昆虫病原线虫共生细菌研究进展

概述了昆虫病原线虫共生菌的毒素、次生代谢物及其基因工程的研究进展,并对未来的研究方向提出了见解。     

重组G蛋白基因工程菌高密度发酵研究

[目的]探索基因重组工程菌高密度发酵工艺,为得到高浓度和高产量的链球菌(Streptococcus)G蛋白(SPG)奠定基础。[方法]通过一级摇瓶、二级种子罐培养,以及将菌种转接到发酵罐并进行分批补料高密度培养,探讨了IPTG加入量等条件对发酵的影响,考察了接种量、氧气、pH、培养方式等发酵工艺。[结果]高密度发酵能得到至少80 g/L的菌体,最高达到150 g/L,每升发酵液可得到1 g的SPG。SPG高密度发酵的生产条件为:接种量10%,通气量1 vvm,溶氧控制在30%～45%,发酵过程控制pH 7.0～7.2,IPTG的诱导浓度为0.2 mmol/L,时间为4 h,发酵后SPG总蛋白能达到菌体蛋白的20%以上。[结论]利用该生产工艺可得到高浓度菌体和高产量SPG。     

硅酸盐细菌发酵条件的优化

通过正交实验对硅酸盐细菌JXSD-18菌株的发酵条件进行了优化研究,结果表明,比较理想的发酵条件为:摇床转速200 r/m in,起始pH值7.0,温度32℃,装液量30mL,在此条件下硅酸盐细菌的溶磷效果达到最好。     

不同昆虫病原线虫共生细菌对草莓灰霉病菌的抑制作用

为了探明不同昆虫病原线虫共生细菌对草莓灰霉病菌的抑制效果,本研究测定了2株伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovieniiHJ4)和(X.bovienii HF22)及2株发光杆菌(Photorhabdus luminescens F30-4)和(Pho-torhabdus sp.S21)对灰霉(Botrytis cinerea)的抑菌活性。结果表明:4个菌株的培养液对灰霉病菌均有一定的抑制作用,稀释5倍的培养液对菌丝生长抑制率达70%~85%,稀释10倍的培养液抑菌效果仍达50%以上。其中HF22菌株效果最好,其稀释5倍的培养液抑菌效果可达84.92%;另外,滤液对灰霉病菌的孢子萌发也有一定的抑制作用,其中HJ4菌株效果最好,稀释5倍时达34.98%。HF22菌株的细胞10倍稀释液、滤液10倍稀释液的抑菌率分别为74.19%和18.92%,可见其抑菌物质主要存在于细胞中。用不同温度对HF22菌株的细胞、滤液进行处理,结果表明温度对其滤液抑菌活性无影响,而其细胞能耐50℃处理10 min,但在70℃处理10 min时,其抑菌活性显著下降;HF22菌株的滤液经20 W紫外灯照射0.51、h时,对其抑菌活性无显著影响,而细胞经紫外线照射0.5 h时其抑菌活性则显著降低。     

ChIFN-α酿酒酵母工程菌的发酵条件优化

在PCR检测重组菌株的遗传稳定性基础上,通过单因素试验和多因素正交试验,对酿酒酵母工程菌的实验室摇瓶发酵条件进行优化,得到重组工程菌株的最佳发酵条件为：发酵温度30℃,培养基pH值为5,15％的接种量,以3％的半乳糖作为诱导剂诱导,棉籽糖和葡萄糖作为碳源的发酵时间分别为24h和40h.     

昆虫病原线虫Oscheius myriophila 共生细菌菌株B1 的分离与鉴定

从昆虫病原线虫(Oscheius myriophila)华农种群HN体内分离得到1株共生细菌B1。该菌株在NA培养基上形成的菌落为圆形,白色,表面光滑,不透明,隆起,边缘整齐;革兰氏阴性,短杆状,单鞭毛,有荧光。Biolog检测结果显示B1为沙雷氏菌(Serratia sp.);用引物27F/1492R进行PCR扩增,得到B1的16S rDNA扩增产物大小为1 445 bp。Blast搜寻和比对结果表明,该菌株16S rDNA序列与所选的17个嗜线虫沙雷氏菌(S.nematodiphila)的相似度达97%~100%,并以高置信度(99)与这17个嗜线虫沙雷氏菌种群及4个粘质沙雷氏菌(S.marcescens)种群聚于1个单支系中。综合形态和16S r DNA序列特征以及Biolog检测结果,将共生细菌B1鉴定为嗜线虫沙雷氏菌(Serratia nematodiphila)。     

棉花黄萎病拮抗细菌12-47发酵条件的优化

为了对棉花黄萎病生物防治的进一步研究,筛选出一株编号12-47的对大丽轮枝菌具有拮抗作用的菌株并设计了该实验对其实验室发酵条件进行了摸索。笔者采用单因素实验的方法在摇床培养的基础上对影响棉花黄萎病拮抗细菌12-47菌株产生拮抗物质的营养因素进行了考察,并在此基础上通过正交试验对各因素的浓度和组合进行了优化;通过L16(43)正交实验对培养最佳培养基条件进行了摸索。由实验数据笔者确定优化后的培养基为:碳源玉米粉3%、氮源大豆蛋白胨5%、无机盐Mn2 0.1%、K 0.05%、起始pH8.0、装液量100ml/250ml三角瓶、接种量8%、发酵时间48h。最终通过优化后的培养基进行发酵,发酵液抑菌活性比优化前提高了269%。     

