猪瘟病毒云南毒株E2基因片段序列测定及分析

用RT－nPCR方法，选择猪瘟病毒2000年云南部分地方流行毒株E2基因主要保护性抗原决定簇编码区片段进行扩增和cDNA序列分析，并与中国标准强毒石门株进行比较。结果显示，云南地方毒株之间核苷酸及氨基酸序列同源性均大于90％；但与中国标准强毒石门株差异较大，其核苷酸及氨基酸同源性均小于80％。     

广西猪瘟流行毒株E2基因的序列分析

对从广西南宁和柳州分离的2株猪瘟病毒E2基因进行了测序。应用DNAstar序列分析软件对所测2个毒株GXNN、GXLZ的E2基因序列与猪瘟兔化弱毒株和石门(Shimen)株进行了比较分析。结果显示，GXNN、GXLZ株与猪瘟兔化弱毒株核苷酸序列的同源性分别为82．1％和82．6％，推导氨基酸序列的同源性分别为87．9％和88．7％；GXNN、GXLZ株与Shimen株核苷酸序列的同源性分别为83．6％和84．0％，推导氨基酸序列的同源性分别为89．3％和90．1％。GXNN、GXLZ株与猪瘟兔化弱毒株和Shimen株的核苷酸序列和氨基酸序列都有明显差异。     

猪瘟病毒国内分离株(HL-LY)E2基因的克隆及序列分析

用猪肾细胞（pK-15)繁殖猪瘟病毒（CSFV）分离株HL－LY，根据基因库已发表的CSFV E2基因序列，设计并合成一对引物，以CSFV总RNA为模板，通过RT－PCR技术扩增出约1.1kb的片段，即E2基因。将RT－PCR产物克隆到pMD18-T载体上，构建了重组质粒T－E2，经酶切、PCR鉴定和序列测定，表明均已成功获得了CSFV E2基因的重组体T－E2。将该测序结果与国内几个毒株SHIMEN，C，C－V－LZ,GS-LT,GS-LX德育了列同源性比较，核苷酸同源性分别为96.59%,96.005,88.495,78.24%,77.82%；氨基酸同源性分别为99.46%,98.39%,93.54%,90.70%,90.44%。表明该毒株与国内标准毒株SHIMEN株和C株具有较高的同源性。     

4株猪瘟流行野毒株病毒结构蛋白E2基因的核苷酸序列分析

应用RT－PCR和nPCR扩增由4株甘肃省近期（1997－1998）猪瘟流行野毒株的E2基因，将其克隆到pGEM-TEasy载体上，经转化、筛选、鉴定后，测定核苷核序列，4株流行毒株的E2基因核苷酸序列同源性为89．2％－99．7％，相应的氨基酸序列同源性为93．8％－99．0％，这4株流行毒株；与C－株（疫苗种毒）E2基因的核苷酸序列同源性为82．2％－84．3％，相应的氨基酸序列的同源性为87．9％－90．2％，表明近期猪猪瘟流行毒株与C－株的gp55蛋白之间存在一定的差异。     

猪瘟病毒广西流行毒株E0基因的克隆与分析

应用RT-PCR方法对猪瘟病毒E0基因进行扩增、克隆及测序,用DNA Star分析软件对6株毒株与猪瘟兔化弱毒苗(HCLV)、石门(Shimen)株、Paderborn株、GXWZ02株的相应片段进行比较分析,构建了CSFV遗传进化树。序列分析表明,广西流行株与HCLV株、Shimen株、Paderborn株、GXWZ02株之间核苷酸的同源性分别为80.8%~81.5%、82.8%~83.3%、93.1%~94.2%、93.7%~94.2%,推导的氨基酸同源性分别为88.3%~89.7%、89.7%~91.1%、96.2%~97.7%、97.7%~99.1%;6株广西CSFV流行毒株与国内外已发表的14株病毒相应序列进行比较,构建遗传进化树,结果表明所比较的20株毒株分为2个基因群,广西流行毒株均属于基因群Ⅱ。本研究成功地对广西流行猪瘟病毒株的E0基因进行了测序分析,表明近年来广西流行毒株未发生较大的变异,但病毒株有远离疫苗株发展的趋势。     

