串珠镰刀菌诱导玉米活性氧及保护酶系变化研究

以不同抗病品种(BT-1)、感病品种(N6)的玉米幼苗为材料,研究了在串珠镰刀菌诱导下玉米幼苗POD、SOD活性、O2·-产生速率以及MDA的含量变化。结果表明,接种后O2·-产生速率和MDA的含量增大,抗病品种均高于感病品种,抗病品种的O2·-产生的速率峰值出现早且高,接种36 h达到高峰,且是对照的5.8倍;抗病品种SOD酶活性变化明显,且高于感病品种;接种后POD活性增加,感病品种活性增幅高,高于抗病品种。说明抗感玉米品种接种串珠镰刀菌后,相关酶活性的变化与活性氧的产生存在着明显的差异,这种变化在一定程度上反映了抗感玉米植株在病原菌胁迫下其不同的调节机制。     

商丘地区棉花黄萎菌的分离与鉴定

从河南商丘各县区采集棉花黄萎病病株,对其进行黄萎病菌的分离和鉴定。采用连续稀释法和单孢分离法分离得到16个单菌系,并以这些单菌系作为研究对象,利用真菌通用引物ITS1和ITS4对所分离的单菌系内转录间隔区(ITS)进行PCR扩增,得到543 bp大小的片段,经过克隆测序和在GenBank中进行BLASTn分析,与安阳棉花黄萎菌的ITS序列的同源性均达到98%以上,证明了这些片段来自大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)的ITS区。同时将这些序列在NCB I的GenBank进行了登记,获得5个登记号:FJ715500、FJ715501、FJ715502、FJ715503、FJ715504。     

几丁质降解放线菌对棉花枯、黄萎菌的作用

对从土壤中分离到的58株放线菌进行了皿内拮抗试验及利用几丁质能力测定,在此基础上筛选出了F104,F1052株产几丁质酶的菌株,并测定了其对棉花枯、黄萎菌的离体和活体抑制作用。皿内观察发现,F104和F105均可寄生于棉花黄萎菌,F105还可寄生于棉花枯萎菌。平皿扩散试验结果发现,F104和F105的培养滤液无论经高温处理与否,均能使棉花黄萎菌呈现畸形菌丝,而经高温处理的F104还可使棉花枯萎菌表现为畸形菌丝。抑制靶标致病菌寄主活体定殖作用的研究结果表明,F104和F105处理均表现出不同程度的超前接种防治黄萎病的作用,超前接种F105的间隔期与棉苗中枯萎菌的检出率呈负相关。     

黄萎病菌毒素粗提液对棉花抗性酶的诱导

 【目的】对黄萎病菌毒素滤液诱导棉花体内抗病性相关酶的研究,探索棉花黄萎病菌诱导抗性的生理机制。【方法】以4种浓度[病菌滤液原液（VD）、1﹕20、1﹕40、1﹕50]的黄萎病菌毒素液,在0、12、24、48、60、72 h预处理后,观察4～6叶龄棉苗叶和根的外部表现及发病情况,测定其植株形态的4～6片真叶萎蔫指标和体内相关抗性酶的变化。【结果】（1）不同浓度的毒素液浸泡棉根48 h后,1﹕20组,真叶萎蔫,子叶倒挂;1﹕40组,真叶轻度萎蔫,子叶萎蔫;1﹕50组,仅表现为子叶失水,1～2片真叶略显失水,大多数真叶完好;而VD对照组表现为3级危害,严重萎蔫。当毒素液浓度降至1﹕50时,预处理棉苗72 h,虽子叶下垂,但真叶完好,对照全株萎蔫;再接高浓度毒素液48 h后,子叶倒挂,真叶开始失水,但对照子叶脱落,真叶严重失水且萎蔫。总之,1﹕50组对黄萎病的抵抗力均强于1﹕20与1﹕40组的预处理。（2）1﹕50预处理组不仅能降低棉株体内有害物质MDA的含量,例如预处理12 h达最低值0.536 μmol?g-1,为同时刻对照2.055 μmol?g-1的24%,显著差异;同时提高了体内抗性相关酶POD活性,例如预处理72 h活性高达11.94 μg?mg-1?min-1,而对照在24 h后即已检测不出POD活性。SOD的活性也呈现较高水平且一直维持在相对较高水平。例如经预处理再接高浓度毒素液72 h后,SOD活性高达12.8 μg?mg-1?min-1,而对照在24 h后也检测不出SOD活性。从而缓解了黄萎病菌毒素液对棉花的侵害,提高棉花的抗病性。【结论】适宜浓度（1﹕50）的黄萎病菌毒素液可以做为生物激发子成功地诱导棉花对黄萎病的系统获得抗性。     