昆虫病原丝状菌Nomuraea rileyi产生的杀虫毒素

昆虫病原丝状菌Nomuraea rileyi,在沙氏培养基中,于22℃、暗条件下振荡培养两周以获得菌体。用甲醇、乙酸乙酯等有机溶剂从菌体中提取Nomuraea rileyi的毒性物质。以鳞翅目昆虫斜纹蛾和菜青虫进行毒性和杀虫试验,证明该物质是具有生理活性的杀虫毒素。成分分析结果表明该毒素是一种多肽。     

基因工程菌表达效率对细菌总蛋白和包涵体中目的蛋白含量的影响

测定了猪生长激素基因工程菌不同表达效率时细菌总蛋白的含量以及包涵体中重组猪生长激素占包涵体总蛋白的比值。结果表明:随着表达效率的提高,细菌总蛋白含量缓慢增加,最后稳定在一定水平上;当表达效率增加,包涵体中重组猪生长激素占包涵体中总蛋白的百分数也增加,两者上升趋势基本一致。     

Expression and Purification of Recombinant MP-GFP Protein in Escherichia coli

Guided pesticide is an unique compound resulted from the conjugation with carrier (amino acid, protein, sugars, etc) and the active pesticide ingredient. One of the attributes of the guided pesticide is its potential to accumulate at the site of the damaged points caused by pest or at the site of entry to the target pests, such as via inhalation, cuticular penetration, and oral digestion. Movement protein (MP) is a kind of protein coded by plant virus. A genetic fusion between green fluorescent protein (GFP) and movement protein resulted in the expression of a fluorescent fusion MP-GFP protein, which was fully biologically active in mediating the cell-to-cell spread of virus. In order to obtain a suitable carrier for a pesticide,fluorescent carrier MP-GFP was constructed. It was found that the recombinant MP-GFP protein was the inclusion body.The results indicated that optimized cultural condition for expression of recombinant MP-GFP protein was incubation at 37℃ for 2 h and induction with 0.2 mmol L-1 IPTG (isopropyl-β-dthiogalactopyranoside) at 25℃ for 4 h. MP-GFP protein was purified by using Ni-NTA resin. The expressed recombinant MP-GFP protein had both the fluorescence character of report GFP gene and moving character of movement protein. It could provide a guided carrier for studying the guided pesticide. It could also provide convenience for studying the delivery and distribution of the guided pesticide ingredients in the plant.     

豌豆肌动蛋白基因在大肠杆菌中的表达

高等植物细胞内含有肌动蛋白，但含量较低，难于提取及进行进一步研究，我们用PCR的方法扩增肌动蛋白cDNA，并克隆到表达质粒pTrpHis，然后转化大肠杆菌DH5α，在IPTG诱导下，肌动蛋白表达在包涵体中，在没有IPTG诱导时，肌动蛋白表达在胞液中。     

一株香樟炭疽病拮抗菌的鉴定及其发酵条件优化

为寻获香樟炭疽病生物防治的优良菌种资源,通过形态学观察、生理生化检测和基于16S rDNA系统发育分析,对一株香樟炭疽病拮抗菌SWUJ1进行了菌种鉴定;通过单因素试验优化该菌株产生抑菌活性物质的发酵条件,并釆用抑菌圈法检测其发酵液抑菌活性;进而利用菌丝生长速率法测定该菌株的抑菌谱.菌种鉴定结果表明SWUJ1为革兰氏阳性杆状菌株、产芽孢,在LB固体培养基上菌落呈圆形、边缘整齐光滑、湿润、呈乳白色黏稠状,过氧化氢酶呈阳性且具运动性;基于16S rDNA序列的系统发育分析结果显示该菌株与登录号为NR116240的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)的亲缘关系最近,且处于系统发育树的同一分枝,故将SWUJ1菌株鉴定为甲基营养型芽孢杆菌,命名为B.methylotrophicus SWUJ1;发酵条件优化结果表明该菌株产抑菌活性物质的最佳氮源为酵母粉,碳源为乳糖,无机盐离子为MgSO_4,初始pH值为5.0,培养温度为25℃,接种量为1.0%,发酵时间为96 h,优化后拮抗细菌B.methylotrophicus SWUJ1等量发酵上清液对香樟炭疽病菌的拮抗作用显著提高,且其发酵上清液对核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)及旋孢腔菌(Cochiobolus sativus)等10余种常见植物病原菌具不同程度的抑制作用.研究结果表明,B.methylotrophicus SWUJ1菌株可作为开发香樟炭疽病生防制剂的候选菌株.     