猪瘟病毒Erns基因的克隆与序列分析

为了解山东地区猪瘟病毒的变异情况,将6份经RT-PCR方法鉴定为猪瘟病毒(CSFV)阳性的山东地区患病猪的病料接种PK-15细胞,分离得到6株猪瘟病毒.对该6株猪瘟病毒的Erns基因主要抗原编码区序列进行了RT-PCR扩增、克隆、测序,并经DNA Star软件对测序结果与HCLV疫苗株、Shimei株及Alfort株E...     

猪瘟野毒E2基因同源性比较

以人工感染发病猪的脾为材料提取总RNA，根据已报道的猪瘟病毒基因组序列，设计合成了2对引物，以总RNA为模板，利用反转录聚合酶链式反应（RT－PCR）、套组聚合酶链式反应（nPCR)及测序技术，对流行于我国甘肃省、陕西省、宁夏和广西自治区的5株野毒株的主要外膜糖蛋白E2基因的核苷酸序列进行了测定，用DNAstar软件比较分析了5株野毒之间及其与猪瘟兔化弱毒株（C－ST株）E2基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性。结果发现，5株野毒与C－ST株核苷酸序列的同源性为81．7％－83．1％，氨基酸同源性为87．3％－88．6％，表明它们之间存在较大的差异；但5株野毒之间核苷酸序列的同源性高达98．8％－99．3％，氨基酸同源性为96．6％－99．2％，表明它们之间的差异较小。     

猪瘟病毒E2基因的扩增及序列分析

本研究利用RT—PCR技术，对流行于国内部分地区的9株猪瘟病毒（CSFV）E2基因进行扩增，与C-株等4株参考毒株做了同源性比较，绘制了遗传进化关系发生树，结果表明，所测序列共由442个氮基酸残基组成。可将13株CSFV分为两个组群，其E2基因间的核苷酸序列同源性为81．9％～99．7％，所推导氨基酸序列同源性为88．2％～99．5％，其中9株CSFVE2基因的长度均为1324bp，编码的氨基酸序列均包括完整信号肽序列和跨膜区序列，9株流行毒株与C-株之间核苷酸序列同源性为81．9％～95．3％。所推导氨基酸序列同源性为88．2％～95．5％。说明近期流行毒株的变异呈现一定的多样性，并且多数毒株已向远离疫菌株方向变异。     

广东省猪瘟流行野毒E2基因的扩增及其序列分析

运用RT-PCR技术对3株广东省近期流行的猪瘟野毒的E2基因进行了扩增,并进行核苷酸序列分析,同时与国内外参考毒株的抗原序列进行了比对分析,绘制系统发育进化树。结果表明,3株流行毒株E2基因间核苷酸序列的相似性为81.9%～90.9%,所推导氨基酸序列相似性为56.6%～77.4%;与石门株之间核苷酸序列的相似性为82.3%～93%,所推导氨基酸序列相似性为57%～84.5%。经系统发育关系分析,1株属于基因1群(group1),2株属于基因2群(group2),提示近期猪瘟流行毒株的变异呈现一定的多样性。     

中国猪瘟兔化弱毒株（C-株）兔脾组织毒主要保护性抗原E2（gp55）基因序列分析

利用反转录（RT）及套式PCR（N-PCR）方法扩增了中国猪瘟兔化弱毒株（C-株）兔脾组织毒主要保护性抗原E2（gp55）基因，成功地将其克隆并测定了核苷酸序列，与国内外已发表的猪瘟病毒（HCV）E2基因序列比较的结果是C-株兔脾毒与C-株细胞（SK6）毒、C-株疫苗（犊牛睾丸细胞，HCLV-C）毒、HCV-SM株（石门）毒、Brescia株（荷兰）毒、Alfort株（德国）毒的E2核苷酸序列同源性分别为98.87％、98.34％、94.58％、91.00％、80.78％；氨基酸同源性分别为98.95％、97.37％、94.22％、91.60％、89.23％。对C-株兔脾毒与C-株细胞毒、经典强毒及国内流行野毒E2上的A、B、C三个中和性抗原区的氨基酸组成进行了比较，其结果为C-株兔脾毒与C-株细胞毒的差异很小甚至没有差异，而与流行野毒及经典强毒在B、C区有较大的差异。我国经典强毒石门毒与国内80年代和90年代流行毒之间有明显的差异，表明我国猪瘟流行毒株发生了变化。     

