种公猪精液中猪瘟和蓝耳病病毒混合感染的快速检测

参考GenBank公布的猪蓝耳病病毒(PRRSV)VL2332株、LV株以及猪瘟兔化弱毒(CSFV)C株的基因序列,各设计合成了一对引物,建立了在相同PCR扩增条件下能同时检测PRRSV和CSFV的RT-PCR方法。对2003~2004年期间江苏、浙江、安徽、福建、上海等省市的17个大中型猪场送检的186份种公猪精液进行了检测,结果18份呈PRRSV阳性,24份呈CSFV阳性,其中有11份为PRRSV和CSFV的混合感染,约占送检精液样品的5.91%。试验结果表明,所建立的RT-PCR方法可用于精液中这2种野毒感染的快速鉴定和分子流行病学调查。     

多重PCR同时检测猪圆环病毒2型,猪细小病毒,猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒

本试验建立一种可同时检测猪圆环病毒2型(PCV-2),猪细小病毒(PPV),猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),猪瘟病毒(CSFV)4种病毒的多重PCR方法.对于每一种特定的病毒,用4对寡核苷酸引物均能特异扩增其目的片段.以含有病毒目的片段的质粒为模板,测定了多重PCR的检测灵敏度,PRRSV和CSFV检测最低限是48 pg,而PPV和PCV-2为0.48 pg.利用建立的多重PCR方法对具有产自有繁殖障碍母猪的仔猪或具有呼吸障碍症状的76个仔猪样本进行检测.检出了4种病毒的存在,其中26个样本(34.2%)同时感染了2种以上病毒.结果表明多重PCR方法检测猪混合感染的病毒,是一种快速、灵敏、低成本、高效率的病原学诊断工具.     

猪瘟、猪圆环病毒病和猪繁殖与呼吸综合征寡核苷酸芯片诊断方法的建立与初步应用

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）和猪圆环病毒Ⅱ型（PCV-2）是引发猪繁殖障碍的主要病原,建立其基因芯片快速检测体系,对开发猪繁殖障碍快速检测试剂盒具有重要意义。根据GenBank中已发表的PRRSV、CSFV和PCV-2的病毒基因组序列,设计合成特异性引物和特异性较强的60mer的寡核苷酸探针,并将探针按所设计阵列固定于表面经氨基化修饰的玻片上,制备出寡核苷酸芯片。通过引物标记及特异性验证,建立了带标记引物的多重PCR检测体系,从而产生大量可与寡核苷酸探针特异性互补的带标记的DNA片段。将标有荧光染料的扩增产物与芯片上寡核苷酸探针杂交,扫描、分析芯片上荧光信号。结果表明,芯片上各样本对应探针位点呈现阳性荧光信号,而阴性对照和空白对照则基本不能检测到荧光信号。分别用基因芯片检测方法和PCR/RT-PCR检测60份临床病料,两者符合率高达92%,表明该检测技术能够用于临床病料的检测及快速诊断PRRSV、CSFV和PCV-2。     

表达猪瘟病毒E2蛋白重组猪繁殖与呼吸道综合征病毒的研究

为构建表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白重组猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV),本研究首先利用高致病性PRRSV弱毒疫苗HuN4-F112株的感染性分子克隆作为平台,构建了一个在nsp2区有缺失的感染性分子克隆,命名为pHuN4-F112-△480-620。以pHuN4-F112-△480-620作为载体,采用突变PCR的方法将CSFV的主要保护性抗原E2基因1 bp～9 99 bp,1 bp～600 bp,1 bp～330 bp及256 bp～330 bp基因片段分别插到nsp2中aa 480～aa 620位氨基酸缺失编码区域。结果显示,插入完整E2基因或较大E2基因片段的重组PRRSV cDNA质粒均未能拯救出病毒,只有插入较小的E2基因片段(256 bp～330 bp)的重组病毒cDNA质粒成功地拯救出了重组病毒rPRRSV-F112-E2(256-330),拯救的病毒能够在MARC-145细胞上引起明显的细胞病变,而且生长速度明显高于其亲本病毒,间接荧光检测表明该重组病毒能够表达外源基因。     

