈负相关是藏鸡适应低氧环境的表现。     

不同营养水平限制饲养对妊娠期蒙古绵羊生长激素受体(GHR)mRNA表达水平的影响

为了阐明不同营养水平限制饲养妊娠期母羊后,在不同生长阶段对蒙古绵羊生长激素受体(GHR)mRNA表达水平的影响,研究根据GenBank中绵羊的GHR序列,设计1对预计扩增产物为395 bp的引物,采用RT-PCR技术检测了蒙古绵羊在不同营养水平条件下肝脏和背最长肌中GHR mRNA表达量的变化。结果表明:在限制采食阶段,低营养水平组即营养限制组(RG1组)和阈值组(RG2组)肝脏的GHR mRNA表达水平低于正常营养的对照组(CG组),而背最长肌的GHR mRNA表达水平高于对照组,说明限制营养对绵羊GHR水平的影响具有组织特异性。在补偿生长结束阶段,RG1组和RG2组绵羊的肝脏和背最长肌中GHR mRNA表达水平均恢复到对照组水平。     

绵羊松果体及生殖轴系褪黑素受体MT1的克隆

采用RT-PCR技术从绵羊松果体、下丘脑、垂体及卵巢组织中克隆到褪黑素受体MT1基因,扩增序列全长650 bp.同源性分析表明与GenBank中已知序列的同源性均达到99%,证明这些组织存在MT1基因的mRNA表达.序列分析发现绵羊下丘脑、垂体和卵巢组织中的基因序列为Mella α基因,而松果体组织中的基因序列为Mella β基因.绵羊卵巢组织中存在有MT1褪黑素受体,暗示褪黑素可能直接作用于绵羊卵巢,参与生殖功能的调节.     

蒙古绵羊Ghrelin基因的克隆和原核表达

为了克隆蒙古绵羊Ghrelin基因,构建其原核表达载体,并检测其在大肠杆菌中的表达情况.本研究用RT-PCR方法从蒙古绵羊胃组织mRNA扩增获得Ghrelin基因的cDNA序列,克隆到pMD-19T载体后进行序列分析.将测序正确的cDNA序列与原核表达载体pET-32a(+)连接,并转化BL21( DE3)大肠杆菌.经...     

绵羊VEGF-C基因可变剪切体克隆与序列分析

为克隆不同品种绵羊血管内皮生长因子C(VEGF-C)基因,探寻该基因与绵羊毛囊发育及毛用性状形成的内在关系,本实验利用RT-PCR方法从小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤组织克隆出VEGF-C基因mRNA并进行生物信息学分析。以皮肤组织cDNA为模板,RT-PCR扩增显示存在多个扩增条带,克隆测序结果发现所有条带均为VEGF-C基因序列。除最长片段为全长VEGF-C基因外,其他均为VEGF-C异构体,片段长度依次为1 318、1 298、1 197、890、732、604 bp。所有异构体均表现为序列中间部位的缺失,分析显示各异构体由不同类型的可变剪切方式组合加工产生。氨基酸分析发现大部分异构体造成移码突变,编码类VEGF-C蛋白小肽,推测可能参与VEGF-C蛋白成熟或功能调节。本研究首次证明VEGF-C基因在绵羊皮肤组织存在复杂的转录后加工过程,为进一步研究VEGF家族在绵羊皮肤组织中的功能奠定基础。     

绵羊CREBRF基因克隆、生物信息学及组织表达分析

【目的】 对绵羊Luman/CREB3募集因子(CREBRF)基因进行克隆和生物信息学分析,并检测其在绵羊不同组织中的表达量,为探究CREBRF基因在绵羊中的生物学功能提供理论参考。【方法】 以绵羊卵巢cDNA为模板,通过PCR扩增和克隆绵羊CREBRF基因完整CDS区序列,并进行相似性比对、系统进化树构建及生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR方法检测CREBRF基因在绵羊不同组织中的表达水平。【结果】 绵羊CREBRF基因CDS区序列全长1 920 bp,编码639个氨基酸。相似性比对结果表明,绵羊CREBRF氨基酸序列与山羊、牛、人、小鼠、猪、犬、马、鸡、鸭和斑马鱼的相似性分别为99.8%、99.1%、95.4%、93.6%、98.3%、97.5%、98.4%、88.0%、87.5%和61.3%。系统进化树分析结果显示,绵羊与山羊、牛的亲缘关系最近,与斑马鱼亲缘关系最远。生物信息学分析发现,绵羊CREBRF蛋白分子式为C₃₁₂₆ H₄₉₁₄ N₈₅₈ O₁₀₅₆ S₂₁,分子质量为72.08 ku,等电点(pI)为4.77,半衰期为30 h,肽链N-端为蛋氨酸(Met),不稳定系数为54.83;CREBRF蛋白存在于细胞核内,不具备跨膜性,无信号肽,为亲水性不稳定蛋白。CREBRF蛋白二级结构主要以无规则卷曲(47.57%)为主,其次为α-螺旋(37.09%)。实时荧光定量PCR结果显示,CREBRF基因在绵羊不同组织中均有表达,其中在心脏、肾脏和卵巢中表达量显著高于其他组织(P<0.05)。【结论】 本试验获得了绵羊CREBRF基因CDS区全长序列,并初步研究了其组织表达规律,为研究绵羊胚胎发育的调控机制及提高繁殖力等提供了材料。