三种外检植物病毒的灭活处理

番茄环斑病毒（ＴｍＲＳＶ），烟草环斑病毒（ＴＲＳＶ），南芥菜花叶病毒（ＡｒＭＶ）的病汁液和ＰＥＧ粗提纯液，经适宜温度或甲醛处理，均丧失侵染性而有抗原性。ＴｍＲＳＶＰＥＧ粗提纯液经６０℃（水浴）处理１０分钟或２８℃７天，ＴＲＳＶ粗提纯液置２５℃一个月，Ａｒ－ＭＶ在４０℃７天条件下均可做为阳性对照的灭活处理的最佳方案。可保存抗原性在７～１２月以上。为了防止危险性检疫病毒的侵入，对入境种苗进行检疫，需建立快速、准确、标准化检疫程序，而在血清学快速诊断试验中，提供阳性对照，对提高判断准确率是必要的。因此，为了解决在诊断试剂中提供阳性对照但又不能使其检疫性病毒人为扩散这一重要问题，我们在研究三种外检病毒（ＴｍＲＳＶ，ＴＲＳＶ，ＡｒＭＶ）的检验技术的同时，又进行了一些灭活试验，用化学和物理方法钝化病毒，使其失去侵染性而保持抗原性，并应用于酶联诊断试剂盒中，本文报道了初步试验结果     

香石竹斑病毒的提纯及抗血清制备

选用缸豆黑种三尺作繁殖寄主,接种４周后采收病叶,采用聚乙二醇沉淀,差速离心和１０－４０％蔗糖梯度离心,得到提纯的香石竹环斑病毒,紫外吸收呈典型核蛋白吸民一,电镜下见到大量球状病毒粒体。采用多咱途径免疫家兔获得的抗血清,琼脂双测得效价为１：１６。     

番茄环斑病毒单克隆抗体细胞株的建立及检测方法的研究

用纯化的番茄环斑病毒（ＴｍＲＳＶ）免痊Ｂａｌｂ／ｃ小白鼠，取脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合。筛选出６株分泌ＴｍＲＳＶ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）杂交瘤细胞株。抗体免疫球旦白分属于１ｇＧ２ａ，ＩｇＧ３和１ｇＭ。用免疫电镜诱捕法检测，６个ＭｃＡｂ与加拿大分离物反应均为阳性，其中ＣＥ３，ＣＧ８，９Ｇ９不与西德分离物反应。属于１ｇＧ３的单抗具有与Ａ旦白结合的特性。     

香石竹环斑病毒的提纯及抗血清制备

选用豇豆黑种三尺作繁殖寄主,接种４周后采收病叶,采用聚乙二醇沉淀,差速离心和１０～４０％蔗糖梯度离心,得到提纯的香石竹环斑病毒,紫外吸收呈典型核蛋白吸收曲线,电镜下见到大量球状病毒粒体。采用多种途径免疫家兔获得的抗血清,琼脂双扩散测得效价为１∶１６     

葡萄的两种检疫性病毒的多重RT-PCR检测

 本研究利用多重RT-PCR技术,对葡萄的检疫性病毒中番茄环斑病毒(ToRSV)和烟草环斑病毒(TRSV)进行检测,并研究了反应体系中各个参数对多重RT-PCR的影响。结果表明:可以在同一反应体系中实现对ToRSV和TRSV的RT-PCR检测,但模板浓度、引物浓度、循环数等3个因素对检测结果的准确性有较大的影响,3个参数的增加都会导致非特异性扩增的增多,而dNTP以及Taq酶的浓度对实验结果并无较大影响。     

检测兰花病毒的斑点酶联法的建立

本文建立了齿兰环斑病毒（Odntoglossum ringspot virus,ORSV）和建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus,CyMV）两种兰花主要病毒的斑点酶联法检测技术（Dot-ELISA）。用Dot-ELISA对提纯病毒和田间病叶进行检测,结果表明;检测ORSV和CyMV提纯病毒的灵敏度分别为0.82μg/mL和0.244μg/mL;病叶汁液的稀释倍数分别为1280倍和2650倍。该方法具有操作简便、成本低等优点,适合于兰花生产中的病毒检测。     

