药桑提取物对猪链球菌溶血素活性的影响

猪链球菌的致病力与其合成或分泌的各种毒力因子密切相关,其中猪链球菌溶血素(SLY)发挥着重要的作用,如脑膜炎等感染。因此筛选SLY抑制剂对于猪链球菌感染具有一定的意义。试验通过溶血试验和生长曲线测定等研究发现,较低浓度药桑提取物对猪链球菌生长几乎无影响,但可显著抑制猪链球菌溶血素介导的溶血活性。在猪链球菌与宿主细胞共培养体系内加入药桑提取物可明显抑制细菌穿透上皮细胞屏障及其介导的细胞毒性作用。结果表明:药桑提取物通过抑制SLY活性可体外降低猪链球菌毒力,是一种潜在的抗猪链球菌感染的先导复合物。     

6种中药生物碱对内毒素诱导内皮细胞分泌白介素-1α、NO和6-酮-前列腺素F1α的影响

通过研究青藤碱、防己诺林碱、水苏碱、川芎嗪、苦参碱和吴茱萸碱6种中药生物碱对细菌内毒素(LPS)作用下猪血管内皮细胞分泌细胞因子白介素-1α(IL-1α)、NO和6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)的影响,探讨生物碱抗LPS的药理作用机制.培养猪血管内皮细胞至单层融合状态,加入LPS刺激,3 h后加入高、中、低3种质量浓度的上述6种中药生物碱,继续培养21 h后收集细胞上清液,用ELISA测定IL-1α、NO和6-keto-PGF1α的含量.结果显示青藤碱、苦参碱和吴茱萸碱能显著降低内皮细胞分泌IL-1α的水平;青藤碱、水苏碱和川芎嗪能显著降低内皮细胞分泌NO的水平;防己诺林碱能显著降低内皮细胞分泌6-keto-PGF1α的水平.结果提示6种中药生物碱具有明显的抗细菌内毒素作用,可在由IL-1α、NO和6-keto-PGF1α介导的机体炎症、水肿和凝血等病理损伤过程中发挥治疗作用.     

口蹄疫146S对乳鼠心肌膜微血管内皮细胞分泌IL-6的影响

研究口蹄疫146S病毒粒子抗原（FMDV146S）对乳鼠心肌膜微血管内皮细胞（RMMVECs）分泌IL-6的影响,为解决现有口蹄疫疫苗的不足提供数据。体外培养乳鼠心肌膜微血管内皮细胞,用ELISA方法检测FMDV146S处理后细胞上清液中IL-6浓度。乳鼠心肌膜微血管内皮细胞（RMMVECs）在正常状态下低水平分泌IL-6;FMDV146S刺激后IL-6的分泌量显著增加,且呈剂量和时间依赖性,在刺激24h后分泌量达到峰值。MVECs在FMDV146S诱导的免疫与炎症反应中起着重要作用。     

丙酸钠对IPEC-J2细胞紧密连接及炎症细胞因子的影响

[目的]本文以猪肠道上皮IPEC-J2细胞为模型,探究不同水平丙酸钠对细胞紧密连接和炎症细胞因子的影响。[方法]分别用1和10 mmol·L~(-1)丙酸钠处理IPEC-J2细胞,以不加丙酸钠处理IPEC-J2细胞为对照组,分别处理12 h和24 h后测定各组细胞活力、跨膜电阻(TEER)值、紧密连接相关蛋白及炎症细胞因子基因表达和细胞上清液中炎症因子浓度。[结果]丙酸钠处理24 h后,处理组细胞活力显著下降(P0.05),细胞的TEER值则显著上升(P0.05)。RT-qPCR结果显示,紧密连接相关蛋白Claudin中,不同浓度丙酸钠处理12和24 h后,显著下调Claudin-1 mRNA的表达(P0.05),但显著上调Claudin-2、Claudin-3和Claudin-4 mRNA的表达(P0.05)。紧密连接相关蛋白ZO中,处理12和24 h时,1和10 mmol·L~(-1)丙酸钠分别显著上调ZO-2 mRNA和ZO-1 mRNA的表达(P0.05),但10 mmol·L~(-1)丙酸钠则显著下调ZO-2 mRNA的表达(P0.05)。不同浓度丙酸钠处理12和24 h均显著上调炎症细胞因子IL-8、IL-18和TNF-αmRNA的表达(P0.05),显著下调IL-6 mRNA的表达(P0.05)。ELISA测定结果表明,丙酸钠显著刺激IL-8和TNF-α的分泌(P0.05),对IL-18和IL-6的分泌则无显著影响(P0.05)。[结论]丙酸钠选择性上调紧密连接蛋白家族相关基因的表达,一定程度上维护小肠上皮细胞屏障功能的完整性,同时调节细胞炎症反应,揭示丙酸在调节小肠上皮细胞屏障功能以及炎症反应过程中发挥重要作用。     