CSFV及美洲型、欧洲型PRRSV多重qRT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

根据猪瘟病毒(CSFV)以及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因组序列特点,设计3对特异性引物和3条TaqMan探针,经过反应条件的优化,建立了能同时检测并区分CSFV以及美洲型、欧洲型PRRSV的多重TaqMan荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法。该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,可以特异扩增CSFV和PRRSV,而与猪的其它常见病毒无交叉反应;对CSFV及美洲型、欧洲型PRRSV3种重组质粒标准品的检出下限均为2.68拷贝/μL;组内及组间重复试验的变异系数均小于1.5%。应用该方法对253份临床疑似样品进行检测,结果病原阳性106份,其中20份为CSFV阳性,86份为美洲型PRRSV阳性,11份为CSFV和美洲型PRRSV混合感染,未检测到欧洲型PRRSV。试验表明,研究建立的多重qRT-PCR方法可用于CSFV和PRRSV的快速鉴别检测及流行病学调查。     

双重RT-PGR方法检测猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒

为建立特异、敏感的猪流感病毒(SIV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的双重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank登录的SIV M基因保守序列和PRRSV美洲型毒株的N基因保守序列,设计合成了2对特异引物,通过对扩增条件的优化,建立检测SIV和PRRSV的双重RT-PCR方法.检测结果显示:该方法可同时扩增出SIV(345 bp)和PRRSv(520 bp)的特异性片段;而猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型及阴性鸡胚尿囊液核酸扩增结果均为阴性;对SIV和PRRSV 2种病毒混合液的最小检出量分别为102 EID50/0.1 mL和103TCID50/0.1 mL.应用双重RT-PCR和病毒分离法对12份临床疑似样品进行对比检测,结果表明:除双重RT-PCR检测到双阳性的3份混合感染病料中1份未分离到PRRSV外,其余2份均分离出病毒.证明该方法具有良好的特异性、敏感性,可以用于临床样品的早期快速检测.     

共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因和猪瘟病毒E2基因的重组腺病毒的构建及其在小鼠模型上的免疫原性分析

本研究旨在以复制缺陷型人5型腺病毒为载体,构建一株同时表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株GP5蛋白和猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的重组腺病毒疫苗。首先利用重叠PCR将GP5和E2基因通过口蹄疫病毒(FMDV)2A序列连接,形成一个完整的ORF,并将其克隆到腺病毒穿梭载体中,通过细菌内同源重组构建共表达PRRSVGP5蛋白和CSFVE2蛋白的重组腺病毒(rAdV-GP52AE2)。间接免疫荧光试验和western blot检测证实2个外源基因均获得表达。在小鼠上进行的免疫效力评价结果显示,rAdV-GP52AE2免疫组针对CSFV的中和抗体滴度可达1∶128,针对PRRSV的中和抗体滴度为1∶16;在淋巴细胞增殖试验中,免疫组与阴性对照组在增殖指数上有显著差异,表明该重组腺病毒可以同时诱导抗PRRSV和CSFV的特异性体液免疫和细胞免疫。这些结果显示,利用具有自动剪切功能的FMDV2A多肽构建的重组腺病毒有望开发成一种同时预防PRRS和CSF的新型载体疫苗。     

食源性动物组织中CSFV和PRRSV双重双色荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立同时检检测食源性动物组织中猪瘟病毒(CSFV)和猪蓝耳病病毒(PRRSV)的双色荧光定量RT-PCR方法。本研究根据SCFV和PRRSV基因序列设计特异性的引物和不同荧光标记的TaqMan荧光探针,通过优化反应的体系和扩增条件,建立了能够检测食源性动物组织中SCFV和PRRSV的双重双色荧光定量PCR的方法。其检测下限为1×102拷贝/μL,而且与其他一些猪病病毒无交叉反应,具有良好的特异性。该方法重复性和稳定性试验表明其组内和组间的变异系数最高分别为4.2和4.5。对比试验表明,该方法对CSFV和PRRSV检验的敏感性为常规RT-PCR方法的200倍;该方法的建立为食源性动物组织中CSFV和PRRSV提供了有效手段,该方法特异性和敏感性较好,能够应用于临床检测。     

猪脑心肌炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二重RT-PCR检测方法的建立

根据猪脑心肌炎病毒(EMCV)3D基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因序列设计合成了两对特异性引物,经过PCR反应条件的优化,建立了EMCV和PRRSV二重RT-PCR方法,其PCR产物大小分别为286 bp和390 bp,并具有EMCV和PRRSV特征序列。该方法对EMCV和PRRSV的最低检测量分别为10×TC ID50和1×TC ID50;而对乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒的PCR检测结果均为阴性;20份临床发病仔猪样品检测结果为PRRSV阳性者15份,EMCV阳性者3份,证明我国存在EMCV感染。该方法敏感、特异,可用于EMCV和PRRSV感染的检测。     

基于多重PCR的寡核苷酸基因芯片检测猪瘟病毒,猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒及猪圆环病毒1型和2型