实验室人工感染诱发猪瘟野毒垂直传播

利用2头人工感染中等毒力猪瘟野毒耐过猪进行配种,诱发了猪瘟野毒垂直传播.带毒母猪于带毒后171 d产下9头仔猪,其中3头为死胎,6头为木乃伊.直接免疫荧光抗体试验和RT-PCR检测,9头均为阳性.测序结果表明,3头测序仔猪中,2头仔猪所分离病毒E2基因主要抗原编码区序列与公猪所接种病毒的一致;另1头仔猪所分离病毒E2基因主要抗原编码区序列与公猪所接种病毒的同源性高于与母猪所接种病毒的同源性.母猪在与公猪配种前后,其所分离病毒E2基因主要抗原编码区序列发生了变化,配种后与公猪所分离病毒的一致,说明猪瘟病毒在猪体内的繁殖存在一定的优势选择现象.     

RT-PCR检测猪瘟病毒方法的建立与应用

建立RT PCR检测猪瘟病毒的方法。根据已发表的猪瘟病毒E2基因 (囊膜糖蛋白gP55基因 )序列 ,设计合成了一对特异性引物 ,扩增片段的大小为 50 7bp ,用RT PCR技术对石门系标准株和 1 0株分离株进行检测。结果这对引物对标准株和 1 0株分离株均能扩增出与预期大小相符 50 7bpRT PCR产物 ,而对其他 6种猪病病原核酸的扩增结果为阴性。该RT PCR可检出 1 0 0pg的猪瘟病毒RNA模板 ,对人工感染猪不同组织样品进行检测 ,结果对白细胞抽提的核酸样品检出率最高为 1 0 0 % (2 4 / 2 4 ) ,其次为扁桃体、脾、肾 ,检出率为 83 3 % (2 0 / 2 4 ) ,再者为淋巴结 ,检出率为66 7% (1 6/ 2 4 )。对送检的 1 9份疑似猪瘟的病死猪病料组织进行RT PCR检测 ,结果有 1 6份样品为猪瘟病毒阳性。兔体交叉反应试验结果RT PCR阳性的 1 6份病料中 ,有 1 4份样品被判为含有猪瘟病毒 ,其他病料兔体交叉反应试验结果全为阴性     

达康灭毒灵对猪瘟病毒的杀灭试验

采用直接荧光法进行了达康灭毒灵对猪瘟病毒的杀灭效果试验.分别将有效氯浓度为100 mg/L和50 mg/L的达康灭毒灵消毒液与含有104 FA-TCID50猪瘟病毒Thiverval株病毒液的混合物于20 ℃水浴作用10 min和20 min,均可以完全将病毒杀灭.     

猪瘟淋脾毒(耐热保护剂)活疫苗的热稳定性研究

通过对3种不同配方的冻干保护剂和冻干曲线与猪瘟兔化弱毒相溶性的比较研究,成功研制了适用于猪瘟淋脾毒活疫苗的耐热保护剂.用这种保护剂生产的该疫苗经37 ℃保存10 d的耐老化试验及在2～8 ℃保存12个月后仍然符合产品质量标准的要求.经4 770余头份疫苗的田间试验,证明该产品安全、有效,且便于运输和使用,显示出良好的热稳定性能.     