棉花根部损伤程度对感染黄萎病菌后体内抗性酶的影响

【目的】探明棉花黄萎病对不同伤根程度棉苗体内相关抗性酶的影响。【方法】棉苗长至四叶时，将纸钵与蛭石等去掉，用水小心冲刷，得到：⑴完整根苗。⑵将根下部3～5 cm的余根用消毒的刀切掉为切根苗。⑶留主根，将大部分侧根切除为伤根苗。3种不同根系状况的棉苗浸于20 ml棉花黄萎病菌的菌液中，以无菌水稀释至不同浓度。经0～48 h，记载致萎蔫程度，并测定相关抗性酶的变化。【结果】3种伤根处理的棉苗浸黄萎病菌培养液后，其致萎度差异显著。当病菌液的浓度为1﹕10时，整根苗不出现感病，受害最轻；其次为伤根苗，2级感病；切根苗最为严重，3级感病。同时还测定了与提高抗病性有关酶的变化，以1﹕50浓度处理效果最好，过氧化物酶（POD）活性伤根苗达42.96 U mg-1•min-1，整根苗达到较高值49.2 U mg-1•min-1，切根棉苗为38.2U mg-1•min-1。有害物质丙二醛（MDA）的含量切根棉苗为39.483 mmol•g-1，伤根苗为27.12 mmol•g-1，整根苗为最低值3.845 mmol•g-1。而体内相关抗性酶如过氧化物酶（POD）活性的高低与有害物质丙二醛（MDA）含量的多少，其顺序与受害轻重的顺序一致。【结论】棉花伤根后的棉苗外部病理反应与体内相关酶的动态生化反应进行研究，获得植株外部病理反应与内部生化实验相吻合的结果。     

棉花黄萎菌拮抗细菌BDT-25抑菌蛋白的分离纯化

拮抗细菌BDT-25是从根际土壤中分离得到的1株芽孢杆菌,其菌株发酵液产生的抑菌物质对棉花黄萎菌具有较强的抑制作用。为了明确其抑菌活性组分,本研究通过硫酸铵沉淀的方法从BDT-25菌株去菌体发酵液中提取得到对棉花黄萎病菌具有抑制作用的抑菌蛋白,分别采用阴离子交换层析和凝胶过滤层析的方法对其进行了纯化,抑菌活性检测结果显示,P1具有抑菌活性,为有效抑菌活性组分。经SDS—PAGE电泳纯化为单一蛋白带,分子量约为30kDa。     

嫁接诱导茄子根际拮抗菌对黄萎菌的降解作用

本文研究了嫁接后茄子不同生育时期根际黄萎菌数量的变化,明确嫁接后茄子根际黄萎菌数量与抗病性的关系,并研究了嫁接诱导的茄子根际黄萎菌拮抗菌株X631和Z111对土壤黄萎菌数量的降解效果,进而分析了拮抗菌株对黄萎菌菌株的作用机理。结果表明,嫁接均降低了茄子不同发育时期土壤黄萎菌数量,且与病情指数变化一致;两拮抗菌株降低了茄子根际黄萎菌数量,降低效果较药剂处理略高;并发现拮抗菌菌株抑制了黄萎菌的孢子萌发和菌丝生长,对孢子萌发的抑制作用较强。试验结果表明,拮抗菌通过抑制黄萎菌孢子的萌发降低了土壤黄萎菌的数量,认为嫁接通过诱导茄子根际拮抗菌产生而降低土壤黄萎菌数量是嫁接茄子抗病增产的机理之一。     

棉花黄萎病菌的遗传变异

从棉花黄萎病病原菌的分化，变异途径，研究方法及应用分子生物学技术等４个方面，对国内外的研究状况进行了全面综述。     

棉花黄萎病菌的遗传变异

从棉花黄萎病病原菌的分化、变异途径（异核现象和异核体、准性生殖、细胞质变异）、研究方法（形态观测法、生物鉴定法、生理测定法、生化分析法）及应用分子生物学技术（ＲＦＬＰ技术,ＰＣＲ和ＲＡＰＤ技术）等４个方面,对国内外的研究状况进行了全面综述。     