为了建立一种可同时检测区分猪瘟病毒(CSFV),猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的寡核苷酸基因芯片方法,本研究针对每种病毒设计了4条～6条寡核苷酸探针,检测低限为1.6×104PCV-2拷贝数/μL,1.6×104CSFV拷贝数/μL,1.6×105PRRSV拷贝数/μL,比琼脂糖凝胶灵敏约10倍。利用建立的寡核苷酸基因芯片方法对76个仔猪样本进行了检测,检出了3种病毒的存在,其中25个样本(32.9%)同时感染了2种以上病毒。结果表明寡核苷酸基因芯片检测是一种快速、灵敏和高效的猪只混合感染病毒的病原学诊断方法。     

欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-PCR检测方法的建立

根据欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因序列,设计E1和E6 2套PCR引物和TaqMan荧光探针,建立E1和E6荧光RT-PCR方法,用于检测PRRSV。反应条件优化后,用10倍倍比稀释的质粒DNA、cDNA进行PCR扩增以检测其灵敏度,同时对猪瘟(CSFV)、猪伪狂犬(PRV)等7种病毒进行特异性检测。结果显示,建立的E1和E6荧光RT-PCR可以检出欧洲型PRRSV,敏感性依次为616和216个拷贝的PRRSV重组质粒DNA,而CSFV等非PRRSV均为阴性。建立的E1、E6荧光RT-PCR具有快速、灵敏、准确、低污染等优点,可作为检测欧洲型PRRSV的技术储备。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和牛病毒性腹泻病毒双重RT-PCR检测方法的建立

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5'端非编码区基因序列,设计合成了1对特异性引物,参考本实验室针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白设计的引物,经过PCR反应条件的优化,建立了BVDV和PRRSV双重RT-PCR的检测方法。对于PRRSV和BVDV的cDNA最低检测量分别为3.8×10-4 ng和7×10-4 ng,对于猪瘟病毒(CFSV)、脑心肌炎病毒(EMCV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的PCR扩增结果均为阴性;用该方法对江苏省不同地区采集的75份仔猪的肺脏、脾脏和淋巴结等病料进行了检测,结果PRRSV有55份阳性,BVDV有14份阳性,PRRSV和BVDV混合感染的有12份,与PRRSV和BVDV单一RT-PCR的检测结果符合率分别为89.3%和92%。证明建立的双重RT-PCR检测方法可用于临床样品中BVDV和PRRSV的检测。     

检测CSFV、JEV、PRRSV三种RNA病毒多重RT-PCR方法的建立

猪瘟病毒(CSFV)、流行性乙型脑炎病毒(JEV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是引起严重的种猪繁殖障碍的病原,而且经常混合感染,及时准确诊断是防治的前提。根据GenBank发表序列选取3对引物建立检测CSFV、JEV和PRRSV病毒的多重RT-PCR方法,扩增产物分别为508 bp、380 bp、263 bp。经与IDEXX商品化的检测CSW抗原试剂盒比较,二者的符合率为96.7%;扩增JEV和PRRSV PCR产物分别经EcoR V和Sau3A I酶切得到预期的片段。建立的多重RT-PCR检测JEV、PRRSV和CSFV敏感度分别为12.5个TCID_(50)、10个TCID_(50)和10~(-3)ng总RNA。结果表明该多重RT-PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于临床三种病毒核酸的检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）北美型毒株和欧洲型毒株N蛋白基因保守序列,设计1对特异性引物和1条探针,以ABI公司PRRSV RNA为标准品,优化了PRRSV实时荧光定量RT-PCR检测方法,25μL反应体系引物prrsv-f/prrsv-r（20μmol/L）各0.5μL,探针prrsv-p（10μmol/L）0.5μL为反应最佳工作浓度,标准曲线Ct值和模板启始浓度的log值之间具有良好的线性相关性。特异性、敏感性和重复性检测结果显示,该方法能特异的检测PRRSV北美型毒株和欧洲型毒株,与其他主要猪病病原检测无交叉反应;针对PRRSV RNA标准品检测,灵敏度可以达到10拷贝;重复性检测Ct值变异系数为0.74%～1.52%。用建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法,对40份临床样品检测,与商品化试剂盒检测结果完全一致。     

