猪输卵管上皮细胞对小鼠早期胚胎体外发育的影响

研究了不同生殖时期猪输卵管上皮细胞对小鼠早期胚胎体外发育的影响,以此建立了适于早期小鼠转基因胚胎体外培养的猪输卵管上皮细胞共培养体系,并用PCR法对体外培养发育到不同阶段的小鼠转基因胚胎进行了外源基因整合检测。结果表明,在受孕初期的猪输卵管上皮细胞(无论是原代还是传代细胞)上,培养的小鼠1-细胞期胚胎的囊胚率显著高于发情间期的猪输卵管上皮细胞(P<0.01);在相同生殖时期猪输卵管原代和传代上皮细胞上,培养的小鼠1-细胞期胚胎的囊胚率差异不显著;在转基因胚胎不同发育阶段,PCR检测呈阳性的胚胎比率分别为:2-细胞期为96%,4-细胞期为63%,8-细胞期为43%,囊胚期为19%。由此可见,受孕初期的猪输卵管上皮细胞可促进与之体外共培养的小鼠早期胚胎的发育;随着早期小鼠转基因胚胎的发育,PCR检测呈阳性的转基因胚胎的比率逐渐降低。     

序贯共培养体系对小鼠体外受精胚胎发育效果的影响

采用体外分离培养的兔输卵管上皮细胞和子宫内膜细胞构建了序贯共培养体系,并与体外受精得到的受精卵进行共培养。试验结果表明,HTF液受精率显著高于T6液(P<0.05),更适用于卵母细胞的体外受精。序贯共培养体系和输卵管上皮细胞培养组2-细胞率都显著高于单独培养液组和子宫内膜细胞培养组(P<0.05),二者均可克服2-细胞阻滞。序贯共培养体系胚胎的囊胚体外发育率显著高于其他共培养组(P<0.05)。表明序贯共培养体系比单一体细胞共培养体系能更好地模拟体内环境,提高早期胚胎的体外发育率。     

鼠、兔核质杂交及早期胚胎发育的研究

以2~8细胞期鼠胚细胞为供体核,选用注射hCG后15h、17h的兔卵母细胞为受体胞质,施加1.6kv/cm、160、两次脉冲的电场条件,间隔20min,融合液为含Ca、Mg的0.3mol/L甘露醇,适于鼠、兔种间EOBC的融合激活。小鼠2-细胞、4-细胞期胚细胞与兔去核卵母细胞融合率高于8-细胞期胚细胞,分别为83%、80%及62.5%,桑囊胚发育率差异不显著。体细胞共同培养系统和Taurine能显著提高鼠、兔核质杂交胚的体外发育能力。     

新鲜山羊输卵管液对体细胞克隆和转基因胚胎体外发育的影响

用添加不同浓度发情期山羊输卵管液的培养基,对正常单细胞受精卵、注射外源基因后受精卵和细胞核移植后山羊重构卵进行体外培养,探讨其对胚胎体外发育的影响。结果表明:添加20%输卵管液后正常受精卵桑椹胚分裂率为26.1%(11/42),极显著(P<0.01)高于对照组(未添加输卵管液)(7.6%)、50%输卵管液组(4.7%)和100%输卵管液组(0);添加20%输卵管液后,体外培养显微注射转基因受精卵有20.0%(8/40)发育至16-细胞,极显著(P<0.01)高于对照组(6.7%)和50%输卵管液组(4.8%);细胞核移植重构卵在含20%输卵管液的培养基中桑椹胚分裂率为7.3%,与体内培养桑椹胚分裂率(11.1%)差异不显著。在体外培养条件下,添加20%输卵管液可明显提高正常受精卵、转基因受精卵和克隆重构卵的分裂率和发育率。     

体外培养时间和培养系统对山羊卵母细胞孤雌激活及发育的影响

探讨了体外培养时间和培养系统对山羊卵母细胞孤雌激活和体外发育的影响.结果表明:卵母细胞体外培养36、33、30和27 h活化率极显著高于18、21、24 h (P<0.01),体外培养24和21 h活化率显著高于18h(P<0.05).2-4-细胞卵裂率,27、30和33 h极显著高于18 h(P<0.01),显著高于21 h(P<0.05).大于4-细胞发育率24、27和30 h极显著高于21、33和36 h (P<0.01).大于8-cell的发育率,24、27和30 h极显著高于21h (P<0.01).24和27 h大于16-细胞的发育率极显著高于30h(P<0.01).孤雌胚在TCM199和SOF中大于4-细胞发育率显著(P<0.05)低于颗粒细胞共培养系统,极显著低于(P<0.01)输卵管上皮细胞共培养系统.孤雌胚在颗粒细胞共培养系统中大于8-细胞和大于16-细胞发育率显著低于(P<0.05)输卵管上皮细胞共培养系统.     