毛蕊花糖苷抑制2型猪链球菌的溶血素蛋白活性而降低其小鼠致病性

为了探究天然化合物毛蕊花糖苷(verbascoside, VBS)对2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2, SS2)致病性的作用,本研究通过测定最低抑菌浓度、绘制细菌生长曲线及红细胞溶血试验,发现低浓度下的毛蕊花糖苷不影响猪链球菌的正常生长,但对其溶血活性有显著抑制作用;免疫印迹试验表明,毛蕊花糖苷不影响2型猪链球菌分泌溶血素蛋白(suilysin, SLY);通过分子对接预测毛蕊花糖苷可与SLY的2个氨基酸残基(SER-388、GLN-441)形成3条氢键结合从而使毛蕊花糖苷嵌入SLY蛋白的第4结构域,同时体外溶血活性试验进一步证实毛蕊花糖苷可直接抑制SLY介导的溶血活性;最后,小鼠体内试验结果表明,毛蕊花糖苷可明显提高2型猪链球菌感染小鼠的存活率。综上,毛蕊花糖苷在不影响2型猪链球菌生长活性的情况下,可通过抑制溶血素活性来降低2型猪链球菌对小鼠的致病性。     

紫锥菊多糖对LPS损伤后IEC-6分泌IL-6mRNA的影响

[目的]探讨紫锥菊多糖(EPS)在内毒素(LPS)损伤后IEC-6分泌IL-6mRNA的影响.[方法]采用Trizon试剂提取总RNA,经RT-PCR扩增后,进行琼脂糖凝胶电泳及图像分析.[结果]当LPS刺激IEC-6细胞时,IL-6mRNA分泌增加.而EPS可以抑制这种作用,并且具有剂量依赖性,50 μg/ml EPS可以部分抑制LPS刺激IEC-6产生的IL-6水平,而100、500μg/mlEPS随着浓度的增加,其抑制IL-6的水平逐渐增加;将IEC-6用50、100、200、500 μg/ml EPS预处理24h,然后用LPS(10 μg/ml)刺激1、4h,采用RT-PCR方法分析得,LPS诱导IL-6mRNA表达被EPS抑制且具有时间依赖性.[结论]证实了LPS作用于小肠上皮细胞后,其分泌的细胞因子IL-6mRNA产生增多,而EPS可以抑制LPS刺激细胞分泌的IL-6mRNA的产生从而起到肠道粘膜的保护作用,并且这种抑制作用具有浓度及时间依赖性.     