乳品污水蛋白降解细菌及其产酶条件的筛选

从乳品污水中筛选出一株蛋白降解细菌,经鉴定为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)。其蛋白酶反应的最适温度为38℃,最适pH值为7.0。最佳产酶条件为30℃,150r·min-1,种龄18h,接种量5%,250mL三角瓶中装液量90mL,发酵周期64h。在此条件下,菌株产生的中性蛋白酶活力最高达到52U·mL-1。     

小麦胚乳14-3-3基因的克隆及其重组蛋白的原核表达

【目的】克隆小麦籽粒胚乳14-3-3基因,并进行体外表达,为进一步研究其对籽粒生长发育的调控作用奠定基础。【方法】根据已有同源基因保守序列,设计插入限制性酶切位点的特异性扩增引物,采用RT-PCR方法扩增发育的小麦胚乳14-3-3基因,克隆测序后转入表达载体,在大肠杆菌中进行表达,并进行纯化。【结果】从开花后灌浆13-15 d的小麦品种济麦22籽粒胚乳中克隆到1个14-3-3基因,序列分析表明为非ε型,含1个777 bp的开放阅读框,编码蛋白259 aa,分子量约29 kD。核苷酸序列分析表明与小麦、水稻、玉米、大麦、大豆等主要农作物和模式植物拟南芥的14-3-3基因有较高的同源性,最高达98%,编码蛋白氨基酸长度也一致（260 aa左右）;在大肠杆菌中高效表达的重组蛋白约为30 kD,分子量大小与根据核苷酸序列推导的编码蛋白一致。从基因序列的同源性、编码蛋白的氨基酸长度、表达蛋白的分子量大小分析都说明克隆到的基因为14-3-3基因,并准确插入表达载体,得到了高效正确表达。将克隆的基因插入pET29c载体,热激转化大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RP,得到了高效表达,但主要以包涵体形式（80%）存在。对重组蛋白进行了纯化,可溶性重组蛋白利用S-蛋白琼脂糖树脂得到纯化的蛋白,包涵体重组蛋白经变性溶解、复性后,也利用S-蛋白琼脂糖树脂得到了高度纯化的重组蛋白。【结论】利用RT-PCR技术从发育的小麦胚乳中克隆到1个14-3-3基因,并在大肠杆菌中得到了高效表达,重组蛋白经过纯化得到了纯度较高的活性蛋白。     

香蕉条斑病毒CP区基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达

依据锌指结构在BSVCP上的可能位置合成了2条引物,通过PCR扩增得到长约640 bp的目的片段;将目的片段与质粒pET28 b(+)连接,构建了含BSVCP区基因的融合蛋白原核表达载体pET28b-BSVCP;克隆测序以确定其阅读编码框的正确性,然后用正确的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),并诱导表达;经IPTG诱导后,出现一特异的约30 kDa融合蛋白质表达条带。     

水稻蛋白OsOlel在大肠杆菌中的诱导表达

[目的]在大肠杆菌中诱导表达水稻蛋白OsOle1。[方法]RT-PCR克隆水稻基因OsOle1,构建原核表达载体pGEX-2T-OsOle1-GST,在大肠杆菌BL21中诱导表达该蛋白,并采用GST凝胶亲和层析进行纯化。[结果]水稻蛋白OsOle1具有典型的Olee1蛋白家族的保守域,N端1～24位氨基酸为预测的信号肽序列。成功地将水稻蛋白OsOle1在大肠杆菌中进行了诱导表达,并用GST亲和层析进行了纯化。[结论]该研究为以后进一步研究水稻蛋白OsOle1的生理功能奠定了基础。     

鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白在大肠杆菌细胞周质中的表达

[目的]利用大肠杆菌可溶性地表达鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白。[方法]根据IBDV vp2全长序列(Gen Bank登入号AY704912),设计一对缺失VP2蛋白N-端80个氨基酸残基的特异性引物,克隆IBDV HQ株的vp2基因,插入质粒p ET-22b中构建大肠杆菌周质表达质粒p ET-22b-vp2,经IPTG诱导后表达重组蛋白。[结果]在SDS-PAGE中可见大小约为39 k Da重组蛋白。重组蛋白纯化后,Western Blot检测表明其具有良好的反应原性。[结论]在大肠杆菌细胞周质中可以高效地可溶性地表达鸡传染性法氏囊病毒IBDV VP2蛋白,并且该重组蛋白有较好的免疫原性,可以为后续亚单位疫苗及检测试剂盒开发提供所需的蛋白。     

重组融合蛋白最佳诱导表达条件的研究

[目的]对重组融合蛋白的最佳诱导表达条件进行研究。[方法]为提高IMPACT-CN系统的pTYB11载体重组融合蛋白的表达量,针对其表达所需适宜的诱导时机、诱导剂量、诱导时间、诱导温度、氨苄青霉素浓度、摇瓶装液量等培养条件,采用不同技术指标进行了平行发酵试验。[结果]表达产物的SDS-PAGE及Western-Blotting分析表明重组融合蛋白具有良好免疫原性。[结论]为以后的蛋白纯化诊断、用蛋白质生产诊断试剂盒及其临床应用奠定了基础。