共培养对延边黄牛重组胚体外发育的影响

以新鲜的颗粒细胞作为供核细胞,以延边黄牛MⅡ期去核的卵母细胞作为受体进行体外培养.使用CR1aa培养液培养时卵裂率(83.7%)显著高于TCM-199液和mSOF液组(76.9%和77.4%),但在重组胚的早期发育各阶段都不存在统计学差异(p>0.05).以CR1aa和TCM-199为基础液时,输卵管上皮细胞和颗粒细胞共培养在卵裂率及重组胚的各阶段发育率都有显著提高(p<0.05).结果表明:CR1aa培养液适用于延边黄牛重组胚的体外培养,以CR1aa液 输卵管上皮细胞和TCM-199液 颗粒细胞共培养的形式效果更好(p<0.05).     

克服小鼠早期胚胎体外培养发育阻滞的研究

为探讨不同培养基及共培养对克服小鼠早期胚胎体外发育阻滞的影响,用不同成分组成的5种常用培养液对小鼠早期胚胎进行体外培养,后以KSOM作为基础培养基,KSOMFBS为对照,分别与小鼠输卵管上皮细胞(MOEC)和卵丘细胞(CC)进行共培养,观察从2细胞发育到4细胞的胚胎数和囊胚数的变化。结果发现5种培养液中从2-细胞发育到4-细胞的胚胎率为30.5%~43.5%,差异不显著。KSOM组囊胚率为40.9%,显著高于其他各组(27.9%~30.0%)。共培养后,各组中克服发育阻滞的胚胎数和囊胚数均有显著提高,其中添加胎牛血清组4细胞胚胎数和囊胚数显著高于不添加组,输卵管上皮细胞组显著高于卵丘细胞组。结果显示共培养对克服小鼠2-细胞发育阻滞作用明显,添加胎牛血清效果明显好于不添加,输卵管上皮细胞共培养效果好于卵丘细胞。     

山羊-绵羊异质克隆胚在G1/G2培养液中发育的可能性

以山羊皮肤成纤维细胞为供体细胞,绵羊去核卵母细胞为受体细胞进行种间体细胞核移植,构建山羊-绵羊重构胚,并采用G1/G2培养液对其进行体外培养,比较G1/G2培养不同阶段添加饲养层对山羊-绵羊种间体细胞核移植重构胚发育的效果.结果表明,共构建获得山羊-绵羊重构胚472枚,重构胚能够在G1/G2连续培养基中发育至囊胚阶段;仅在G1中添加饲养层与对照组不添加饲养层相比,前者能获得较好的分裂率和桑囊率,差异不明显(卵裂率为76.88% vs 67.11%,桑椹胚率为52.84% vs 39.22%,囊胚发育率为7.32% vs 5.88%),而仅在G2阶段共培养与对照组相比培养桑囊率较低,差异不显著(卵裂率为69.38% vs67.11%,桑椹胚率为37.84% vs 39.22%,囊胚发育率为3.60% vs 5.88%),即,对于绵羊-山羊重构胚的培养,在前期(G1中)添加颗粒细胞培养重构胚效果优于仅在后期共培养(卵裂率为76.88% vs 69.38%,桑椹胚率为52.84% vs 37.84%,囊胚发育率为7.32% vs 3.60%).     

绵羊-绵羊和山羊-绵羊体细胞克隆胚的构建及体外发育研究

【目的】以绵羊卵母细胞为受体,构建绵羊-绵羊和山羊-绵羊体细胞克隆胚,比较其体外发育能力,探讨绵羊卵母细胞对异种体细胞核的再程序化能力。【方法】以体外成熟的绵羊卵母细胞为核受体,分别以绵羊及山羊胎儿成纤维细胞为核供体,经卵母细胞去核、注核、重构胚电融合、激活等一系列操作,构建同种绵羊-绵羊及异种山羊-绵羊体细胞的克隆胚,比较其体外发育能力。【结果】同种间克隆胚的囊胚发育率(16.0%)高于异种间克隆胚(7.4%)。异种间克隆胚在8-细胞到16-细胞及16-细胞到桑椹胚期间的发育能力显著低于同种间克隆胚。2种克隆胚在2-细胞到8-细胞期间的发育速度基本相同,但异种间克隆胚在8-细胞到囊胚期间的发育速度明显低于同种间克隆胚,两者相差12~24 h。【结论】绵羊卵母细胞对异种体细胞核具有再程序化能力,但这种再程序化能力明显低于其对同种体细胞核的再程序化能力。     

序贯共培养体系对小鼠早期胚胎体外发育效果的影响

将体外分离培养经超排处理的新西兰大白兔输卵管上皮及子宫内膜细胞接种于4孔板培养。处理1以CZB为培养液;处理2以CZB加输卵管上皮细胞为培养体系;处理3以CZB加子宫内膜细胞为培养体系;处理4以CZB为培养液,胚胎培养的前24h在输卵管上皮细胞共培养体系中,之后则转入子宫内膜细胞共培养体系中培养(处理4为序贯共培养体系)。将2-细胞期小鼠胚胎随机分配给4个处理,统计各处理组小鼠胚胎的各期发育率及发育质量。结果表明,序贯共培养体系胚胎的囊胚体外发育率显著高于其他共培养组(P<0.05);囊胚孵化率及孵化囊胚的贴附率显著高于其他共培养组(P<0.05);囊胚细胞总数各共培养组显著高于单独培养液组(P<0.05)。可见序贯共培养体系较单一体细胞共培养体系能更好地模拟体内环境,提高早期胚胎的发育率和发育质量。     