紫锥菊多糖对LPS损伤后IEC-6分泌IL-6mRNA的影响（英文）

[目的]探讨紫锥菊多糖(EPS)在内毒素(LPS)损伤后IEC-6分泌IL-6m RNA的影响。[方法]采用Trizon试剂提取总RNA,经RT-PCR扩增后,进行琼脂糖凝胶电泳及图像分析。[结果]当LPS刺激IEC-6细胞时,IL-6m RNA分泌增加。而EPS可以抑制这种作用,并且具有剂量依赖性,50μg/ml EPS可以部分抑制LPS刺激IEC-6产生的IL-6水平,而100、500μg/ml EPS随着浓度的增加,其抑制IL-6的水平逐渐增加;将IEC-6用50、100、200、500μg/ml EPS预处理24 h,然后用LPS(10μg/ml)刺激1、4h,采用RT-PCR方法分析得,LPS诱导IL-6m RNA表达被EPS抑制且具有时间依赖性。[结论]证实了LPS作用于小肠上皮细胞后,其分泌的细胞因子IL-6m RNA产生增多,而EPS可以抑制LPS刺激细胞分泌的IL-6m RNA的产生从而起到肠道粘膜的保护作用,并且这种抑制作用具有浓度及时间依赖性。     

金丝桃苷对SLT-Ⅱ e诱导大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌PGI2、TXA2及PAF的影响

通过检测金丝桃苷对SLT-Ⅱe诱导的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌前列环素(PGI2)、血栓素(TXA2)及血小板活化因子(PAF)的影响,探索中药复方有效成分金丝桃苷对仔猪水肿病的疗效机制。将培养的肠黏膜微血管内皮细胞分为阴性对照组、阳性对照组、不同质量浓度金丝桃苷处理组等6个组,采用ELISA法测定了培养3,6,9和12 h时细胞上清液中PGI2、TXA2及PAF质量浓度的变化。结果表明,不同质量浓度金丝桃苷处理组对SLT-Ⅱe诱导肠黏膜微血管内皮细胞过量分泌PG12、PAF无明显的抑制作用;1和5μg／mL质量浓度金丝桃苷处理组对SLT-Ⅱe诱导肠黏膜微血管内皮细胞TXA2的分泌具有明显的下调作用。南此可见,金丝桃苷通过抑制SLT-Ⅱe诱导肠黏膜微血管内皮细胞TXA2的过量分泌,阻止血小板聚集,避免微血栓形成,以达到治疗疾病的目的;金丝桃苷保护大鼠肠黏膜微血管内皮细胞损伤的模型剂量为1和5μg／mL。     

IL-8基因沉默后猪血管内皮细胞相关细胞因子表达的变化

为了探究内皮源IL-8对猪血管内皮细胞其他相关细胞因子表达的影响,解析IL-8在内皮细胞中作用,利用siRNA干扰技术对猪血管内皮细胞（VEC）中IL-8基因进行沉默,于干扰后不同时间收集细胞及上清,应用荧光定量PCR技术和ELISA检测VEC中各细胞因子的变化.结果显示,在mRNA水平上,促炎因子IL-6和促内皮生长因子（VEGF）在12h上调显著,且在4 h VEGF显著上调;ICAM-1和VCAM-1在4h显著上调,其中ICAM-1在48 h极显著下调,72 h又显著上调;巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）几个时间段均极显著高于对照组.蛋白水平上,VEGF除48 h外均显著高于对照组,M-CSF在4h后均显著低于对照组.以上数据表明,内皮源IL-8变化可能影响VEC增殖、迁移以及对造血干细胞分化.     

佛波酯对人外周血CD4+T细胞产生IL-17的影响

观察不同浓度佛波酯(Phorbol myristate acetate,PMA)及不同刺激时间对慢性乙型肝炎患者外周血CD4+T细胞产生IL-17的影响.实验运用流式细胞仪检测不同浓度的PMA及不同刺激时间作用于人CD4+T细胞后其产生IL-17的差异.不同的PMA浓度对CD4+T细胞产生IL-17的能力不同,其中PMA 50 ng/mL组可产生较多的IL-17,而25 ng/mL组和100 ng/mL组产生量较少.不同的刺激时间对IL-17产生量也有显著影响:刺激3 h后IL-17的产生量增加不明显,而刺激至6 h及12 h时,IL-17的产生明显上升,且6 h与12 h无明显差异.运用流式细胞仪检测发现,CD4+T细胞IL-17的产生量与PMA既非浓度依赖又非时闭依赖关系,建议50 ng/mL PMA刺激6 h为淋巴细胞最佳活化方案.     