南芥菜花叶病毒的几种PCR检测方法的建立和比较研究

 以进境种球中截获的带毒洋水仙和郁金香为试验材料,建立了ArMV的免疫捕获RT-PCR、巢式PCR和Real-time PCR方法,并比较了几种检测方法的灵敏度。DAS-ELISA的检测灵敏度较低,为1mg洋水仙或10mg郁金香带毒种球,而各种PCR方法的灵敏度可高于DAS-ELISA 100倍以上,其中Real-time PCR检测的灵敏度最高,可从20ng洋水仙或2μg郁金香的带毒种球中检出ArMV。鉴于DAS-ELISA灵敏度较低,建议在用ELISA初筛时,如样品OD₄₀₅值与阴性对照OD₄₀₅值之比在2.0左右时需要再用分子方法加以确证,以防漏检。     

侵染唐菖蒲和百合3种病毒的多重RT-PCR检测方法

本文针对侵染百合和唐菖蒲的南芥菜花叶病毒、百合无症病毒和菜豆黄花叶病毒,建立了同时检测3种病毒的多重RT-PCR检测方法.该方法根据上述3种病毒保守的衣壳蛋白基因序列,设计特异性引物,优化了反应条件.通过对9种不同寄主和6种病毒的检测,验证该检测方法具有很高的特异性、稳定性,其灵敏度为植物总RNA稀释101～102倍.特别是,该方法缩短了检测周期,适合于植物病毒快速检测工作的需要.     

单管多重RT-PCR同时检测大豆种子中三种检疫性植物病毒

我国大豆年进口量持续增长,快速、准确地检测进境大豆种子中可能携带的病原物是防止检疫性有害生物入境传播和扩散的有效手段。菜豆荚斑驳病毒(BPMV)、烟草环斑病毒(TRSV)和番茄环斑病毒(ToRSV)均是被大豆种子携带的检疫性有害生物。本研究建立了在单一PCR管中同时检测这3种检疫性植物病毒及大豆内源基因Bd-30K的多重RT-PCR方法。研究结果表明,所建立的多重RT-PCR方法具有较好的特异性和灵敏度,检测含BPMV、TRSV和ToRSV RNA的最低浓度分别为0.45、0.0093和0.004ng/μL,从大豆种子中同时检测3种病毒的最低RNA浓度为0.58ng/μL。     

电化学酶联免疫分析检测烟草花叶病毒和烟草环斑病毒

以邻苯二胺 (OPD)底物为例 ,用抗原直接包被法 (DAC -ELISA)同线性扫描极谱法 (LSV)相结合 ,检测烟草花叶病毒 (TMV)的提纯液 ,检出限可达 0 2 5ng/ml,TMV粗提液的最高稀释比为 1 :1 0 2 4 0 0 ;检测烟草环斑病毒 (TRSV)提纯液 ,检出限为 1 0ng/ml,粗提液的最高稀释比为 1 :1 0 0 0 0 ,该方法的灵敏度比DAC -ELISA光度法提高了 5倍以上     

从德国鼠尾草中检测出3种危险性病毒

对世博会来自德国的鼠尾草进行了目检、酶联实验、电镜观察及生物接种实验.初步确证鼠尾草携带番茄环斑病毒(ToRSV),南芥菜花叶病毒(ArMV)和烟草环斑病毒(TRSV).     

