五指山猪SLA-DQA和SLA-DQB基因SNP检测及生物信息学分析

为研究五指山猪SLA-DQA和SLA-DQB基因,获得基因序列并分析基因结构和相关遗传变异,试验采用PCR扩增猪SLA-DQA和SLA-DQB基因组序列,通过DNA测序寻找基因中的SNP位点。结果显示:在猪SLA-DQA基因组中共发现6处突变位点,分别位于该基因的启动子区、第1内含子、第2内含子、第3内含子和第5外显子中;在猪SLA-DQB基因组中共发现4处突变位点,分别位于该基因第1外显子和第5外显子中。本研究成功获得五指山猪SLA-DQA和SLADQB基因序列信息,为下一步五指山猪SLA-DQA和SLA-DQB基因的功能研究奠定基础。     

五指山猪FUT1基因SNP检测及生物信息学分析

为获得五指山猪FUT1基因序列并分析其基因结构,检测FUT1基因中的单核苷酸多态性(SNP)位点在五指山猪群体中的分布情况,本试验利用PCR扩增猪FUT1基因组序列,通过基因测序寻找该基因中的SNP位点,使用PCR-RFLP方法对120头五指山猪进行了FUT1基因型检测,并运用生物信息学方法对FUT1基因序列进行分析。在猪FUT1基因组中共发现两个单碱基突变,分别位于编码区(A+307G)和3'非翻译区(A+1856C);在FUT1基因A+307G突变位点上,五指山猪均为GG基因型;此外,FUT1基因启动子区域和第2外显子处存在CpG岛。本研究成功获得五指山猪FUT1基因序列信息,为下一步五指山猪FUT1基因的功能研究奠定基础。     

海南五指山猪Myf5基因克隆与序列分析

为了研究克隆五指山猪Myf5(myogenic factor 5,Myf5)基因,获得基因序列并分析基因结构及相关遗传变异,试验采用PCR扩增五指山猪Myf5基因组序列,通过克隆测序寻找基因中的突变位点。结果表明:在五指山猪Myf5基因组中共发现3处突变位点,分别位于第1外显子(C+121G,C+288G)和第1内含子(C+1 204G),生物信息学分析发现,五指山猪Myf5基因启动子区域存在一些潜在的转录因子结合位点,例如Sp1、GATA-1、C/EBPb、CdxA、SRY、Nkx-2和AML-1a等。     

五指山猪FSHβ基因克隆测序及生物信息学分析

为了克隆五指山猪的促卵泡素(follicle-stimulating hormone,FSHβ)基因,获得该基因序列并分析基因结构和相关遗传变异,试验采用PCR扩增FSHβ基因组序列,通过克隆测序寻找基因中的突变位点,采用PCR产物直接电泳法检测FSHβ基因位点的多态性。结果表明:在猪FSHβ基因组中共发现6处单碱基突变位点,分别位于第1内含子(A-757G、A-645G、A-531G)和第2内含子(C+1 431T、A+1 434G、C+1 502T);多态性分析发现,在五指山猪中存在AA和AB两种基因型,其中A等位基因频率为0.96,B等位基因频率为0.04。     

猪FUT2基因密码子使用偏好性分析及优化

为了揭示猪α-(1,2)岩藻糖转移酶2(FUT2)基因密码子使用特性并提高其在外源宿主内的表达量,本研究综合运用EMBOSS Explorer网站和CodonW软件包分析了猪FUT2基因的密码子使用偏好性的相关参数,并与3种模式生物(大肠杆菌、酵母菌和果蝇)基因组密码子使用模式进行比较,最后参照与之最为相近的模式生物基因组密码子使用方式,利用JCat和OPTIMIZER两个密码子优化网站对猪FUT2基因密码子进行优化。结果显示,猪FUT2基因表达水平不高,存在24种偏好密码子,且这24种偏好密码子中有23种以G/C结尾;猪FUT2基因与果蝇基因组密码子使用模式的差异小于大肠杆菌和酵母基因组,表明果蝇更适合猪FUT2基因的外源表达;根据果蝇基因组密码子使用模式优化猪FUT2基因密码子,优化后其适应指数有了明显提高,而整体GC含量没有明显变化,说明在理论上猪FUT2基因优化成功。本研究从翻译水平上揭示了猪FUT2基因的密码子使用特性,为其在遗传改良中选择最佳外源表达系统及提高其在宿主细胞内的表达水平提供一定的理论依据。     