不同培养体系对绵羊体外受精胚胎发育及细胞凋亡的影响

[目的]通过SOFaaBSA和CR1 aaBSA - FBS两种培养液对体外胚胎发育率及胚胎凋亡发生的影响,筛选适合绵羊体外受精胚胎发育的培养体系,为相关研究提供一定的理论依据和研究基础.[方法]采用激光共聚焦显微镜和细胞原位凋亡检测技术(TUNEL),分析这两种胚胎体外培养系统的绵羊体外受精胚胎发育的影响及各发育阶段的细胞凋亡状况及对胚胎发育的影响.[结果]SOFaaBSA和CR1aaBSA- FBS组的卵裂率、囊胚率和囊胚孵化率均高与其它实验组,但这两组之间差异不显著(P＞0.05).同时,在两种培养液培养的2细胞、3-8细胞期的绵羊体外受精正常形态的胚胎中均未发现凋亡信号,凋亡信号在两种培养液中都是首次出现在9- 16细胞胚胎细胞中,并且随着胚胎发育至囊胚期,凋亡细胞效随着胚龄增长越来越多.在SOFaaBSA培养液培养的桑椹胚和囊胚细胞胚胎凋亡率显著低于CR1aaBSA - FBS培养液培养的桑椹胚和囊胚(P＜0.05),同时,在CR1aaBSA- FBS培养液中桑椹胚和囊胚细胞平均具有凋亡细胞的数量显著高于SOFaaBSA培养液(P＜0.05).[结论]CR1aaBSA- FBS培养系统显著的增加了绵羊晚期体外胚胎的凋亡.CR1 aaBSA - FBS能够支持绵羊体外受精胚胎的发育,但SOFaaBSA培养液更适合绵羊体外胚胎的发育.     

共培养对小鼠胚胎内部活性氧含量影响

文章旨在研究输卵管上皮细胞共培养对小鼠胚胎内部活性氧含量影响,探索共培养克服胚胎发育阻滞机理。用小鼠输卵管上皮细胞对合子进行共培养,DCFDA测定胚胎内部H2O2含量,以外源性H2O2对输卵管上皮细胞和胚胎进行阴性对照,用Hochest 33342和PI染色检测细胞凋亡情况,以MTT法测定输卵管上皮细胞活力。结果表明,共培养能显著提高2-细胞发育率、降低胚胎内部H2O2含量(P<0.05),提高4-细胞率及降低胚胎内部H2O2含量(P>0.05)。外源性H2O2能够使合子凋亡甚至死亡,导致共培养细胞活力下降(P<0.05),未能显著地促进胚胎发育(P>0.05)。结果表明共培养能够降低胚胎细胞内部活性氧,克服胚胎发育阻滞,促进胚胎发育。     

FCS和BSA对小鼠早期胚胎体外培养的影响

本实验是在CZB和Whitten’s Medium 2种培养液中添加胎牛血清(FCS)和牛血清白蛋白(BSA),比较它们对小白鼠早期胚胎体外发育的影响。结果如下:在培养注射HCG后37～39h的小鼠胚胎时,添加FCS的CZB培养液中通过发育阻断期的胚胎和发育到囊胚的胚胎均明显高于添加BSA的CZB培养液(80.9%、64.3%和41.7%、29.6%),差异显著(P0.05);当用上述液培养注射HCG后44h的小鼠胚胎时,不管是进口培养皿还是国产培养皿,胚胎发育率的差异均不显著(P0.05);在用CZB和Whitten’s培养液分别添加FCS和BSA后,培养注射HCG后44h2-细胞小鼠胚胎时,不论添加FCS还是BSA,在CZB培养液中胚胎发育率均高于Whitten’s培养液(P0.05),但添加FCS和BSA之间的差异不显著(P0.05)。     

小鼠超数排卵与早期胚胎体外培养效果研究

为探讨冲胚方法对小鼠超数排卵效果的影响,分别采用子宫切碎法与子宫冲胚法对超排小鼠进行了冲胚。结果表明:子宫冲胚法的平均采卵数和平均获胚数极显著高于子宫切碎法(P0.01),而平均可用胚数显著高于子宫切碎法(P0.05),两种方法的平均未受精卵数则差异不显著(P0.05),说明冲胚方法对小鼠超数排卵效果的影响显著,且子宫冲胚法明显优于子宫切碎法。小鼠早期胚胎发育观察结果表明:超排处理后,在公母鼠合笼后76~79.5 h采胚,胚胎大多处于桑椹胚期,而在公母鼠合笼后88~91.5 h采胚,胚胎大多处于致密桑椹胚期与囊胚期;采用TCM199+15%胎牛血清培养液对小鼠胚胎进行体外培养是可行的。