黄萎病原菌胁迫对丛枝菌根化棉花幼苗根部防御性酶及超微结构的影响

[目的]探讨从枝菌真菌提高棉花黄萎病抗性的作用机理,在棉花上应用AM真菌提高棉花对黄萎病的抗性.[方法]温室盆栽条件下,研究了接种两种丛枝菌根真菌摩西球囊霉(Glomus mosseae)和幼套球囊霉(Glomus etunicatum)的棉花幼苗在黄萎病原菌(Verticillium dahliae)胁迫下,其根内防御性酶活性、抗性相关物质和根细胞超微结构的变化情况.[结果]感病品种军棉1号接种AM真菌后,(1)能够诱导根内防御性酶系苯丙氨酸解氨酶(PAL)、几丁质酶和过氧化物酶(POD)的积累,增加酶的含量,提高酶的活性,而接种AM真菌后再接种病原菌,其PAL、几丁质酶和POD活性均显著提高,明显高于其它处理,并增加了一条POD同工酶条带;(2)接种AM真菌能够增加根内酚类物质的含量,降低根内丙二醛的含量,表明接种AM真菌可减轻植株细胞的膜脂过氧化作用,缓解细胞的损伤.(3)棉花根系受到AM真菌的侵染后,根系细胞发生了一系列有利于提高对病原菌抵抗能力的结构性变化,如细胞发生变形固缩,液泡数量明显减少,木质部结构增多.而接种AM真菌后再接种病原菌,根系细胞发生更为剧烈的变化,包括细胞壁明显加宽,细胞颜色加深,栅栏组织和导管变形,导管处产生胶状物质,线粒体内折消失,细胞壁木质化,出现了细胞壁物质的沉积.[结论]提出了AM真菌提高棉花黄萎病抗性的防御机制和强化机制,并认为AM真菌的侵染对于植物起到了类似于"免疫"的作用,这种类似免疫的作用在AM真菌提高棉花黄萎病抗性的作用机制之中最为直接和重要.     

黄萎病菌毒素诱导棉花愈伤组织中POD,SOD活性和PR蛋白的变化

对不同抗、感病品种棉花愈伤组织在黄萎病菌毒素诱导下,体内过氧化物酶和ＳＯＤ活性的变化进行了测定,结果表明,感病品种中ＰＯＤ活性的升高大且早于抗病品种;感病品种ＳＯＤ活性随诱导时间延长而迅速下降,耐、抗病品种ＳＯＤ活性的降低较慢;随着病菌毒素诱导时间的增加,在电泳凝胶透射扫描系统中愈伤组织中有数种病原相关蛋白（ＰＲ蛋白）表达。     

澳大利亚棉花黄萎病菌致病性鉴定研究

 在温室人工接种鉴定了澳大利亚16个棉花种植地区30个棉花黄萎病菌株的致病性.结果表明:根据人工接种5个棉花品种的抗感反应和病情指数,30个供试菌株划分为4种致病类型.致病类型I(3个菌株)具有较强的致病能力,致病类型Ⅳ(5个菌株)的致病能力较弱.致病类型Ⅱ(12个菌株)和致病类型Ⅲ(10个菌株)的致病能力中等,为澳大利亚棉花种植地区的主要菌系类型.     

产后健康奶牛血液流变学和氧自由基变化

观察产后健康奶牛1－30d血液流变学和氧自由基主要指标动态变化。选择2－4胎龄产后健康奶牛18例，于产后1d,2d,4d,7d,10d,15d,30d采血，检测血液流变学主要指标（全血高切比粘度ηb80S^-1、全血低切比粘度ηb20S^-1、血浆比粘度ηp、血细胞压积PCV和血浆纤维蛋白原FG）和氧自由基主要指标（超氧化物歧化酶SOD和丙二醛MDA）的变化。结果发现，血液流变学和氧自由基大多数指标30d,16d与新产1－7d比较，至少在某一时间段呈现差异极显著或显著（P＜0．01或P＜0．05）。     