mTOR抑制剂对胞内李斯特菌繁殖的影响

为了检测mTOR抑制剂雷帕霉素(rapamycin)对单核细胞增生李斯特菌(Lm)在小鼠脑微血管内皮细胞内存活的影响,将不同浓度抑制剂雷帕霉素与细胞共同孵育,然后将Lm分别感染细胞,细菌菌落计数法计算胞内细菌数量,MTT法检测抑制剂雷帕霉素对细胞活性的影响,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抑制剂雷帕霉素对Lm介导的IFN-γ和IL-6分泌的影响,利用试剂盒检测caspase-1活性。结果表明:抑制剂雷帕霉素在5、10、25 nmol/L浓度时不影响细胞活性,雷帕霉素显著抑制了Lm在细胞,且与雷帕霉素浓度和感染时间相关,雷帕霉素显著提高了Lm介导的IFN-γ、IL-6、caspase-1、IL-1β和NLRP3的mRNA水平。结论:本研究表明,mTOR抑制剂雷帕霉素可调控细胞内Lm的存活,雷帕霉素可增强Lm介导的细胞炎性体水平,为Lm引起脑膜炎的致病机制提供科学依据。     

脂多糖对猪肺泡巨噬细胞分泌IL-1β及TNF-α的影响

研究了脂多糖的浓度、刺激时间对猪肺泡巨噬细胞分泌IL-1β、TNF-α的影响。分别用不同浓度的脂多糖和不同的刺激时间处理猪肺泡巨噬细胞,收集细胞,提取RNA,用实时荧光定量PCR方法检测IL-1β、TNF-αmRNA表达水平;同时收集培养上清,用ELISA检测试剂盒检测IL-1β、TNF-α蛋白表达水平。结果表明,脂多糖浓度(1~1000ng/mL)对IL-1β、TNF-α影响显著(P<0.05);刺激时间(1~24h)对IL-1β、TNF-α影响显著(P<0.05),且蛋白的表达水平迟于mRNA的表达水平。脂多糖诱导猪肺泡巨噬细胞分泌IL-1β、TNF-α具有剂量、时间依赖性。     

β-胡萝卜素对小鼠骨髓源树突状细胞成熟的影响

为探讨β-胡萝卜素对小鼠骨髓源树突状细胞(BMDCs)活化和成熟的影响,从小鼠骨髓中分离获得前体细胞, GM-CSF和IL-4诱导使其分化成未成熟的BMDCs,并用不同浓度的β-胡萝卜素进行作用,检测BMDCs的表型标志、吞噬能力以及细胞因子的分泌水平。β-胡萝卜素作用后BMDCs进一步与异种CD4~+T细胞混合培养,检测T细胞的增殖情况。结果表明:与未处理组相比,经β-胡萝卜素作用24 h后, BMDCs表面分子CD40、MHCII、CD80和CD86的表达量显著上调, BMDCs吞噬FITC-Dextran的能力显著下降,细胞因子IL-12p70和IL-10的分泌水平显著上升, BMDCs刺激CD4~+T细胞的增殖能力显著增强。这说明β-胡萝卜素可促进DCs的活化和成熟,可作为潜在的疫苗佐剂。     

预防性给予生物活性肽对巨噬细胞抵御LPS刺激的调节作用

预防性给予巨噬细胞(RAW264.7细胞)不同浓度的生物活性肽Gln-Glu-Pro-Val(QEPV)后,用脂多糖(LPS)刺激细胞,通过检测细胞因子表达和炎性蛋白基因转录,观察生物活性肽QEPV对细胞抵御LPS刺激的调节作用。结果表明,0.1g/L的QEPV有显著的促进细胞增殖作用,0.5g/L浓度以下的QEPV对RAW264.7细胞无增殖抑制作用。0.5g/L QEPV预处理RAW264.7细胞后,用LPS刺激细胞,其IL-6、IL-12等促炎细胞因子的分泌降低,抗炎细胞因子IL-10分泌提前,分泌量增加,COX-2、iNOS基因的转录水平降低,说明乳源性生物活性肽QEPV对RAW264.7细胞抵御LPS刺激起正向调节作用。     