猪FUT2基因密码子使用偏好性分析及优化

为了揭示猪α-（1,2）岩藻糖转移酶2（FUT2）基因密码子使用特性并提高其在外源宿主内的表达量,本研究综合运用EMBOSS Explorer网站和CodonW软件包分析了猪FUT2基因的密码子使用偏好性的相关参数,并与3种模式生物（大肠杆菌、酵母菌和果蝇）基因组密码子使用模式进行比较,最后参照与之最为相近的模式生物基因组密码子使用方式,利用JCat和OPTIMIZER两个密码子优化网站对猪FUT2基因密码子进行优化。结果显示,猪FUT2基因表达水平不高,存在24种偏好密码子,且这24种偏好密码子中有23种以G/C结尾;猪FUT2基因与果蝇基因组密码子使用模式的差异小于大肠杆菌和酵母基因组,表明果蝇更适合猪FUT2基因的外源表达;根据果蝇基因组密码子使用模式优化猪FUT2基因密码子,优化后其适应指数有了明显提高,而整体GC含量没有明显变化,说明在理论上猪FUT2基因优化成功。本研究从翻译水平上揭示了猪FUT2基因的密码子使用特性,为其在遗传改良中选择最佳外源表达系统及提高其在宿主细胞内的表达水平提供一定的理论依据。     

海南五指山猪Myf5与MyoD基因多态性分析

为研究海南五指山猪Myf5和MyoD基因的多态性分布情况,本试验通过PCR-RFLP方法对80头海南五指山猪进行了Myf5和MyoD基因型检测,并运用生物信息学方法对这两个基因的序列进行分析.结果发现,在Myf5基因第1外显子的HhaⅠ-RFLP位点上,五指山猪以CC和CG基因型为主;在Myf5基因第1外显子的Hsp92Ⅱ-RFLP位点上,五指山猪以AA基因型为主;在MyoD基因第1内含子的DdeⅠ-RFLP位点上,等位基因A在五指山猪中是优势等位基因.此外,Myf5和MyoD基因启动子区域和第1外显子处存在CpG岛.本研究得到海南五指山猪Myf5和MyoD基因的序列信息,为下一步五指山猪Myf5和MyoD基因的功能研究奠定基础.     

猪MSTN基因的多态性和生长性状关联分析

基于肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因结构及功能研究报道,将其作为猪生长发育性状的候选基因进行多态性检测与关联分析,旨在为猪分子遗传标记提供依据。本研究以长白猪、大白猪、杜长大、通城猪、莱芜猪、五指山猪6个不同猪种基因组DNA为模板,通过克隆测序鉴定MSTN基因启动子区、第1内含子区、第2内含子区、第1外显子区、第2外显子区及3′UTR区SNPs位点;以长白猪和杜长大2个试验猪群为材料,利用基质辅助激光解吸飞行时间质谱法对MSTN基因进行SNP分型。建立最小二乘法分析模型,利用SAS软件分析数据。结果表明:在6个猪种76个个体中,共筛选出16个SNPs,其中有4个位于启动子区,5个位于第1内含子,7个位于第2内含子,在外显子1、外显子2和3′UTR区域并未检测到SNP位点。对MSTN基因的4个SNPs位点(P1、P3、P4、P5;其中P1、P3、P4位于启动子区,P5位于内含子1区)的生长性状关联分析显示,P4和P5 2个位点的多态性与猪生长性状显著相关(P<0.05)。P4和P5 2个位点具有作为分子标记辅助猪育种的潜在应用价值。     