棉花黄萎病菌在土壤—植株微生态系中的分布

在土壤垂直分布中,棉花黄萎病菌主要分布于0~40cm耕作层中,占总菌量的90%多,而40cm以下土层中仅占总菌量的10%;在土壤水平分布中,棉花黄萎病菌随病害的加重,由聚积分布型转变为均匀分布型。在病株中,病菌分布也不均,叶脉>主茎>果枝。     

陆地棉黄萎病菌诱导抑制消减杂交cDNA文库的构建与分析

为探明棉花黄萎病抗性的相关基因,对本实验室的一个高抗黄萎病陆地棉材料进行抑制消减杂交(SSH),以黄萎病菌诱导后48 h和未诱导的植株分别作为Tester和D river,提取总RNA并分离mRNA,通过合成cDNA双链及两次PCR扩增,富集诱导后植株中差异表达的片段。对两次PCR后的产物纯化,连接并转化到大肠杆菌中完成文库构建,共获得了434个阳性克隆。对插入片段进行PCR扩增后发现大小从0.45 kb到0.70 kb不等。指纹图谱分析将所有克隆分为20类,于每一类中取1个克隆进行测序分析。BLAST分析表明大部分克隆片段与其他病原菌诱导缩减库中的EST相似。缩减片段编码的蛋白与拟南芥的P450单加氧酶、病程相关蛋白、类甜蛋白以及几丁质酶等相似。此cDNA文库的建立为进一步分析基因的差异表达及分离抗黄萎病基因奠定了基础。     

棉花黄萎病内生拮抗细菌的分离及LC-04菌株的鉴定

从棉花根、茎、叶部组织中分离到19株对棉花黄萎病菌大丽轮枝菌有枯抗作用的细菌,其中抑菌圈直径大于20mm的菌株1株.直径10～20mm之间的菌株5株,直径小于10mm的菌株13株.分离自棉花叶部组织的LC-04菌株对大丽轮枝菌V-190菌株生长的抑制作用最强.通过时LC-04菌株菌体形态、菌落特征的观察和一系列生理生化试验分析,该菌株鉴定为类芽孢杆菌属细菌.     

离体条件下盐胁迫对马铃薯试管苗叶绿素含量,脯氨酸累积和抗氧化酶活性的影响

离体条件下,研究了2个马铃薯品种在0～80 mmol NaCl胁迫下的试管苗生长、叶绿素含量、脯氨酸和丙二醛含量及氧化酶活性的反应.2品种苗高随盐浓度增加及培养时间的延长而显著降低.与品种紫花白相比,同一盐浓度下静石2号在苗鲜重、根长和根数等方面受抑制程度更强.盐胁迫培养3周后,试管苗叶片中叶绿素a,b与总量及类胡萝卜素含量在40～80 mmol高盐浓度下显著降低.两个品种试管苗中脯氨酸和丙二醛含量随盐浓度的增加而增加,而静石2号中脯氨酸和丙二醛的累积量和累积率都高于紫花白,表明在盐胁迫下静石2号膜脂过氧化程度相对较高.2品种SOD和POD活性均在低盐浓度(20 mmol)下显著增加而高盐浓度下降低.离体条件下,紫花白试管苗呈现出比静石2号高的SOD、POD活性以及较强的耐盐能力,表明其具有进一步在田间进行耐盐基因型筛选的必要性.     

棉花黄萎病菌ITS序列的获得及系统进化分析

为探明从河南安阳棉区分离的棉花黄萎病菌的系统进化关系,利用真菌内转录间隔区通用引物ITS1和ITS4对来自安阳地区的棉花黄萎病菌内转录间隔区(ITS)进行PCR扩增,得到542bp大小的片段,经过克隆、测序和在GenBank中进行BLASTN分析,证明了该片段来自大丽轮枝菌的ITS区,也进一步证明该棉花黄萎病菌是大丽轮枝菌。同时,对该序列在NCBI的GenBank进行了登记,登记号为EU835817。利用该ITS序列与GenBank中搜索到的黄萎病菌ITS序列一起构建了相应黄萎病菌的系统进化树,在进化树上所搜索到的13个大丽轮枝菌都聚类到一个进化枝上,而且中国报道的植物黄萎病菌,包括安阳地区黄萎病菌在内的3个大丽轮枝菌在进化树上处于相邻的位置,表明:这3个菌可能具有相同的起源。这些结果有助于理解棉花黄萎病安阳菌株的进化地位,该ITS序列还可以应用于棉花黄萎病安阳菌株的特异分子鉴定。