胸腺素α1对离体培养的鸡脾脏淋巴细胞分泌功能及基因表达的影响

采用MTT比色法、RIA法和相对半定量RT-PCR法分别研究了不同浓度的人工合成胸腺素α1(Tα1)对离体培养的鸡脾脏淋巴细胞增殖转化、白细胞介素2(IL-2)和白细胞介素6(IL-6)分泌及基因表达的影响. 结果表明,采用1和10 μg·mL-1的Tα1处理细胞36 h,能显著增加由ConA诱导24 h的脾脏淋巴细胞的增殖转化率,显著提高细胞培养上清液中IL-2的含量(P<0.05),而对IL-6的分泌无显著影响(P>0.05);同时发现,在10 μg·mL-1 Tα1处理淋巴细胞36 h后用ConA诱导12 h,对淋巴细胞IL-2和IL-6基因的表达无显著影响(P>0.05). 提示Tα1可通过促进IL-2的分泌,进而促进脾脏淋巴细胞增殖转化,而且其可能主要在基因转录后翻译水平上对IL-2分泌发挥影响.     

PCV2感染猪血管内皮细胞相关免疫调节分子的表达变化

将猪圆环病毒2型(PCV2)接种猪血管内皮细胞(VEC),于接种后不同时间收集细胞及上清,利用实时荧光定量PCR和ELISA技术分析VEC相关免疫调节分子表达变化。与对照组相比,PCV2感染后血管内皮生长因子(VEGF)、IL-6与巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的mRNA水平变化趋势基本一致,VEGF和M-CSF在感染后12h显著上调,IL-6与M-CSF在48h显著下调;MCP-1和IL-8在感染后4h和48h均显著上调,且IL-8在24h时上调显著,72h下调显著。蛋白水平上,VEGF在4h显著下降,24h显著增高;IL-8在4h和24h显著上升。以上结果表明,PCV2体外感染导致VEC免疫调节功能分子表达异常,其炎性趋化、黏附能力以及对树突状细胞(DC)的分化、成熟等免疫调节功能可能受到影响。     

PCV2感染猪血管内皮细胞相关免疫调节分子的表达变化

将猪圆环病毒2型(PCV2)接种猪血管内皮细胞(VEC),于接种后不同时间收集细胞及上清,利用实时荧光定量PCR和ELISA技术分析VEC相关免疫调节分子表达变化。与对照组相比,PCV2感染后血管内皮生长因子(VEGF)、IL-6与巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的mRNA水平变化趋势基本一致,VEGF和M-CSF在感染后12h显著上调,IL-6与M-CSF在48h显著下调;MCP-1和IL-8在感染后4h和48h均显著上调,且IL-8在24h时上调显著,72h下调显著。蛋白水平上,VEGF在4h显著下降,24h显著增高;IL-8在4h和24h显著上升。以上结果表明,PCV2体外感染导致VEC免疫调节功能分子表达异常,其炎性趋化、黏附能力以及对树突状细胞(DC)的分化、成熟等免疫调节功能可能受到影响。     