A蛋白碱性磷酸酯酶的标记及酶联测试

以戊二醛为交联剂,采用两步法将Ａ蛋白及碱性磷酸酯酶标记,获得的酶标记物可稀释１／２０００,酶联对香石竹斑驳病毒,马铃薯Ｘ病毒、南方菜豆花叶病毒,烟草环斑病毒的提纯制剂及病汁液检测,分别达到２０ｎｇ和稀释１０＾－２￣１０＾－５。而阴性对照维持在较低的水平。     

快速检测大豆疫霉菌的酶联免疫吸附技术研究

利用已经制备的大豆疫霉菌的抗血清，对大豆疫霉菌的纯培养和大豆病组织进行检测。结果表明：间接法（Ｉ－ＥＬＩＳＡ）和夹心法（ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ）都能较好地检测纯培养的大豆疫霉菌，但在检测病组织时，夹心ＥＬＩＳＡ的特异性较强，能够可靠地检测到大豆病组织内的病原菌     

南芥菜花叶病毒RT-PCR扩增产物胶体金层析和酶联检测方法的建立

南芥菜花叶病毒是我国进境植物检疫性有害生物,为建立快速灵敏的检疫检测方法,本研究用生物素标记一条引物,用荧光素(或地高辛)标记另一条引物,经RT-PCR扩增产生双标记的扩增产物,建立了PCR扩增产物的胶体金层析检测和ELISA检测方法。胶体金层析检测方法在15min即可获得检测结果,ELISA方法需20h,后者检测的灵敏度可比前者分别提高100倍和5000倍。所建立的2种方法都免去了普通PCR检测的溴化乙锭染色和电泳的过程。     

同步检测为害百合种球3种检疫性病毒的多重RT-PCR方法

 The multiplex RT-PCR approach was developed for simultaneous detections of Arabis mosaic virus(ArMV),Strawberry latent ringspot virus(SLRSV)and Lily symptomless virus(LSV)from the imported lily bulbs.The results indicated that good specificity and sensitivity for simultaneous detection were obtained.The ultimate of RNA detection with three viruses mixture was 305 pg.The ultimate of RNA detection with ArMV,SLRSV and LSV were 156.0,13.4 pg and 1.12 ng respectively.This approach has potential to be used in quarantine of imports and exports.     

烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv. tabaci)诊断试剂盒的制备及应用

 本研究通过筛选致病力强的烟草野火病菌株作为抗原,制备了烟草野火病菌特异性的抗血清,研制出SPA-ELISA、间接-ELISA 2种诊断试剂盒,使检测真正作到了简便、快速、灵敏、准确。同时,应用这2种诊断试剂盒对从田间及温室中采集的土壤、烟株根围、田间杂草、种子进行检测,明确了云南烟草野火病的初侵染源主要为种子和根围。     

Pelargonium flower-break and pelargonium line pattern viruses in the Netherlands; purification,antiserum preparation,serological identification,and detection in pelargonium by ELISA

Two viruses, detected frequently in the Netherlands in pelargonium, were identified by serology and test plant reactions. Antisera were prepared and an ELISA procedure was developed to detect the viruses in pelargonium.One of the viruses, PFBV-N, proved to be pelargonium flower-break virus. With the antiserum to PFBV-N, it could be detected reliably throughout the year inPelargonium zonale Springtime Irene.The other virus, PLPV-N, was serologically closely related to pelargonium line pattern virus (PLPV) and to pelargonium ring pattern virus (PRPV), as were an old virus isolate from Saturnus, collected in the Netherlands in 1971 (L128), and PLPV isolates from Yugoslavia (PLPV-Y) and Denmark (PLPV-D). There were only minor differences in host-plant reactions between the virus isolates. Based on these tests, PLPV and PRPV are considered as isolates of the same virus, for which, for practical reasons, the name pelargonium line pattern virus is proposed.PLPV could be reliably detected by ELISA inP. zonale Springtime Irene and Amanda throughout the year with only a few exceptions. InPelargonium peltatum Tavira, however, reslts were erratic due to uneven distribution of virus in the plant. Best results were obtained when petioles of fully expanded leaves were tested.