海南五指山猪TLR2基因克隆及生物信息学分析

为了探讨海南五指山猪TLR2基因的分子结构特征及相关遗传变异,为研究TLR2基因遗传变异与免疫疾病的关系打下基础,试验采用PCR技术对该基因组序列进行克隆、测序及相关生物信息学分析。结果表明:获得2 649 bp的五指山猪TLR2基因的DNA序列,其基因编码区全长2 358 bp,编码785个氨基酸;与Gen Bank中发布的普通猪TLR2基因序列相比,共发现9处突变,其中在编码区序列存在2处突变,属于有义突变;与普通猪、马、牛、绵羊、人、黑猩猩、猕猴、犬、小鼠、鸡、斑马鱼的氨基酸序列的一致性分别为99.7%、82.1%、81.4%、80.6%、78.4%、78.4%、77.8%、77.3%、68.2%、50.7%、40.4%;五指山猪TLR2编码的蛋白主要位于质膜,属于分泌性蛋白、亲水性蛋白和跨膜蛋白,有信号肽和5个糖基化修饰位点,存在较多的丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)磷酸化位点;不同物种TLR2基因在进化过程中具有较高的保守性。说明TLR2基因可作为今后研究海南五指山猪免疫疾病的重要指标之一。     

基于测序技术的海南地方猪TLR4基因多态性分析

为了了解海南地方猪TLR4基因的多态性,试验采用PCR技术对五指山猪、临高猪和屯昌猪的TLR4基因组序列进行了克隆、测序,应用DNAStar和BioEdit软件分析其序列,SMART、SOPMA、SWISS-MODEL在线软件分析TLR4蛋白的结构,并预测二级结构和三级结构。结果表明:获得的三个品种海南地方猪TLR4基因DNA序列全长均为10 435 bp,其中编码区长2 526 bp,编码841个氨基酸。三个品种猪TLR4基因序列种内比对时,五指山猪在种内有1个核苷酸位点存在多态性;屯昌猪在种内有6个核苷酸位点存在多态性,2处位于编码区;临高猪在种内有3个核苷酸位点存在多态性,1处位于编码区。三个品种猪TLR4基因序列种间比对时,有27个核苷酸位点存在多态性,其中2个为错义突变,导致氨基酸改变。三个品种猪的TLR4基因序列的同源性在99.8%～99.9%之间,高度保守。海南猪TLR4基因在7 209位点的G→T突变和7 781位点的G→A位点突变引起了TLR4蛋白二级结构和三级结构发生改变。说明海南地方猪TLR4基因存在多态性,并且其多态性引起的结构改变可能使TLR4基因功能发生变化。     

猪FUT2基因沉默对其所在通路基因表达及小肠上皮细胞E.coliF18黏附能力的影响

旨在细胞水平上进一步探讨FUT2基因的功能及其在猪小肠上皮细胞受到F18大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)侵染时的调控机制,为提高仔猪对F18大肠杆菌病抵抗力的分子选育提供理论基础。运用Real-time PCR方法检测分析FUT2基因在大肠杆菌F18ab、F18ac感染和脂多糖(LPS)诱导小肠上皮细胞前后的mRNA表达差异,并采用Western blotting方法检测大肠杆菌F18ab、F18ac感染小肠上皮细胞前后FUT2的蛋白表达差异;同时设计并构建猪FUT2基因慢病毒干扰载体,筛选并获得FUT2基因稳定沉默的小肠上皮细胞系,检测FUT2基因沉默对其所在球系列鞘糖脂生物合成通路其他关键基因(FUT1、ST3GAL1、HEXA、HEXB、B3GALNT1、NAGA)表达以及小肠上皮细胞E.coli F18黏附能力的影响。结果表明,在F18大肠杆菌感染和LPS诱导小肠上皮细胞后,FUT2基因的mRNA相对表达水平均极显著升高(P0.01),同时大肠杆菌感染后小肠上皮细胞的FUT2蛋白表达上升。此外,本研究成功构建FUT2基因慢病毒干扰载体,并获得FUT2基因稳定沉默的小肠上皮细胞系;FUT2基因沉默后,其所在的球系列鞘糖脂生物合成通路其他关键基因的表达都存在不同程度的下降,其中FUT1基因表达水平显著下调(P0.05),ST3GAL1、HEXA和HEXB基因表达水平极显著下调(P0.01),而B3GALNT1和NAGA基因表达水平未发生显著变化,同时FUT2基因沉默后F18大肠杆菌对小肠上皮细胞的黏附能力显著降低。结果显示,FUT2基因低表达可能不利于仔猪大肠杆菌受体的形成,以增强猪小肠上皮细胞抵抗E.coli F18感染的能力,本试验结果同时为球系列鞘糖脂生物合成通路在仔猪抗大肠杆菌感染过程中的作用机制研究提供一定的理论基础和依据。     