快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒胶体金免疫层析方法的建立

为建立一种快速、简便、灵敏的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的胶体金免疫层析方法(GICA),本研究采用柠檬酸三钠还原法制备了胶体金颗粒,标记抗PRRSVN蛋白的单克隆抗体(MAb) 2D7制备免疫检测探针,将抗PRRSVN蛋白的MAb 1G7和羊抗鼠IgG抗体印迹在硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质控线,经条件优化,组装成胶体金免疫层析试纸条.本研究制备的PRRSV胶体金试纸条的最低检测限度为103.0 TCID50/mL;在特异性试验中,试纸条检测PRRSV呈阳性,其它主要猪病病原均为阴性;不同批次试纸条重复检测,结果无差异;对现地猪场送检的150份病料进行PRRSV病原检测,与RT-PCR相比较,试纸条的特异性和敏感性分别为98.13％和88.37％.两种方法的一致性Kappa值为0.882.建立的PRRSV抗原胶体金免疫层析检测方法具有良好的的敏感性、特异性、重复性及现地应用性.该试纸条的研制为PRRS的快速诊断及免疫预防提供了技术手段.     

非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的非洲猪瘟病毒(ASFV)P72基因序列,设计了一对特异性引物和探针,使用含有选定检测序列的重组质粒标准品绘制标准曲线,建立了非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法。结果表明:该方法的敏感性可达100个拷贝值,具有良好的敏感性和重复性。     

用荧光定量RT-PCR方法检测猪瘟病毒

为了建立能特异检测不同基因型猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV),同时又能区分其他瘟病毒的基因检测方法,本实验针对CSFV基因组5′端非编码区设计并合成了简并引物和TaqMan探针,在优化反应条件的基础上,成功地建立了特异检测CSFV的荧光定量RT-PCR检测方法。再以已知滴度的CSFV石门株血毒总RNA反转录产物建立标准品,该标准品可以用于定量临床样品中的CSFV滴度,所建立的荧光定量PCR方法可以灵敏地检测出10~(-0.82)个TCID_(50)病毒含量。最后用建立的方法对108份临床样品进行检测并同时进行病毒分离,荧光定量PCR方法检测出73份阳性样品且与病毒分离的符合率为100%,而常规RT-PCR只检测出54份阳性样品,表明本荧光定量RT-PCR法在检测猪瘟病料上具有潜在的应用价值。     

捷申病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立同时检测猪捷申病毒(PTV)、猪瘟病毒(csFv)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRSV)的多重RT-PCR (mRT-PCR)检测方法,本研究以PRRSV ORF6基因、CSFV Ems基因和PTV 5＇-UTR基因为对象,建立检测3种病毒的mRT-PCR方法.特异性试验表明,该方法可以特异扩增3种病毒的基因,对大肠杆菌、猪圆环病毒Ⅱ型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒和猪流感病毒呈阴性反应;敏感性试验表明,PRRSV、CSFV和PTV的最低核酸检出量分别为7.11×102拷贝、7.81×103拷贝和8.43×102拷贝,略低于单一RT-PCR敏感性;应用该方法对69份送检样品进行检测,其中PRRSV、CSFV和PTV单纯感染检出率分别为28.99％、27.54％和56.52％,PRRSV和CSFV混合感染检出率为4.35％,PRRSV和PTV的混合感染检出率为11.59％,CSFV和PTV的混合感染检出率为13.04％,3种病毒的混合感染检出率为8.70％,与单一RT-PCR检测结果符合率为98.6％.本研究建立的检测方法快速简便,可以用于疾病的初步筛选,对临床早期诊断和流行病学调查具有重要意义.     

Development of a ladder-shape melting temperature isothermal amplification (LMTIA) assay for detection of African swine fever virus (ASFV)

BackgroundDue to the unavailability of an effective vaccine or antiviral drug against the African swine fever virus (ASFV), rapid diagnosis methods are needed to prevent highly contagious African swine fever.ObjectivesThe objective of this study was to establish the ladder-shape melting temperature isothermal amplification (LMTIA) assay for the detection of ASFV.MethodsLMTIA primers were designed with the p72 gene of ASFV as the target, and plasmid pUC57 was used to clone the gene. The LMTIA reaction system was optimized with the plasmid as the positive control, and the performance of the LMTIA assay was compared with that of the commercial real-time polymerase chain reaction (PCR) kit in terms of sensitivity and detection rate using 200 serum samples.ResultsOur results showed that the LMTIA assay could detect the 10⁴ dilution of DNA extracted from the positive reference serum sample, which was the same as that of the commercial real-time PCR kit. The coincidence rate between the two assays was 100%.ConclusionsThe LMTIA assay had high sensitivity, good detection, and simple operation. Thus, it is suitable for facilitating preliminary and cost-effective surveillance for the prevention and control of ASFV.