猪伪狂犬病毒体外诱导RAW264.7细胞炎症反应模型的建立

【目的】探讨猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）感染对小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）炎症反应的影响,确定PRV的最佳感染剂量和感染时间,为建立RAW264.7细胞体外病毒感染炎症反应模型打下基础。【方法】PRV按10倍递增稀释成10-5~10-1 PRV稀释液,感染RAW264.7细胞并孵育1.5 h,弃病毒液后加入含5%胎牛血清的DMEM维持培养液继续培养,分别于继续培养2、4、8、12、24和48 h时收集细胞上清液,采用ELISA测定IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α、MCP-1和IFN-γ分泌水平及环氧合酶（COX-1和COX-2）活性,并以CCK-8法测定细胞活性。【结果】以PRV感染RAW264.7细胞4~48 h后均能通过PCR扩增获得PRV核酸的特异性条带,故选择4~48 h作为后续研究的PRV感染时间范围;10-2 PRV~10-1 PRV感染可显著降低RAW264.7细胞活性（P<0.05,下同）,10-3 PRV组仅在培养48 h时出现下降趋势,而10-5 PRV~10-4 PRV感染对RAW264.7细胞活性无显著影响。PRV感染RAW264.7细胞后,其胞内炎症因子IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-1β和MCP-1的分泌水平整体上呈升高趋势,其中10-3 PRV感染RAW264.7细胞12 h能显著或极显著（P<0.01）提高IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-1β和MCP-1的分泌水平;10-4 PRV~10-1 PRV感染组的IL-10分泌水平均呈升高趋势,而10-5 PRV感染组在感染8和24 h时IL-10分泌水平明显低于空白对照组,至感染48 h所有病毒感染组的IL-10分泌水平均降低;10-3 PRV~10-1 PRV感染8~24 h能有效提高RAW264.7细胞的COX-2活性,但对COX-1活性的影响不明显。【结论】PRV感染能诱导RAW264.7细胞发生炎症反应,其中10-3 PRV体外感染RAW264.7细胞8~12 h是建立RAW264.7细胞炎症反应模型的最佳条件。该模型可应用于PRV感染与RAW264.7细胞炎症反应相关干预药物的研究,为进一步揭示PRV感染机理及开发抗病毒感染药物提供理论依据。     

阿魏酸抗LPS诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞炎性作用

[目的]为了探明阿魏酸的抗炎机制.[方法]采用组织块培养法获得奶牛子宫内膜上皮细胞.用噻唑蓝(MTT法)检测细胞活力.采用荧光定量PCR方法,分别对对照组、模型组、药物作用高、中、低剂量组在LPS作用3h、6h炎症基因IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA变化进行检测.[结果]阿魏酸在一定浓度范围内对细胞增殖无显著影响.药物预处理细胞能够显著降低LPS诱导的IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达.[结论]阿魏酸能够显著降低LPS刺激细胞后炎症细胞因子的表达,说明阿魏酸是通过抑制炎症因子的表达发挥其抗炎作用.     

生长激素释放肽-2对猪垂体细胞分泌生长激素的影响

 【目的】采用体外试验，研究了生长激素释放肽-2（GHRP-2）在不同处理浓度、不同处理时间和不同处理次数条件下对新生仔猪垂体细胞分泌生长激素（GH）的影响。【方法】分离1～3日龄新生仔猪腺垂体细胞,贴壁培养形成单层后，分别用0、10-12、10-11、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5 mol•L-1浓度的GHRP-2处理垂体细胞2 h；用10-6mol•L-1浓度的GHRP-2处理垂体细胞5～180 min；连续用10-6mol•L-1浓度的GHRP-2处理垂体细胞6次，每次1h。【结果】10-12～10-5 mol•L-1浓度的GHRP-2都能作用于体外培养的垂体细胞，刺激垂体细胞分泌GH（P＜0.01），10-12～10-8 mol•L-1浓度之间差异不显著（P＞0.05），10-7～10-5组极显著高于10-12～10-8 mol•L-1（P＜0.01）,GHRP-2适宜浓度为10-6mol•L-1；GHRP-2能引起GH的快速分泌，在10～20 min内就可使GH的分泌达到最大；在连续处理的前3次，GHRP-2能促进GH的分泌，从第4次开始，GH的分泌出现抑制状态，并随着处理次数的增加抑制状态更强。【结论】GHRP-2能够促进垂体细胞分泌GH，但其作用效果与处理剂量、时间和次数有关。