五指山猪和杜洛克猪全基因组选择信号差异分析

旨在探究五指山猪和杜洛克猪免疫和脂质代谢相关基因的选择信号差异。本研究从海南国家级五指山猪保种场采集30头4月龄健康(10公,20母)五指山猪的耳组织进行全基因组重测序(whole genome sequencing,WGS),从NCBI数据库下载29头杜洛克猪全基因组重测序数据(SRA：PRJNA378496);通过生物信息学方法分析59个样本WGS数据的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNPs),进行SNPs过滤,定位SNPs在基因组的位置,分析其结构特征和基因型频率,并注释对应基因的功能;使用XP-CLR方法筛选五指山猪基因组受到强烈选择的区域,分析两个品种相关通路基因的功能差异。结果表明,五指山猪平均每个样本共筛选到36 961 902个SNPs位点,内含子区域分布最多,平均每个样本16 729 364个,约占45.26%,编码区(起始、终止密码子)平均有2 073个SNPs;五指山猪受选择的基因组区域主要集中在免疫、代谢和神经功能相关通路;免疫反应通路中,9个基因(TGFBR2、IL26、IL15、BMPR2、TNFSF15、TNFSF4、TNFSF8、ACKR4、TNFRSF11B)功能区域SNPs位点在五指山猪中只存在一种突变纯合基因型,而在杜洛克猪大部分个体中存在3种基因型(野生纯合基因型、杂合子、突变纯合基因型),其中野生纯合基因型比例最高;脂类代谢通路中,关键调节基因IRS2、PRKG1、ADCY5的基因型频率与免疫反应基因类似。在五指山猪中突变纯合基因型比例为100%,在杜洛克猪中野生纯合基因型所占比例为48%~93%(14/29-27/29)。本研究筛选出与五指山猪免疫性状相关的候选基因9个、与脂类代谢相关的候选基因3个,发现五指山猪免疫、代谢和神经功能相关基因的受选择程度强于杜洛克猪,为揭示五指山猪特色性状形成的分子机制提供参考。     

东串猪FUT2基因CDS扩增、序列分析及组织表达谱检测

猪α-（1,2）岩藻糖转移酶2（FUT2）基因为鞘糖脂生物合成-球系列通路中的重要基因,可能在断奶仔猪抵抗大肠杆菌F18侵染过程中发挥着调控作用。为探究猪FUT2基因的序列结构及其生物学功能,试验采用PCR扩增得到地方猪品种东串猪FUT2基因的CDS全序列,进而预测和分析FUT2基因的蛋白质序列及其功能区域,同时对其在8头35日龄东串断奶仔猪11个组织中的表达水平进行检测与分析。结果显示,FUT2基因的CDS序列全长为1 023 bp,共编码340个氨基酸,FUT2蛋白为脂溶性的亲水蛋白,蛋白结构不稳定,该蛋白存在1个跨膜螺旋结构,但不存在信号肽,表明FUT2蛋白为膜蛋白;FUT2蛋白存在2个N-糖基化位点（185和305位氨基酸）,无O-糖基化位点,此外该蛋白还存在14个潜在的磷酸化位点,包括6个Ser、2个Thr和6个Tyr,对其功能区域进行分析发现,FUT2蛋白存在1个超级家族保守结构域：FUT1-FUT2-like（58-319位氨基酸）;系统进化树结果显示,猪与牛的亲缘关系相对较近,与人、黑猩猩、大鼠和小鼠等亲缘关系相对较远;FUT2基因在东串断奶仔猪11个组织中均有表达,在消化道和免疫组织中表达水平较高。试验结果推测FUT2基因在断奶仔猪抵抗大肠杆菌F18中可能具有一定的作用,且可能是通过合成岩藻糖转移酶间接发挥其抵抗大肠杆菌F18的作用。     