猪瘟淋脾毒耐热保护剂活疫苗的中试生产及区域试验

按照拟定的猪瘟淋脾毒耐热保护剂活疫苗制造工艺在辽宁益康生物药品厂进行了5批该疫苗的中试生产,计15万头份,检验全部合格.在北京、河北等地选择9个猪场进行区域试验,共免疫3个品种约3万余头猪,均安全、未显现任何不良反应,跟踪观察,免疫过的猪未发生猪瘟,表明该疫苗安全有效.     

荧光定量RT-PCR方法与兔体定型热试验对于检测猪瘟兔化弱毒疫苗的平行关系

为探讨荧光定量RT-PCR技术与传统兔体定型热试验对于检测猪瘟兔化弱毒疫苗的平行关系,本研究采用荧光定量RT-PCR方法与兔体定型热试验对5份猪瘟兔化弱毒细胞苗成品和6份半成品样品进行平行检测.结果表明,两种检测方法存在正相关性,最低105个病毒拷贝可以使家兔产生定型热反应,最低103个病毒拷贝可以使家兔产生轻热反应.荧光定量RT-PCR检测方法的检测过程仅需3.5h,大大缩短了猪瘟疫苗的检测时间,该方法可以补充传统的兔体定型热反应用于猪瘟兔化弱毒疫苗半成品与成品的检验.     

狂犬病鼠源野毒M株核蛋白基因的克隆及序列分析

从感染狂犬病的鼠脑中快速提取细胞总RNA，用RT—PCR方法得到编码核蛋白完整结构基因的cDNA，进一步将此基因克隆入pGEM—T中，进行核苷酸序列的测定，并推导出氨基酸序列，将这一序列与国内外已发表的9株狂犬病病毒的NP全基因进行比较分析。结果表明狂犬病鼠源野毒M株与上述9株的同源性在71．0％～99、8％之间，氨基酸同源性在77．6％～99．6％之间，M株与CVS株无论核苷酸序列还是氨基酸序列同源性都最高，分别为99．8％和99．6％，而与CTN珠的核苷酸序列同源性较低，与Mokola株的核苷酸序列以及氨基酸序列同源性都最低，分别为71．0％和77．6％。本研究为进行狂犬病病毒的分子流行病学调查和研制狂犬病基因工程苗提供了理论依据。     

山羊关节炎-脑炎病毒甘肃株env基因的克隆和序列分析

本试验参考GenBank上发表的CAEV-63株的env基因核苷酸序列设计一对引物，以CAEV甘肃株前病毒DNA为模板，PCR扩增产物约2．9kb，与预期的目的片段大小一致。回收目的基因片段并将其克隆到pMD18-T载体上，经PCR及酶切鉴定阳性的重组质粒测序，结果表明所扩增2893个核苷酸片段含有CAEV囊膜基因的全序列，编码964个氨基酸。核苷酸和氨基酸序列分析显示，CAEV甘肃株env基因与CAEV-63美国株的env基固核苷酸和氨基酸的同源性分别为99．0％和98．1％。     

伪狂犬病病毒Bartha-K61株UL49基因的克隆和序列分析

根据已经发表的伪狂犬病病毒(PRV)国内Ea株UL49基因序列,设计并合成了1对引物,通过PCR方法扩增到了PRV Bartha-K61株UL49基因的编码区,并克隆到pMD18-T载体中.重组质粒pMD-UL49经XhoI酶切和PCR鉴定后,进行了序列测定和分析.结果表明,重组质粒pMD-UL49含有PRV Bartha-K61株UL49基因的编码区.同源性分析显示,PRV Bartha-K61株UL49基因序列与国外Kaplan株、国内Ea株相应基因的核苷酸同源性分别为98.9 %和94.1 %,推导的氨基酸序列同源性分别为96.7 %和87.2 %.     

猪瘟淋脾毒耐热保护剂活疫苗保存期的测定及免疫保护试验

对添加耐热保护剂的猪瘟淋脾毒活疫苗进行保存期的测定和保存后的免疫保护试验.结果表明,研制的猪瘟淋脾毒耐热保护剂活疫苗在2～8 ℃条件下保存24个月后免疫猪,能100%抵抗猪瘟石门系强毒的攻击.