部分引进猪种α1-岩藻糖转移酶基因多态性研究

本研究采用PCR RFLP技术对4个引进猪种杜洛克、约克夏、长白猪和皮特兰共计122头猪的FUT1基因进行了多态性分析。结果表明：4个猪种在该FUT1基因座位存在多态性，但抗性基因型AA仅在杜洛克和皮特兰猪中分布。卡方检验结果表明，长白猪与皮特兰间FUT1基因基因型分布差异极显著，长白猪与杜洛克猪之间差异显著，约克夏与皮特兰间差异也显著。     

猪Lbx2基因的克隆、序列分析及表达

试验利用PCR扩增猪Lbx2基因组序列,通过克隆测序寻找基因中的突变位点,采用半定量RT-PCR分析猪不同组织中Lbx2基因的表达情况。结果显示,Lbx2基因在肝脏、肾脏和脾脏中微弱表达,在肌肉组织中不表达;通过比较不同物种氨基酸序列,结果发现猪Lbx2与牛、猩猩、犬进化关系较近;此外,在猪Lbx2基因组中发现5处突变位点,其中1个缺失突变(缺失11 bp)位于基因启动子区,另外4个单核苷酸突变分别位于第1外显子和内含子中。该试验结果为下一步Lbx2基因的功能研究奠定了基础。     

鸡HSP90AA1基因SNP检测及启动子区CpG岛的甲基化研究

试验旨在获得鸡热休克蛋白90α(HSP90AA1)基因序列并分析其基因结构和相关遗传变异,检测HSP90AA1基因启动子区CpG岛的甲基化状态,初步探索HSP90AA1基因在肌肉组织生长发育中的作用。以文昌鸡和北京油鸡为试验材料,利用PCR扩增鸡HSP90AA1基因组序列;通过基因测序寻找该基因中的单核苷酸多态性(SNP)位点;使用在线软件MethPrimer预测鸡HSP90AA1基因中CpG岛的位置;应用MassArray质谱法检测鸡胸肌中HSP90AA1基因启动子区CpG岛的甲基化水平,比较分析文昌鸡和北京油鸡HSP90AA1基因的甲基化差异。结果显示,在鸡HSP90AA1基因组中共发现7个SNPs位点,分别位于启动子区(A-189G,C-109T)、第1外显子(A+6G)、第2外显子(C+343T)、第2内含子(A+634G、A+836G)和第7内含子(A+3449G);鸡HSP90AA1基因包含10个外显子和9个内含子,其启动子区存在1个CpG岛,位于-1 802～-469bp处;在HSP90AA1基因启动子区共检测了42个CpG位点的甲基化水平,文昌鸡和北京油鸡中分别有9个(CpG_16.17.18、CpG_21.22.23、CpG_32.33和CpG_57)和4个CpG位点(CpG_1、CpG_5.6和CpG_57)在胸肌生长发育过程中发生甲基化改变。结果表明,文昌鸡与北京油鸡HSP90AA1基因序列信息和启动子区CpG岛的甲基化水平不同,这可能导致两种鸡对于应激反应具有不同的耐受程度。以上试验结果将为文昌鸡和北京油鸡生长发育规律、系统选育等方面的研究提供表观遗传学依据。     

鸡HSP90AA1基因SNP检测及启动子区CpG岛的甲基化研究

试验旨在获得鸡热休克蛋白90α(HSP90AA1)基因序列并分析其基因结构和相关遗传变异,检测HSP90AA1基因启动子区CpG岛的甲基化状态,初步探索HSP90AA1基因在肌肉组织生长发育中的作用。以文昌鸡和北京油鸡为试验材料,利用PCR扩增鸡HSP90AA1基因组序列;通过基因测序寻找该基因中的单核苷酸多态性(SNP)位点;使用在线软件MethPrimer预测鸡HSP90AA1基因中CpG岛的位置;应用MassArray质谱法检测鸡胸肌中HSP90AA1基因启动子区CpG岛的甲基化水平,比较分析文昌鸡和北京油鸡HSP90AA1基因的甲基化差异。结果显示,在鸡HSP90AA1基因组中共发现7个SNPs位点,分别位于启动子区(A-189G,C-109T)、第1外显子(A+6G)、第2外显子(C+343T)、第2内含子(A+634G、A+836G)和第7内含子(A+3449G);鸡HSP90AA1基因包含10个外显子和9个内含子,其启动子区存在1个CpG岛,位于-1 802～-469bp处;在HSP90AA1基因启动子区共检测了42个CpG位点的甲基化水平,文昌鸡和北京油鸡中分别有9个(CpG_16.17.18、CpG_21.22.23、CpG_32.33和CpG_57)和4个CpG位点(CpG_1、CpG_5.6和CpG_57)在胸肌生长发育过程中发生甲基化改变。结果表明,文昌鸡与北京油鸡HSP90AA1基因序列信息和启动子区CpG岛的甲基化水平不同,这可能导致两种鸡对于应激反应具有不同的耐受程度。以上试验结果将为文昌鸡和北京油鸡生长发育规律、系统选育等方面的研究提供表观遗传学依据。     

基于测序技术的海南地方猪TLR2基因多态性分析

为了解海南地方猪TLR2基因的多态性,本研究采用PCR法从五指山猪、临高猪和屯昌猪3种海南地方猪的血液中克隆Toll样受体2(TLR2)基因,并进行测序及序列分析。结果显示,3种海南地方猪TLR2基因的扩增长度均为2649bp,编码区长2358bp。3种猪TLR2基因序列的种内比对结果显示,五指山猪种内有7个核苷酸位点存在多态性,2处位于编码区;屯昌猪种内有5个核苷酸位点存在多态性,均在编码区外;临高猪种内有4个核苷酸位点存在多态性,1处位于编码区。种间比对结果显示3种猪有12个核苷酸位点存在多态性,其中3处为错义突变,导致氨基酸改变。同源性分析结果显示,3种猪的TLR2基因序列高度保守,同源性在99.6%~99.9%之间。蛋白质结构预测分析显示,海南猪TLR2基因在876、1454位点呈现的AG突变均引起了其蛋白质二级结构和三级结构的改变,提示可能存在TLR2功能的变化。本研究填补了海南地方猪TLR2基因多态性空白,为深入研究TLR2基因多态性与猪疫病易感性的关系提供基础研究资料。     

小型猪与梅山猪Prop1基因的比较分析

Prop1是一种新发现的参与早期胚胎垂体发育的特异性转录因子.在人和动物均已发现由于该基因突变而引起的综合性垂体功能障碍,进而影响生长和繁殖.小型猪与梅山猪比较,其繁殖力和生长性能差异显著,为了了解这些差异的遗传基础,本试验对五指山猪、藏猪和版纳猪3种小型猪的Prop1基因进行克隆测序,并与已知梅山猪的序列进行对比,结果为:五指山猪与藏猪外显子1第69位发生G-A碱基替换,编码同义氨基酸;藏猪外显子2第115位发生A-G碱基替换,编码终止密码子;藏猪与版纳猪外显子3第466位和第631位均发生C-T碱基替换,第466位藏猪编码同义氨基酸;第631位版纳猪编码丝氨酸(TCC),梅山猪编码脯氨酸(CCC),即2种猪的Prop1基因产物不同.在Prop1基因终止密码下游250左右有一个腺苷酸丰富区,五指山猪与藏猪有15个腺苷酸串联,版纳猪有12个.上述结果为进一步研究大猪和小型猪之间生产性能差异的遗传基础提供了新线索.     

五指山猪背最长肌和半腱肌DNA甲基化检测分析

DNA甲基化作为真核生物基因组重要的表观遗传学修饰,对生物体基因的表达有重要的调控作用。为了研究五指山猪肌肉组织基因组DNA的甲基化程度,试验利用MSAP技术,使用筛选的10对引物扩增,检测五指山猪背最长肌和半腱肌的甲基化程度。结果显示:1月龄、2月龄、4月龄五指山猪背最长肌的平均甲基化率分别是44.78%、41.58%、38.92%;1月龄、2月龄、4月龄五指山猪半腱肌的平均甲基化率分别是41.70%、39.39%、38.81%。研究结果为五指山猪生长发育规律、系统选育及矮小机制等方面的研究提供表观遗传学依据。